Ферментативный гидролиз крахмала. Сахаристые гидролизаты крахмала

Большинство промышленно важных ферментов относятся к классу гидролаз, потребность в которых исчисляется десятками тысяч тонн. В технологии бродильных производств гидролазам принадлежит огромная роль, так как именно они отвечают за подготовку сырья к сбраживанию.

К гидролазам относятся амилолитические, протеолитические, цитолитические, липолитические, пектолитические и другие ферменты.

Гидролиз крахмала осуществляется амилолитическими ферментами.

Крахмал - полисахарид, состоящий в свою очередь из двух полисахаридов, которые отличаются степенью полимеризации и типом строения – амилозой(примерное содержание 20-30 %)и амилопектином ( 70- 80 %). Структурной единицей крахмала, а, следовательно, амилозы и амилопектина, является глюкоза, остатки которой соединены между собой α-1,4 и α-1,6- глюкозидньми связями.

Амилоза имеет линейное строение, связь между остатками глюкозы α-1,4 (между 1-м и 4-м углеродными атомами). Растворима в горячей воде без набухания. Образует растворы невысокой вязкости. Молекулярная масса от 60 до 600. С йодом дает синее окрашивание.

о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-

Рисунок 16 – Строение амилозы

Амилопектин представляет собой разветвленную цепь, состоящую из большого числа глюкозных остатков (около 2500). Главная цепочка состоит из 25-30 остатков, а боковые __ из 15-18. В амилопектине остатки глюкозы на линейных участках связаны α-1,4- связью, а в местах ветвления связь α-1,6. В воде не растворяется. При нагревании образует клейстер. С йодом дает фиолетовое окрашивание.

Гидролиз крахмала и продуктов его частичного гидролиза, а также гликогена, осуществляется амилазами (α-амилазой, β-амилазой, глюкоамилазой и другими амилолитическими ферментами).

α- амилаза (декстриногенамилаза) - по механизму действия относится к эндоферментам, т.е. действует на молекулу субстрата изнутри, беспорядочно, что приводит к быстрому снижению вязкости раствора крахмала. Гидролизует связи α-1,4 в полисахаридах, содержащих три и более остатков Д-глюкозы.

Амилоза под действием α-амилазы сначала распадается на декстрины среднего размера, которые затем расщепляются на низкомолекулярные декстрины и мальтозу. При длительном действии фермента амилоза практически полностью превращается в мальтозу и небольшое количество глюкозы.

Действие α-амилазы на амилопектин приводит к образованию мальтозы и низкомолекулярных декстринов.

Общая схема гидролиза крахмала α-амилазой:

α-амилаза

Крахмал низкомолекулярные декстрины

(много)+ мальтоза (мало) + глюкоза (очень мало)

Оптимальные условия действия фермента: рН 5,7, температура 70 °С.

β-амилаза (сахарогенамилаза) __ экзофермент, катализирует гидролиз связей α -1,4 в полисахаридах, последовательно отщепляя остатки мальтозы от нередуцирующего (где отсутствует свободная альдегидная группа) конца цепей. β-амилаза расщепляет амилозу полностью (если количество молекул глюкозы в ней четное) в мальтозу, если нечетное, то наряду с мальтозой образуется мальтотриоза.

В амилопектине β-амилаза действует лишь на свободные нередуцирующие концы глюкозных цепочек с образованием мальтозы и высокомолекулярных декстринов. Действие ее прекращается при приближении к разветвлению (где имеется связь α-1,6) на расстоянии одной молекулы глюкозы. Образовавшиеся декстрины гидролизуются дальше α-амилазой до декстринов меньшей молекулярной массы.

Общая схема гидролиза крахмала под действием β-амилазы:

β-амилаза

Крахмал высокомолекулярные декстрины (много) + мальтоза (много) + мальтотриоза (мало)

Оптимальные условия действия β-амилазы: рН 4,7, температура 63 °С.

Таким образом, при совместном действии α- и β-амилаз на крахмал только 80 % его превращается в сбраживаемые сахара (мальтозу, глюкозу, мальтотриозу) и 20 % __ в декстрины с 5-8 глюкозными остатками.

Предельная декстриназа __ эндофермент, неупорядоченно гидролизует в крахмале, гликогене, декстринах α-1,6-глюкозидную связь. Чаще всего образуется мальтотриоза. Оптимальные параметры действия: рН 6,5, температура 50 о С.

Глюкоамилаза __ экзофермент, гидролизует связи α-1,4 и α-1,6 в полисахаридах, последовательно отщепляя по одному остатку глюкозы с нередуцирующих концов цепей. Связи α-1,4 в крахмале разрушаются быстрее, чем α-1,6. Оптимальные условия: рН 4,5-4,6, температура 55-60°С.

В различных бродильных производствах к гидролизу крахмала предъявляют разные требования. В производстве спирта необходимо прогидролизовать крахмал как можно глубже, чтобы получить больше сбраживаемых сахаров, а, следовательно, более высокий выход спирта.

В производстве пива полный гидролиз крахмала не осуществляют, так как в среде кроме сбраживаемых сахаров (нужных для образования определенного количества спирта) должны находиться низкомолекулярные декстрины, придающие полноту вкуса и вязкость пиву.

В зависимости от источника фермента свойства амилаз и других ферментов могут сильно отличаться не только по механизму действия и конечным продуктам реакции, но и оптимальным условиям для проявления максимальной активности. Выше были приведены оптимальные параметры действия для α- и β-амилаз солода.

Бактериальные амилазы отличаются от солодовых большей термостабильностью. Оптимальные параметры действия: температура 80-85 о С (иногда до 90-95 о С), рН 5,5-5,8.

Грибные амилазы (к ним, в частности, относится глюкоамилаза) более устойчивы к реакции среды: оптимумы температуры 50-60 о С, рН 4,2-4,7.

Таким образом, бактериальные амилазы более термостабильны, а грибные амилазы действуют в более кислой среде в сравнении с солодовыми ферментами.

Гидролиз углеводов . Во многих пищевых производствах имеет место гидролиз пищевых гликозидов, олигосахаридов и полисахаридов. Гидролиз зависит от многих факторов: рН, температуры, аномерной конфигурации, комплекса ферментов. Он важен не только для процессов получения пищевых продуктов, но также и для процессов их хранения. В последнем случае реакции гидролиза могут приводить к нежелательным изменениям цвета или, в случае полисахаридов, могут приводить к неспособности их образовывать гели.

Большое внимание сейчас уделяется получению различных зерновых сахарных сиропов из дешевого крахмалсодержащего сырья и крахмала (рожь, кукуруза, сорго и др.). Их получение сводится к использованию разных комбинаций амилолитических ферментных препаратов (a-амилазы, глюкоамилазы, b-амилазы). Получение глюкозы (с помощью глюкоамилазы), а затем действие глюкозоизомеразы дает возможность получения глюкозофруктозных и высокофруктозных сиропов, применение которых позволяет заменять во многих производствах сахарозу.

При получении сахарных сиропов из крахмала степень конверсии крахмала в D-глюкозу измеряют в единицах глюкозного эквивалента (ГЭ) - это содержание (в %) образующихся редуцирующих сахаров, выраженное в глюкозе на сухие вещества (СВ) сиропа.

Таблица 10.Состав и сладость типичных высокофруктозных сиропов

Гидролиз крахмала.

1. При гидролизе крахмала под действием кислот сначала имеет место ослабление и разрыв ассоциативных связей между макромолекулами амилозы и амилопектина. Это сопровождается нарушением структуры крахмальных зерен и образованием гомогенной массы. Далее идет разрыв a-D-(l,4)- и a-D-(1,6)-связей с присоединением по месту разрыва молекулы воды. В процессе гидролиза нарастает число свободных альдегидных групп, уменьшается степень полимеризации. По мере гидролиза и нарастания редуцирующих (восстанавливающих) веществ содержание декстринов уменьшается, глюкозы - увеличивается, концентрация мальтозы, три- и тетрасахаров сначала увеличивается, затем их количество снижается (рис. 11). Конечным продуктом гидролиза является глюкоза. На промежуточных стадиях образуются декстрины, три- и тетрасахара, мальтоза. Определенному значению глюкозного эквивалента соответствует определенное соотношение этих продуктов, и, варьируя длительностью гидролиза и условиями его проведения, можно получать различные соотношения отдельных продуктов гидролиза при той или иной величине глюкозного эквивалента.

Рис. 11. Изменение содержания сахаров при кислотном гидролизе крахмала

Кислотный гидролиз долгое время был главным при получении глюкозы из крахмала. Этот способ имеет ряд существенных недостатков, которые связаны с использованием высоких концентраций кислот и высокой температуры, что приводит к образованию продуктов термической деградации и дегидратации углеводов и реакции трансгликозилирования.

2. Крахмал гидролизуется также и под действием амилолитических ферментов. К группе амилолитических ферментов относятся a- и b-амилаза, глюкоамилаза и некоторые другие ферменты. Амилазы бывают двух типов: эндо- и экзоамилазы .

Четко выраженной эндоамилазой является a-амилаза , способная к разрыву внутримолекулярных связей в высокополимерных цепях субстрата. Глюкоамилаза и b-амилаза являются экзоамилазами , т.е. ферментами, атакующими субстрат с нередуцирующего конца.

a-Амилаза , действуя на целое крахмальное зерно, атакует его, разрыхляя поверхность и образуя каналы и бороздки, то есть как бы раскалывает зерно на части (рис. 12). Клейстеризованный крахмал гидролизуется ею с образованием не окрашиваемых иодом продуктов - в основном низкомолекулярных декстринов. Процесс гидролиза крахмала многостадийный. В результате воздействия a-амилазы на первых стадиях процесса в гидролизате накапливаются декстрины, затем появляются неокрашиваемые йодом тетра- и тримальтоза, которые очень медленно гидролизуются a-амилазой до ди- и моносахаридов.

Рис. 12.Гидролиз крахмала a-амилазой

Схему гидролиза крахмала (гликогена) a-амилазой можно представить так:

b-Амилаза является экзоамилазой, проявляющей сродство к предпоследней a-(1,4)-связи с нередуцирующего конца линейного участка амилозы или амилопектина (рис. 13). В отличие от a-амилазы, b-амилаза практически не гидролизует нативный крахмал; клейстеризованный крахмал гидролизуется до мальтозы в b-конфигурации. Схему можно записать следующим образом:

Ферментативный гидролиз крахмала присутствует во многих пищевых технологиях как один из необходимых процессов, обеспечивающих качество конечного продукта - в хлебопечении (процесс тестоприготовления и выпечки хлеба), производстве пива (получение пивного сусла, сушка солода), кваса (получение квасных хлебцев), спирта (подготовка сырья для брожения), различных сахаристых крахмалопродуктов (глюкозы, патоки, сахарных сиропов).

3. Кислотно-ферментативный способ гидролиза включает предварительную обработку кислотой, а затем действием ферментов a-, b- и (или) глюкоамилазы. Использование такого комбинированного способа гидролиза крахмала открывает широкие возможности для получения сиропов заданного состава.

Гидролиз сахарозы. Поскольку сахароза как сырье используется во многих производствах, необходимо учитывать ее исключительную способность к гидролизу. Это может иметь место при нагревании в присутствии небольшого количества пищевых кислот. Образующиеся при этом редуцирующие сахара (глюкоза, фруктоза) могут участвовать в реакциях дегидратации, карамелизации и меланоидинообразования, образуя окрашенные и ароматические вещества. В ряде случаев это может быть нежелательно.

Ферментативный гидролиз сахарозы под действием b-фруктофуранозидазы (сахаразы, инвертазы) играет положительную роль в ряде пищевых технологий. При действии b-фруктофуранозидазы на сахарозу образуются глюкоза и фруктоза. Благодаря этому в кондитерских изделиях (в частности, в помадных конфетах) добавление b-фруктофуранозидазы предупреждает черствение конфет, в хлебопекарных изделиях - способствует улучшению аромата. Инверсия сахарозы под действием b-фруктофуранозидазы имеет место на начальной стадии производства виноградных вин. Инвертные сиропы, полученные действием b-фруктофуранозидазы на сахарозу, используются при производстве безалкогольных напитков.

Ферментативный гидролиз некрахмалистых полисахаридов. Этот гидролиз имеет место под действием ферментов целлюлолитического, гемицеллюлазного и пектолитического комплекса. Используется в пищевой технологии для более полной переработки сырья и улучшения качества продукции. Например, гидролиз некрахмалистых полисахаридов (пентозанов и др.) при солодоращении имеет значение в последующем для образования окрашенных и ароматических продуктов (при сушке солода и создании определенных органолептических свойств пива). В производстве соков и в виноделии - для осветления, увеличения выхода сока, улучшения условий фильтрации.

Гидролиз целлюлозы происходит под действием комплекса целлюлолитических ферментов. По современным представлениям гидролиз целлюлозы под действием ферментов целлюлолитического комплекса можно представить следующим образом:

Реакции дегидратации и термической деградации углеводов . При переработке пищевого сырья в пищевые продукты эти реакции занимают важное место. Они катализируются кислотами и щелочами, и многие из них идут по типу b-элиминации. Пентозы, как главный продукт дегидратации, дают фурфурол , гексозы - оксиметилфурфурол и другие продукты, такие как 2-гидроксиацетилфуран , изомальтол и мальтол . Фрагментация углеродных цепей этих продуктов дегидратации приводит к образованию муравьиной, молочной, уксусной кислот и ряда других соединений. Некоторые из образующихся продуктов обладают определенным запахом и могут поэтому сообщать пищевому продукту желательный или, наоборот, нежелательный аромат. Эти реакции требуют высокой температуры.

Реакции, которые имеют место при тепловой обработке cахаров, могут быть разделены на идущие без разрыва С-С-связей и на идущие с их разрывом. К первым относятся реакции аномеризации:

и внутренней альдозо-кетозной конверсии, например:

В сложных углеводах, таких как крахмал, в жестких условиях нагревания - пиролиз при высокой температуре (200 °С) - важное место занимают реакции трансгликозилирования. При этих условиях число (1,4)-a-b-связей уменьшается во времени, a (l,6)-a-D- и даже (1,2)-b-D-связи образуются.

При получении глюкозы кислотным гидролизом крахмала, который обычно проводят в сильнокислой среде при высокой температуре, могут образовываться изомальтоза и гентиобиоза . Протекание таких реакций является отрицательной характеристикой кислотного способа получения глюкозы.

При тепловой обработке некоторых пищевых продуктов могут образовываться в значительном количестве ангидросахара, особенно при обработке в сухом виде продуктов, содержащих D-глюкозу или полимеры на основе D-глюкозы.

Реакции с разрывом С-С-связей приводят к образованию летучих кислот, кетонов, дикетонов, фуранов, спиртов, ароматических веществ, оксида и диоксида углерода .

Реакции образования коричневых продуктов . Потемнение пищевых продуктов может иметь место в результате окислительных или неокислительных реакций. Окислительное или ферментативное потемнение - это реакция между фенольным субстратом и кислородом, катализируемая ферментом полифенолоксидазой. Это потемнение, имеющее место на срезах яблок, бананов, груш, не связано с углеводами.

Неокислительное или неферментативное потемнение представлено в пищевых продуктах очень широко. Оно связано с реакциями углеводов и включает явление карамелизации и взаимодействие углеводов с белками или аминами . Последнее известно как реакция Майяра.

Карамелизация. Прямой нагрев углеводов, особенно сахаров и сахарных сиропов, способствует протеканию комплекса реакций, называемых карамелизацией . Реакции катализируются небольшими концентрациями кислот, щелочей и некоторых солей. При этом образуются коричневые продукты с типичным карамельным ароматом. Регулируя условия, можно направить реакции в основном на получение аромата или же в сторону образования окрашенных продуктов. Умеренный (начальный) нагрев сахарных растворов приводит к аномерным изменениям, разрыву гликозидных связей, образованию новых гликозидных связей. Но основными являются реакция дегидратации с образованием ангидроколец. В результате образуются дигидрофураноны, циклопентанолоны, циклогексанолоны, пироны и др. Сопряженные двойные связи адсорбируют свет определенных длин волн, придавая продуктам коричневый цвет. Часто в ненасыщенных кольцевых системах может иметь место конденсация в полимерные кольцевые системы. Обычно для получения карамельного цвета и запаха используется сахароза. Нагреванием раствора сахарозы в присутствии серной кислоты или кислых солей аммония получают интенсивно окрашенные полимеры «сахарный колер » для применения в различных пищевых продуктах - при производстве напитков, карамели и др. Стабильность и растворимость этих полимеров увеличивается в присутствии НSО 3 -ионов:

Карамельные пигменты содержат различные группы - гидроксильные, кислотные, карбонильные, енольные, фенольные и др. Скорость реакции образования карамельных пигментов увеличивается при увеличении температуры и рН. В отсутствие буферных солей может образоваться полимерное соединение гумин с горьким вкусом (средняя формула C 125 H 188 O 90); при производстве пищевых продуктов с этим необходимо считаться и не допускать его образования.

Комплекс реакций, имеющих место при карамелизации, приводит к образованию разнообразных кольцевых систем с уникальным вкусом и ароматом. Так, мальтол и изомальтол имеют запах печеного хлеба, 2-Н-4-гидрокси-5-метилфуранон-3 - аромат жареного мяса. Кроме того, эти продукты имеют сладкий вкус, что также определяет их положительную роль в пищевых продуктах.

Реакция Майяра (меланоидинобразование). Реакция Майяра является первой стадией реакции неферментативного потемнения пищевых продуктов. Для протекания реакции требуется наличие редуцирующего сахара, аминного соединения (аминокислоты, белки) и немного воды.

Рис. 13.Схематическое изображение превращений при потемнении пищевых продуктов

Все процессы, происходящие при потемнении пищевых продуктов (рис. 13), еще недостаточно точно определены, но начальные стадии изучены очень детально. Установлено, что помимо реакции Майяра имеет место дегидратация с образованием оксиметилфурфурола, разрыв цепей, образование дикарбонильных соединений, образование меланоидиновых пигментов, которые образуются на конечных стадиях и имеют окраску от красно-коричневой до темно-коричневой. Если на первых стадиях возможна некоторая деколоризация при добавлении восстановителей (например, сульфита), то на конечном этапе это уже невозможно.

Если образование коричневых пигментов для пищевых продуктов нежелательно, можно ингибировать протекаемые реакции, например, значительным снижением влажности (для сухих продуктов), снижением концентрации сахара (разведением), рН и температуры (для жидких продуктов). Можно удалить один из компонентов субстрата (обычно, сахар). Например, при получении яичного порошка, чтобы не допустить появления запаха, перед сушкой добавляют глюкозооксидазу, что приводит к разрушению D-глюкозы и образованию D-глюконовой кислоты:

Кроме удаления сахара, образующийся при этом технологическом приеме пероксид водорода и повышение температуры приводят к снижению бактериальной обсемененности (см. табл. 3.8). Для предотвращения потемнения рыбы, содержащей значительные количества рибозы, добавляют бактерии, обладающие D-рибозооксидазной активностью.

Оксид серы (SO 2) и его производные подавляют реакцию потемнения в пищевых продуктах, однако их применение ограничивается возможностью образования в сульфитированных пищевых продуктах слаботоксичных компонентов. Поиски других ингибиторов продолжаются, однако найденные до настоящего времени заменители (цианиды, димедон, гидроксиламин, гидразин, меркаптаны, бромин ) неприемлемы из-за токсичности. Однако этот путь защиты от потемнения не предохраняет продукты от потери аминокислот (например, лизина), поскольку реакция с сульфит-ионами протекает на последних стадиях меланоидинообразования.

Окисление в альдоновые, дикарбоновые и уроновые кислоты . Способность альдоз к окислению также имеет значение для пищевых продуктов. При определенных условиях возможно окисление в альдоновые кислоты, причем b-форма окисляется быстрее, чем a-форма. Продуктом окисления является b-лактон, который находится в равновесии с g-лактоном и свободной формой альдоновой кислоты (рис. 14). Последняя форма превалирует при рН 3.

Рис.14. Окисление D-глюкозы

Глюконо-b-лактон может присутствовать в пищевых продуктах в умеренно кислой среде, когда имеет место медленная реакция, например, при получении некоторых молочных продуктов. При действии более сильных окислителей (например, азотной кислоты) образуются дикарбоновые кислоты.

Окисление в уроновые кислоты возможно только при защите карбонильной группы (рис. 15).

Рис. 15. Окисление D-галактозы в D-галактуроновую кислоту

Один из промышленных способов получения глюкуроновой кислоты - окисление при гидролизе крахмала - приведен на рис. 16.

Рис. 16. Один из промышленных способов получения глюкуроновой кислоты

Уроновые кислоты распространены в природе. Некоторые их них являются структурными компонентами полисахаридов, имеющих важное значение в пищевых процессах, таких как гелеобразование и загустевание -это пектин (D-галактуроновая кислота), альгиновая кислота из морских водорослей (D-маннуроновая кислота, a-гулуроно-вая кислота).

Окисление, катализируемое ферментами. Здесь прежде всего следует сказать об окислении глюкозы под воздействием глюкозооксидазы.

С точки зрения применения в пищевых технологиях представляет интерес система глюкозооксидаза - каталаза.

Глюкозооксидаза обладает исключительной специфичностью по отношению к глюкозе. Ее действие показано на схеме, приведенной на рис. 17.

Рис. 17. Действие глюкозооксидазы

Эта реакция является эффективным методом удаления кислорода из напитков (соков, пива), поскольку кислород участвует в образовании пероксидов и веществ, приводящих к изменению цвета и запаха продуктов. Применение глюкозооксидазы дает возможность ингибировать протекание реакции Майяра.

Процессы брожения . Брожение - процесс (в котором участвуют углеводы), используемый в ряде пищевых технологий: во время тестоприготовления при изготовлении хлеба, в производстве пива, кваса, спирта, вина и других продуктов.

Спиртовое брожение осуществляется благодаря жизнедеятельности ряда микроорганизмов. Наиболее типичными организмами спиртового брожения являются дрожжи рода Saccharomyces. Суммарно спиртовое брожение может быть выражено следующим уравнением:

Это суммарное уравнение не отражает того факта, что обычно, кроме главных продуктов брожения - этилового спирта и углекислого газа, всегда в незначительном количестве образуются некоторые другие вещества, например, янтарная, лимонная кислота, а также смесь амилового, изоамилового, бутилового и других спиртов, уксусная кислота, дикетоны, уксусный альдегид, глицерин и ряд других соединений, от наличия ничтожных количеств которых зависит специфический аромат вина, пива и других спиртных напитков.

Разные сахара сбраживаются дрожжами с различной скоростью. Наиболее легко подвергаются сбраживанию глюкоза и фруктоза, медленнее - манноза , еще медленнее - галактоза ; пентозы дрожжами не сбраживаются. Из дисахаридов хорошим субстратом спиртового брожения являются сахароза и мальтоза . Однако оба сахара сбраживаются лишь после предварительного гидролиза на составляющие их моносахариды ферментами a-гликозидазой.

В присутствии кислорода спиртовое брожение прекращается и дрожжи получают энергию, необходимую для их развития и жизнедеятельности, путем кислородного дыхания. При этом дрожжи тратят сахар значительно экономнее, чем в анаэробных условиях. Прекращение брожения под влиянием кислорода получило название «эффект Пастера ».

Другой вид брожения, важный для пищевых технологий, это молочнокислое брожение, при котором из одной молекулы гексозы образуются две молекулы молочной кислоты :

С 6 Н 12 О 6 = 2СН 3 -СНОН-СООН

Молочнокислое брожение играет очень большую роль при производстве молочнокислых продуктов (простокваши, ацидофилина, кефира, кумыса ), при изготовлении кваса, хлебных заквасок и «жидких дрожжей » для хлебопечения, при квашении капусты, огурцов, при силосовании кормов.

Все микроорганизмы, вызывающие молочнокислое брожение, разделяются на две большие группы. К первой группе принадлежат микроорганизмы, являющиеся истинными анаэробами и сбраживающие гексозы в точном соответствии с вышеприведенным суммарным уравнением молочнокислого брожения. Их называют гомоферментативными молочнокислыми бактериями . Вторую группу образуют гетероферментативные молочнокислые бактерии , которые, кроме молочной кислоты, образуют значительные количества других продуктов, в частности, уксусной кислоты и этилового спирта.

Злаковые культуры - это основное сырье для производства спирта и получения дистиллята. Прежде всего, это ячмень, овес, рис, кукуруза, пшеница и т.д. Используют их по нескольким причинам:

Относительно небольшая стоимость
Приятный органолептический профиль получаемого продукта
Высокий выход спирта

Традиционная брага делается из сахара и дрожжей. Дрожжи нужны, чтобы расщепить сахар, в результате чего образуется спирт. Однако в зерне сахара как такового нет, зато много крахмала. Чтобы получить брагу из зерна, крахмал нужно разрушить ферментами. Это белковые вещества, которые делают возможными или ускоряют химические реакции, нужные для образования спирта. Ферменты содержатся в пророщенном зерне (солоде) и продаются как препараты в чистом виде.

Следовательно, есть три способа сделать зерновую брагу:

Использовать солод, чтобы осахарить крахмал в зерне. Так можно осахарить до 40% от засыпи не соложенного зерна.
Прорастить зерно, чтобы ферменты накопились в нем естественным образом. То есть сделать солод.
Использовать фермент в виде препарата и несоложеное сырье.

Второй способ дешевле и позволяет получить результат быстрее.

Строение зерна

Чтобы понять, как именно перерабатывается зерно при затирании, необходимо разобраться в его строении. Рассмотрим на примере ячменя.

Внутреннее строение зерна ячменя

1-зародыш стебля, 2-зародыш листа, 3-зародыш корня, 4-щиток, 5-слой эпителия, 6-эндосперм, 7-пустые израсходованные клетки, 8-алейроновый слой, 9-семенная оболочка, 10-плодовая оболочка, 11-мякинная оболочка

Зерно ячменя представляет собой зерновку, оболочка которой состоит из нескольких клеточных слоев.

Оболочки объединяются в мякинную (или цветочную) - наружная оболочка, плодовую (или перикарп) и семенную (или теста).

Мякинная оболочка у большинства ячменей срастается с зерновкой. Мякинная оболочка очень прочная, именно она предохраняет зерно от механических повреждений. В основном состоит из целлюлозы, небольшого содержания кремниевой кислоты, липидов и полифенольных соединений.

Под мякинной оболочкой находятся сросшиеся плодовая и семенная оболочки . Семенная оболочка полупроницаема, она хорошо пропускает воду, но задерживает растворенные в воде вещества. Это свойство семенной оболочки позволяет обрабатывать зерно водой с различными химическими веществами, которые не проникают в зерно и не повреждают зародыш.

Эндосперм (мучнистое тело) покрыт алейроновым слоем. Он состоит из многочисленных клеток, богатых белками. В прорастающем ячмене алейроновый слой является местом образования ферментов.

Основными компонентами клеточных стенок алейронового слоя являются некрахмалистые полисахариды - пентозаны (70%) и β-глюкан (30%).

Мучнистое тело (эндосперм) занимает всю внутреннюю часть зерна, состоит из крахмальных зерен разного размера. Около 98 % сухого вещества зерен приходится на крахмал.

Химический состав

Белковых веществ в ячмене в среднем содержится 10,5-11%.

В ячмене белки содержатся:

алейроновом слое - в виде ферментативного белка (альбумины и глобулины);
На наружной стороне эндосперма - резервный белок (проламины);
эндосперме - тканевый белок (глютелины).

По своему аминокислотному составу белки ячменя относятся к достаточно полноценным (в зерно ячменя входит более 20 аминокислот).

Углеводы представлены моно- и полисахаридами, главным образом крахмалом, содержание которого колеблется от 50 до 64%. Клетчатки содержится 5–6%, сахаров и декстринов до 6% (в том числе до 2% сахарозы и 0,4% непосредственно редуцирующих сахаров), жира - 2,1–2,6%, минеральных веществ - 2,5–3,5%. Большая часть клетчатки и минеральных веществ сосредоточена в пленке и оболочках зерна.

Зерно в производстве спирта: теория

Зерно ячменя обладает высокой активностью ферментов (амилазы, протеазы и пероксидазы), поэтому является хорошим материалом для приготовления солода.

Богатый химический состав предопределяет использование злаков в качестве исходного сырья для производства спирта. Эти вещества являются питательными компонентами для дрожжей, а следовательно брожение в данной среде будет проходит гораздо лучше и конечный продукт будет обладать отличной вкусоароматикой.

Основным источником спирта при брожении являются углеводы. В зерне они представлены крахмалом. Дрожжи перерабатывают на спирт только моно, дисахариды и некоторые декстрины. Крахмал является полисахаридом, состоящим из амилозы и амилопектина. Дрожжи перерабатывают крахмал только при условии разрушения молекулы на простые углеводы (моно и дисахариды). Именно для этого процесса необходимы ферменты.

Температура клейстеризации крахмала – температура при которой происходит набухание и разрушение структуры крахмальных зерен, этот процесс позволяет ферментам произвести полное осахаривание крахмала.

Соответственно если температура клейстеризации выше рабочей температуры фермента, то сначала проводят отварку (нагрев затора до 90-100 градусов) для набухания и разрушения структуры крахмальных зерен, затем производят охлаждения до рабочей температуры и вносят фермент.

Что такое фермент

Ферменты - это биологические катализаторы белковой природы, способные активизировать различные химические реакции в живом организме.

Проще говоря это белковые молекулы, которые ускоряют химические реакции, если поместить их соответствующие условия (температура и рН). У каждого фермента эти условия индивидуальны.

По специфичности воздействия на различные высокомолекулярные полимеры зерна ферментные препараты можно поделить на 3 группы.

Амилолитического действия - способствуют гидролизу крахмала. К ним относятся ферменты разжижающего, декстринирующего и осахаривающего воздействия.
Протеолитического действия - разрушают (гидролизуют) белковые молекулы.
Целлюлолитического действия - гидролизуют некрахмалистые полисахариды, например целлюлозу.

По происхождению

Нативного происхождения - образуются в зерне при проращивании;
Микробиального происхождения - полученные с помощью плесневых грибов;
Бактериального происхождения - культивированы бактериями

Так же ферменты делятся на жидкие и сухие.

Если использовать микробиальные и бактериальные ферменты, отпадает необходимость в соложении зерна. К тому же данные ферменты обладают более широким температурным диапазоном действия по сравнению с нативными.

Есть два способа переработать зерновые культуры, чтобы расщепить крахмал на сахара:

Затирание с помощью нативных ферментов содержащихся в пророщенном зерне. Этот процесс является классической технологией производства заторов. Но он является довольно трудоемким, включающим в себя проращивание зерна, передерживание температурных границ при затирании, так же пророщенное зерно на порядок выше в цене обычного зерна.
Затирание с помощью ферментов полученных бактериально. Данный метод является прогрессирующим и набирающим все большую популярность. Его основным преимуществом является относительная дешевизна и простота в использовании. Бактериальные ферменты позволяют использовать непророщенное зерно, что снижает конечную стоимость готовой продукции а так же экономит время и силы. Так же бактериальные ферменты имеют более широкий температурной диапазон действия что позволяет расширить область его применения в технологическом процессе.

Ферменты в магазинах «Доктор Губер»

Чтобы переработать зерно в домашних условиях в первую очередь необходимы ферменты амилолитического действия. У нас они представлены следующими ферментами:

Амилосубтилин - ферментный препарат мезофильной бактериальной α-амилазы. Гидролизует внутренние α-1,4-гликозидные связи крахмала (амилозы и амилопектина) и продуктов их последовательного расщепления, что приводит к быстрому снижению вязкости клейстеризованных растворов крахмала на стадии разжижения, тем самым, обеспечивая подготовку сусла к действию глюкоамилазы. Активность составляет 1500 ед.Ас/г. Температурный оптимум действия 30-60°С
Глюкаваморин - получают путем глубинного культивирования штамма плесневого гриба Aspergillus awamori. Гидролизует α −1,4 и альфа-1,6-гликозидные связи крахмала, декстринов, олигосахаридов, последовательно отщепляя глюкозу от нередуцирующих концов цепей. Применяется для осахаривания крахмала. Активность составляет 1500 ед.Гс/г. Температурный оптимум действия 30-60 °С

Препараты представлены в сухом виде в фасовке по 20 грамм.

Для работы с непророщенным зерном этих ферментов будет достаточно.

Ферменты в производстве спирта: практика

В первую очередь готовится водный раствор. Для этого сухой препарат растворяют водой в соотношении 1:10, температура воды 25-30 градусов и тщательно перемешивают, в таком состоянии препарат хранится не более 24 часов. Далее рассчитывается необходимое количество фермента.

Активность ферментов выражается в ед./г. вещества.

Амилосубтилин - 2-4 ед. на грамм крахмала.
Глюкаваморин - 2-4 ед. на грамм крахмала.

Пример расчета:

При затирании в аппарате объёмом 60 литров при гидромодуле 1:3 используем примерно 15 кг зерна (предположим, что зерном в данном случае является пшеница).

В зерне пшеницы в среднем содержится от 55 до 65% крахмала (табличные данные). Возьмем среднее значение 60%.

Это значит, что в 15 кг зерна содержится: 15*0.6= 9кг крахмала.

Дана дозировка ферментов и их активность на грамм крахмала:

1 грамм Амилосубтилина содержит 1500 ед.Гс, дозировка 2-4ед. (среднее 3)
1 грамм Глюкаваморина содержит 1500 ед.Ас, дозировка 2-4 ед (среднее 3)

На 9000 грамм крахмала нам необходимо:

9000*3= 27000 ед.АС для снижения вязкости
9000*3= 27000 ед.Гс для осахаривания крахмала

Что соответствует:

27000/1500= 18 грамм Амилосубтилина
27000/1500= 18 грамм Глюкаваморина

1 пакетика 20 грамм достаточно для осахаривания 15 кг пшеницы.

Расчеты были сделаны для затирания при Т=60°С. При температурах ниже 60°С желательно увеличить дозировку фермента на 20-30%.

После расчета и подготовки препарата его вносят вместе с измельченным зерном в воду и проводят затирание.

Подготовка ферментных препаратов: глубинную культуру плесневых грибов или бактерий дезинфицируют формалином; сухую поверхностную культуру смешивают с водой температурой 28-30 єС в соотношении 1:1. Затем ее тщательно измельчают на дробилках, добавляют воду в количестве 3-4 дм 3 на 1 кг препарата, дезинфицируют раствором формалина, выдерживают 25-30 мин и направляют на осахаривание.

Расход поверхностной культуры - 5 % к массе крахмала разваренной массы. Можно использовать смесь сухой культуры ферментных препаратов и солода. Их вместе измельчают и готовят суспензию наподобие солодового молока. При осахаривании крахмала в спиртовом производстве необходимо достичь полного его гидролиза до сбраживаемых сахаров. На практике осахаривание протекает на нескольких технологических стадиях:

- при разваривании сырья;
- при осахаривании при оптимальной температуре для действия ферментов;
- при брожении (температура благоприятная для жизнедеятельности дрожжей, но не ферментов).

При разваривании под действием бактериальной б-амилазы гидролиз крахмала незначителен, образуются, главным образом, декстрины.

На стадии осахаривания образуется максимальное количество сбраживаемых сахаров. Крахмал гидролизуется на 70-75 % до глюкозы и мальтозы и 25-30 % предельных декстринов. Причем если используется в качестве осахаривающего материала солод, то образуется 71-76 % мальтозы и 24-29 % глюкозы от суммы сбраживаемых сахаров; если применяют ферментные препараты, то 14-21 % мальтозы и 79-80 % глюкозы.

Некрахмальные полисахариды под действием ферментов солода почти не гидролизуются, ферментными препаратами гидролизуются в незначительной степени, что является положительным, так как возрастает количество сбраживаемых сахаров.

При осахаривании гидролизуются также белки под действием протеолитических ферментов до пептонов, полипептидов аминокислот (необходимы для питания дрожжей). Причем солод при гидролизе дает больше аминокислот, чем ферментные препараты.

Предельные декстрины доосахариваются до мальтозы в процессе брожения декстриназой солода или глюкоамилазой ферментных препаратов.

На скорость осахаривания крахмала влияют температура и рН среды. Оптимальная температура для действия амилазы солода на 2 %-й раствор картофельного крахмала составляет 53-58 єС. Однако для клейстеризации нерастворенного крахмала, вносимого с солодом, и стерилизации замеса необходима более высокая температура. При таких температурах (свыше 56 єС) амилаза инактивируется, но медленно. Поэтому осахаривание проводят при температуре 60-62 єС. Эта температура хотя и выше оптимальной, но присутствующие в заторе защитные вещества (сахара, декстрины, пептиды) предохраняют амилазу от инактивации. рН затора 4,9-5,6.

Осахаренное сусло должно иметь следующие показатели:

Полнота осахаривания определяется по йодной пробе. При использовании в качестве осахаривающего материала солодового молока цвет раствора йода с каплей фильтрата не должен изменяться. Красный цвет свидетельствует о наличии в сусле декстринов, сине-фиолетовый - о присутствии неосахаренного крахмала. Применение ферментных препаратов для осахаривания может оставлять окраску фильтрата с йодом светло-коричневой.

Доброкачественность - отношение общего количества содержащихся в сусле сбраживаемых углеводов к общей сумме растворимых сухих веществ, выраженное в процентах. Доброкачественность должна быть в пределах 76-78 %.

Кислотность выражают в градусах кислотности. 1є кислотности соответствует 1 см 3 раствора NаОН концентрацией 1 моль/дм 3 , израсходованного на нейтрализацию 20 см 3 раствора (сусла, бражки). Кислотность должна быть в пределе 0,2-0,3є, что соответствует рН 4,9-5,6. Кислотность сусла меньше 0,2є может привести к развитию посторонней микрофлоры, выше 0,4є - к инактивации ферментов.

Ферменты животного происхождения (пепсин, трипсин и др.) преимущественно получают из органов, в которых протекают интенсивные биохимические процессы (из слизистой желудка, печени, почек, селезенки и т. д.).

Источником растительных ферментов может быть пророщенное зерно (солод) различных злаков. В тропических и субтропических странах для промышленного производства ферментов в качестве сырья используют латекс дынного дерева (получают фермент папаин), ананас (бромелин), инжир (фицин), хрен (пероксидазу).

Ферменты различного происхождения используют либо непосредственно как технические ферментные препараты, либо служат исходным материалом для получения очищенных препаратов.

В связи с все возрастающими потребностями промышленности в ферментных препаратах растительные и животные источники их получения не устраивают производителей по ряду причин.

Органы животных можно получить только на мясокомбинатах, при этом возникает проблема их консервирования и хранения. Требуются большие временные и материальные затраты на выращивание самих животных.

Многие вышеназванные недостатки устраняются использованием для получения ферментов микроорганизмов (бактерий, плесневых грибов, дрожжей). Преимущества данного источника: микроорганизмы быстро растут на дешевых питательных средах; содержание фермента в расчете на единицу белка биомассы значительно больше; путем генетических изменений можно увеличить выход нужного фермента; выделить ферменты с улучшенными свойствами __ устойчивые к температуре, кислотам, щелочам. Микробные ферменты аналогичны ферментам растений и животных, но есть виды, которые не встречаются ни в растениях, ни у животных.

В бродильных производствах используют ферменты растительного (в виде солода) и микробного происхождения.

Контрольные вопросы

1 Дайте определение фермента.

2 Приведите основные характерные особенностеи ферментов как катализаторов.

3 Приведите классификацию ферментов.

4 Объясните, что такое субстрат, активатор, ингибитор, активный центр, ферон, простетическая группа.

5 Охарактеризуйте влияние температуры, рН, концентрации фермента и субстрата, присутствие активаторов и ингибиторов на скорость ферментативной реакции.

6 Перечислите источники ферментов. Дайте им характеристику.

2.7 ГИДРОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ

1 Гидролиз крахмала.

2 Гидролиз белков.

3 Гидролиз некрахмальных полисахаридов.

4 Ферментные препараты: характеристика и номенклатура.

5 Иммобилизованные ферменты

1 Гидролиз крахмала

Гидролиз крахмала осуществляется амилолитическими ферментами.

Крахмал - полисахарид, состоящий в свою очередь из двух полисахаридов, которые отличаются степенью полимеризации и типом строения – амилозой (примерное содержание 20-30 %) и амилопектином (%). Структурной единицей крахмала, а, следовательно, амилозы и амилопектина, является глюкоза, остатки которой соединены между собой α-1,4 и α-1,6- глюкозидньми связями.

о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-о-

Рисунок 16 – Строение амилозы

α- амилаза (декстриногенамилаза) - по механизму действия относится к эндоферментам, т. е. действует на молекулу субстрата изнутри, беспорядочно, что приводит к быстрому снижению вязкости раствора крахмала. Гидролизует связи α-1,4 в полисахаридах, содержащих три и более остатков Д-глюкозы.

Действие α-амилазы на амилопектин приводит к образованию мальтозы и низкомолекулярных декстринов.

Общая схема гидролиза крахмала α-амилазой:

α-амилаза

Крахмал низкомолекулярные декстрины

(много)+ мальтоза (мало) + глюкоза (очень мало)

Оптимальные условия действия фермента: рН 5,7, температура 70 °С.

Общая схема гидролиза крахмала под действием β-амилазы:

β-амилаза

Крахмал высокомолекулярные декстрины (много) + мальтоза (много) + мальтотриоза (мало)

Оптимальные условия действия β-амилазы: рН 4,7, температура 63 °С.

2 Гидролиз белков

Ферментативный гидролиз белков происходит под действием протеолитических ферментов . Они классифицируются на эндо - и экзо-пептидазы. Ферменты не имеют строгой субстратной специфичности и действуют на все денатурированные и многие нативные белки, расщепляя в них пептидные связи - СО-NH-.

Эндопептидазы (протеиназы) – гидролизуют непосредственно белок по внутренним пептидным связям. В результате образуется значительное количество полипептидов и мало свободных аминокислот. Подразделяются в зависимости от оптимума рН на кислые, нейтральные и щелочные. Оптимальные условия действия кислых протеиназ: рН 4,5-5,0, температура 45-50 °С (до 60 оС).

Экзопептидазы (пептидазы) действуют, главным образом, на полипептиды и пептиды, разрывая пептидную связь с конца. Основные продукты гидролиза __ аминокислоты. Данную группу ферментов делят на амино-, карбокси-, дипептидазы.

Аминопептидазы катализируют гидролиз первой пептидной связи, находящейся с N-конца.

H2N - СН - С - - NH - СН - С....

Карбоксипептидазы осуществляют гидролиз первой пептидной связи, находящейся рядом со свободной карбоксильной группой.

СО - NH - С – Н

R

Дипептизады катализируют гидролитическое расщепление дипептидов на свободные аминокислоты. Дипептидазы расщепляют только такие пептидные связи, по соседству с которыми находятся одновременно свободные карбоксильная и аминная группы.

дипептидаза

NH2CH2CONHCH2COOH + Н2О 2CH2NH2COOH

Глицин-глицин Гликокол

Оптимальные условия действия: рН 7-8, температура 40-50 оС. Исключение составляет карбоксипептидаза, проявляющая максимальную активность при температуре 50 оС и рН 5,2.

Недостаточный гидролиз высокомолекулярных азотистых веществ отрицательно влияет на коллоидную стойкость напитков, продукты гидролиза белков (аминокислоты) необходимы для питания дрожжей, пептиды __ формируют полноту вкуса пива, его пеностойкость и пенообразование.

3 Гидролиз некрахмальных полисахаридов

К некрахмальным полисахаридам относятся целлюлоза, гемицеллюлозы, пектиновые и гумми-вещества.

Целлюлоза __ высокомолекулярный полисахарид. Представляет собой длинную неразветвленную цепь остатков глюкозы, соединенных связями β-1,4. Нерастворима в воде. Входит в состав клеточных стенок растений.

Ферментативный гидролиз целлюлозы осуществляют целлюлазы (эндо - и экзоглюканазы ). Продукты гидролиза __ глюкоза и целлобиоза. Однако целлюлоза является сложным субстратом для действия ферментов, так как нерастворима в воде и содержит большое количество примесей. В настоящее время в промышленности полный гидролиз целлюлозы может быть проведен только концентрированными кислотами в очень жестких условиях (высокой температуре и давлении). При этом образуется только Д-глюкоза, а, кроме того, ряд вредных продуктов, от которых необходимо освобождаться.

Гемицеллюлозы также принадлежат к группе полисахаридов. Они не растворимы в воде, но растворимы в щелочах и легче гидролизуются кислотами, чем целлюлоза. Гемицеллюлозы делят на две группы: гексозаны и пентозаны, состоящие из остатков различных моносахаридов и их производных.

Гексозаны __ высокомолекулярные соединения. Могут быть линейные или разветвленные. Основным представителем является β-глюкан, в котором остатки глюкозы соединены β-1,3 и β-1,4-глюкозидными связями.

Пентозаны имеют ветвистое строение, состоят из остатков пентоз (сахаров с пятью атомами углерода) __ ксилозы, арабинозы, а также небольшого количества галактуроновой кислоты. Основной тип связей __ β-1,4, в местах ветвления __ β-1,3. Представителями пентозанов являются ксиланы, арабаны и арабиноксиланы.

Гумми-вещества близки по составу к гемицеллюлозам. Это продукты незавершенного гидролиза или синтеза гемицеллюлоз. Состоят из глюкозы, галактозы, ксилозы, арабинозы и остатков уроновых кислот. Растворимы в горячей воде, дают растворы с высокой вязкостью.

Гидролиз всех вышеназванных соединений идет под действием трех групп цитолитических ферментов: β-глюканаз (например, эндо-β-1,3-глюканаза; экзо-β-1,4-глюканаза), β-ксиланаз и β-глюкозидазы (экзофермент, расщепляет с нередуцирующего конца β-1,4-связь, с образованием глюкозы).

В результате гидролиза некрахмальных полисахаридов образуются глюкоза, арабиноза, ксилоза, уроновые кислоты, декстрины. Оптимальные условия действия цитолитических ферментов: рН 4,5-5,0, температура °С.

Гидролиз некрахмальных полисахаридов особенно интенсивно протекает при солодоращении, что приводит к растворению эндосперма (цитолиз). В пивоварении недостаточный гидролиз этих веществ затрудняет процесс фильтрования сусла и пива, отрицательно влияет на удаление мути, коллоидную стойкость напитка.

Пектиновые вещества __ высокомолекулярные соединения, полисахариды, состоящие из остатков галактуроновой или глюкуроновой кислот, соединенных связями α-1,4. При этом образуется цепочка полигалактуроновой кислоты.

В составе этой цепочки могут быть ответвления в виде остатков метилового спирта СН3О-, часть водородных атомов карбоксильных групп может быть замещена катионами металлов. К этой же цепи могут присоединяться остатки сахаров: галактозы, арабинозы, рамнозы в виде полисахаридной цепочки. Сахаридный комплекс образует нейтральную фракцию пектиновых веществ, а полигалактуроновая цепочка с метоксильными группами __ кислую фракцию.

К пектиновым веществам относят протопектин, пектин, пектиновые кислоты.

Протопектин, или нерастворимый пектин __ нерастворим в воде, имеет сложный химический состав, недостаточно хорошо изучен. Возможно это соединение пектина с другими веществами: целлюлозой, гемицеллюлозой, белками.

Пектин , или растворимый пектин __ полигалактуроновые кислоты, карбоксильные группы которых в различной степени соединены с остатками метилового спирта, т. е. этерифицированы. Молекулярная масса от 01.01.0100. Растворяется в горячей воде. В присутствии сахара и кислот образует студни.

Пектиновые кислоты – высокомолекулярные полигалактуроновые кислоты, не содержащие этерифицированных групп. Плохо растворяются в воде, студни не образуют. Пектиновые кислоты могут образовывать соли с ионами многовалентных металлов, в результате образуются нерастворимые соединения, которые выпадают в осадок.

Пектиновые вещества уменьшают выход соков из плодово-ягодного сырья, затрудняют их осветление, снижают стойкость вин и ликероводочных изделий к коллоидным помутнениям.

Гидролиз пектиновых веществ происходит под действием пектолитических ферментов : протопектиназы, пектинэстразы, полигалактуроназы.

Протопектиназа расщепляет в протопектине связи между метоксилированной полигалактуроновой кислотой и связанными с ней арабаном и галактаном. В результате образуется метоксилированная полигалактуроновая кислота, которая представляет собой растворимый пектин.

Арабан Метоксилированная Галактан

полигалактуроновая кислота

Рисунок 20- Действие протопектиназы

Пектинэстераза (пектаза) принадлежит к группе эстераз и гидролизует эфирные связи растворимого пектина, отщепляя метоксилъные группы от метоксилированной полигалактуроновой кислоты. При этом образуется метиловый спирт (СН3ОН) и полигалактуроновая кислота.

Полигалактуроназа (пектиназа) действует на растворимый пектин, катализируя расщепление α-1,4-глюкозидных связей между остатками галактуроновой кислоты, которые не содержат метоксилъных групп. В результате образуются галактуроновая и полиуроновые кислоты.

По механизму действия различают эндо - и экзополигалактуроназы. Эндополигалактуроназа действует «беспорядочно», разрывает цепь внутри молекулы субстрата, приводит к резкому снижению вязкости растворов.

Экзополигалактуроназа действует с конца цепи, отщепляя галактуроновую кислоту. Под действием этого фермента вязкость снижается незначительно.

Оптимальные условия действия пектолитических ферментов; рН 3,7-4,0, температура 40-50 °С.

4 Ферментные препараты: характеристика и номенклатура

Ферментные препараты широко используются в различных отраслях промышленности. Отличаются они от чистых ферментов тем, что содержат либо один или несколько ферментов с преобладанием какого-либо одного, а также балластные вещества среды, на которой были выращены микроорганизмы – продуценты ферментов.

Для промышленного производства ферменных препаратов используют микроорганизмы, выделенные из природных источников и мутагенные штаммы (получают воздействием химических и физических факторов). Активными продуцентами ферментов являются микроскопические грибы родов Aspergillus (видов oryzae, niger, awamori, batatae, foetidus, flavus и др.), Rhisopus, Penicillium, Fusarium, Trichoderma (вид viride), спороносные бактерии родов Bacillus (видов subtilis, mesentericus, brevis и др.), Clostridium

Наименование препарата начинается с сокращенного названия основного фермента, активность которого преобладает. Затем следует измененное видовое название продуцента и окончание «ин». В наименовании препарата отражается также и способ культивирования микроорганизма-продуцента. При глубинном культивировании после названия ставится буква «Г», при поверхностном – «П».

Условно количество фермента в стандартной культуре обозначается «х». Цифра перед «х» указывает на степень очистки фермента в процессе получения данного препарата.

Например: Амилосубтилин Г10х __ ферментный препарат амилолитического действия, бактериального происхождения, продуцент - бактерии Bacillus subtilis, выращенные глубинным способом, степень очистки 10х, в виде порошка. Пектофоетидин П20х __ высокоочищенный сухой ферментный препарат, обладающий пектолитической активностью, микроорганизм-продуцент __ плесневый гриб Aspergillus foetidus, культивированный поверхностным способом.

Принципиальная схема получения ферментных препаратов приведена на рис.22. Схема очистки фермента от балластных веществ сводится к освобождению его от нерастворимых, сопутствующих растворимых веществ и других ферментов. Из поверхностных культур труднее получить высокоочищенные препараты, так как они содержат много балластных веществ. Из глубинных культур получать очищенные препараты легче. Схема очистки включает различные методы (концентрирование, диализ, осаждение органическими растворителями, солями, гель-фильтрование и др.).

Выпускаемые ферментные препараты представляют собой либо жидкости, либо порошки белого, серого или желтоватого цвета с определенной стандартной активностью ферментов.

Номенклатура отечественных ферментных препаратов:

Пх и Гх - неочищенная стандартная исходная культура продуцента.

П2х и Г2х – жидкий неочищенный концентрат растворимых веществ исходной культуры, освобожденный от нерастворимой части (П2х – концентрат с содержанием сухих веществ 50 %, Г2х – не более 40 %).

ПЗх и ГЗх __ сухие ферментные препараты, полученные высушиванием путем распыления неочищенного раствора фермента (экстракта поверхностной культуры или фильтрата глубинной культуры).

Препараты с маркировкой 2х и 3х являются техническими .

П10х и Г10х __ сухие очищенные препараты, полученные осаждением ферментов из водных растворов органическими растворителями или методом высаливания.

П15х, Г15х __ очищенные ферментные препараты, получены различными методами очистки и фракционирования ферментов.

П20х, Г20х __ высокоочищенные , но не кристаллические ферментные препараты, содержащие до 20-25 % балластных веществ, полученные методом концентрирования и очистки на ультрафильтрационных установках с последующей распылительной сушкой.

Препараты с индексом выше 20х в номенклатуре не используются, так как речь в этих случаях идет о высокоочищенных и даже гомогенных ферментных препаратах, которые именуются в классификации ферментов.

Любой ферментный препарат должен быть охарактеризован по его ферментативной активности, обычно выражаемой в стандартных единицах. Стандартная единица активности __ это такое количество фермента, которое катализирует превращение одного микромоля субстрата за единицу времени (1мин.) в стандартных условиях (температура 30 оС).

В бродильных производствах широко используются следующие ферментные препараты:

Амилолитического действия (Амилоризин Пх, П3х, П10х; Амилосубтилин Г3х, Г10х, Г20х; Глюкоаваморин Пх и др.);

Протеолитического действия (Протосубтилин Г20х, Протооризин П10х);

Цитолитического действия (Цитороземин Пх, П10х; Целловиридин Г3х, П10х; Целлоконингин П10х и др.);

Пектолитического действия (Пектаваморин Г3х, Пектофоетидин Г3х, Г10х, Г20х).

В производстве спирта замена солода ферментными препаратами позволяет сэкономить ценное пищевой сырье, снизить капитальные расходы на строительство солодовен, улучшить условия труда работающих, ускорить технологические процессы, увеличить выход готовой продукции .

В пивоварении применение ферментных препаратов позволяет перерабатывать повышенное количество несоложеного сырья, повысить коллоидную стойкость пива.

В производстве соков и вин препараты ферментов применяют для обработки мезги с целью повышения выхода сока, а также для осветления соков и виноматериалов.

5 Иммобилизованные ферменты

В настоящее время ферментные препараты широко применяются в различных отраслях промышленности. Однако ферментные препараты __ дорогостоящие катализаторы. Кроме того, так как они растворимы, использовать их можно только однократно. Поэтому, невозможно перевести периодические процессы на непрерывные, остановить ферментативную реакцию в нужный момент.

Перспективным является использование иммобилизованных ферментов . Они представляют собой нерастворимые биокатализаторы, в которых фермент связан с каким-либо носителем или заключен в матрицы либо микрокапсулы. При этом ферменты сохраняют свою активность и специфичность, становятся более устойчивыми к реакции среды, могут участвовать в непрерывных процессах, использоваться многократно.

Носители, с которым связан фермент, должны быть нерастворимыми, обладать химической и биологической стойкостью, высокой механической прочностью, зернистые носители иметь однородную форму и большую удельную поверхность. В качестве носителей используют природные полимеры (производные целлюлозы, агарозы, декстрана), синтетические (полистирол, акриламид, нейлон), а также пористое стекло, окисленные металлы, глину, силикагелъ, ткань, бумагу и др.

Иммобилизация ферментов может быть осуществлена двумя способами: без образования ковалентных связей между матрицей и белковой молекулой фермента (физические методы) и с образованием ковалентной связи (химические методы).

Физические методы иммобилизации . Для получения стабильных нерастворимых форм ферментов широко используется способность белков адсорбироваться на различных поверхностях. Часто сорбция ферментов бывает малоэффективной из-за того, что близки изоэлектрическая точка белка и оптимум рН каталитической активности. Прочная сорбция наблюдается лишь в тех областях рН, где мала каталитическая активность. Чтобы преодолеть это противоречие, предложен метод иммобилизации предварительно модифицированных (путем введения ионогенных групп) белков. Модификация приводит к сдвигу изоэлектрической точки ферментативного белка, при этом его каталитическая активность практически не меняется. В результате модифицированный фермент хорошо сорбируется на носителях.

Химические методы . Иммобилизация ферментов путем образования новых ковалентных связей является в настоящее время доминирующим способом получения биокатализаторов длительного действия. Преимущества этого способа в том, что фермент не переходит в раствор даже при очень длительном использовании. Химический способ является основным при получении иммобилизованных ферментных препаратов.

Химическая иммобилизация может быть осуществлена как на полимерном носителе, так и за счет поперечной сшивки молекул белка без использования носителя. В последнем случае возможно получать нерастворимые препараты с высокой удельной активностью, однако по своим технологическим свойствам они малоперспективны для промышленного применения.

Традиционным является химический метод образования ковалентной связи между носителем и ферментативным белком за счет химического взаимодействия. Наиболее частыми здесь являются реакции ацилирования, алкилирования, окислительно-восстановительные, радикальные, образования иминов.

Иммобилизованные ферменты по своим свойствам отличаются от нативных, так как в результате иммобилизации изменяется пространственная структура белковой молекулы. Активность иммобилизованных ферментов в большинстве случаев уменьшается за счет модификации молекулы фермента, экранирования активного центра. Но, несмотря на это, иммобилизация приводит к повышению стабильности ферментов в более широком диапазоне рН и температуры, что важно при длительном использовании ферментов, а также к стабильности их при хранении.

Положительным является и то, что иммобилизованные ферменты более устойчивы к действию ингибиторов. Оптимальные значения рН и температуры не меняются. При иммобилизации в пористых носителях ферменты становятся недоступными для действия микроорганизмов, так как размеры пор носителя меньше размеров клеток микроорганизмов.

Контрольные вопросы

1 Поясните роль гидролитичеких ферментов в технологии бродильных производств.

2 Охарактеризуйте действие гидролитических ферментов на крахмал, некрахмальные полисахариды, белки.

3 Укажите оптимальные параметры действия амилолитических, протеолитических, цитолитических ферментов.

4 Назовите основные продукты гидролиза крахмала, белков, гемицеллюлоз, пектиновых и гумми-веществ.

5 Охарактеризуйте роль амилаз, протеаз, цитаз, пектолитических ферментов в производстве напитков брожения .

6 Поясните, чем ферментный препарат отличается от фермента.

7 Как складывается название ферментного препарата.

8 Назовите основные бродильные производства, где используются ферментные препараты, и с какой целью.

9 Что такое иммобилизация ферментов.

10 Какие преимущества имеют иммобилизованные ферменты по сравнению с растворимыми.

3 МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ИЗУЧЕНИЮ ДИСЦИПЛИНЫ

«Общая технология отрасли» (ОТО) является первой среди комплекса профилирующих дисциплин, где студенты знакомятся, что такое технология вообще и технология бродильных производств, в частности. Курс базируется на знаниях, полученных ранее при изучении химии, биохимии, микробиологии, процессов и аппаратов пищевых производств.

Освоение материала данной дисциплины позволяет студенту приобрести знания теоретических основ технологии бродильных производств, закономерностей роста и развития микроорганизмов, характеристик и свойств сырья, ферментов.

Работа по изучению курса ОТО должна быть регулярной, последовательной и систематичной. Необходимо проработать курс лекций, а также специальную литературу, список которой приведен в конце методического комплекса.

Изучение того или иного материала должно быть активным, действенным , т. е. каждое понятие, теоретическое положение, практический прием должны быть поняты и уяснены глубоко и детально.

При изучении курса следует идти от уяснения общего к детальному разбору частного с последующей повторной оценкой общего на более высоком уровне.

Глубину самостоятельного усвоения основного материала можно проверить по вопросам для самоконтроля, приведенным после каждой темы лекций.

4 МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ВЫПОЛНЕНИЮ КОНТРОЛЬНЫХ РАБОТ

Контрольные работы, выполняемые студентами во время самостоятельного изучения дисциплины, дают представление о степени подготовленности студентов, об их умении работать со специальной литературой и излагать материал в письменном виде, и позволяют судить об общей эрудиции и грамотности обучающихся.

Контрольные работы выполняют в виде подробных рукописных или печатных рефератов, иллюстрированных схемами, графиками, диаграммами, рисунками, которые могут быть заимствованы из специальной литературы (учебников, учебных пособий , научных и отраслевых журналов). Недопустимо механическое, дословное переписывание материала из учебников и других литературных источников.

2 Биохимические процессы, идущие в зерне при хранении: послеуборочное дозревание, дыхание, самосогревание.

Вариант 9

1 Строение дрожжевой клетки.

2 Способы хранения зерна.

Вариант 10

1 Химический состав дрожжевой клетки.

2 Режимы хранения зерна.

Вариант 11

1 Химический состав и строение биомембран по современным представлениям.

2 Меласса: характеристика, виды, химический состав.

Вариант 12

1 Способы переноса веществ через мембрану

2 Хмель: характеристика, строение, химический состав, хранение.

Вариант 13

1 Производственная инфекция, ее источники.

2 Картофель: характеристика, строение, химический состав.

Вариант 14

1 Метаболизм дрожжевой клетки.

2 Виноград: строение, химический состав.

Вариант 15

1 Схема спиртового брожения.

2 Виды сырья, применяемые в производстве пива, кваса, спирта, вина, хлебопекарных дрожжей.

Вариант 16

1 Вторичные и побочные продукты спиртового брожения.

Вариант 17

1 Дрожжи верхового и низового брожения, их сравнительная характеристика.

2 Способы и режимы хранения картофеля.

Вариант 18

1 Расы дрожжей, применяемые в производстве спирта, пива, вина, хлебопекарных дрожжей и требования к ним.

2 Доставка и хранение мелассы.

Вариант 19

1 Условия роста и размножения дрожжей. Чистая культура дрожжей.

2 Химизм и основные продукты дыхания.

Вариант 20

1 Функции биомембран.

2 Вредители зерна, борьба с ними.

Вариант 21

1 Показатели общего значения зерновых культур.

2 Влияние рН, активаторов и ингибиторов на жизнедеятельность микроорганизмов.

Вариант 22

1 Показатели технологического значения зерновых культур.

Вариант 12

1 Окисляемость воды. Содержание сухого остатка.

2 Ферментные препараты: их характеристика и номенклатура.

Вариант 13

1 Биологические показатели воды.

2 Применение ферментных препаратов в производстве пива, спирта.

Вариант 14

1Требования к воде в производстве ликероводочных и безалкогольных напитков.

2 Микроорганизмы-продуценты ферментов.

Вариант 15

1 Подготовка воды в бродильных производствах. Коагуляция коллоидов, дезодорация воды, обезжелезивание.

2 Иммобилизованные ферменты.

Вариант 16

1 Способы умягчения воды.

1 Применение ферментных препаратов в производстве вин и ликероводочных изделий.

Вариант 17

1 Способы обеззараживания воды.

2 Принципиальная схема производства ферментных препаратов.

Вариант 18

1Требования к воде в производстве солода.

2 Способы снижения жесткости воды: термический, реагентный, ионообменный.

Вариант 19

1 Способы осветления воды.

2 Механизм действия ферментов.

Вариант 20

1 Ферменты зерновых культур.

2 Показатели воды производственного назначения.

Вариант 21

1Ферменты микроорганизмов.

2 Требования к воде в различных бродильных производствах.

Вариант 22

1 Ферментативный гидролиз крахмала.

2 Способы умягчения воды обратным осмосом, электродиализом.

Вариант 23

1 Ферментативный гидролиз белков.

2 Биологические способы очистки сточных вод.

Вариант 24

1 Гидролиз некрахмальных полисахаридов.

2 Показатели загрязненности сточных вод.

Вариант 25

1 Пектиновые вещества и их гидролиз.

2 Сточные воды предприятий бродильной промышленности.

5 ВОПРОСЫ К ЭКЗАМЕНУ

1 Микроорганизмы, используемые в бродильных производствах.

2 Стадии развития культур микроорганизмов.

3 Методы культивирования микроорганизмов: периодический и непрерывный.

4 Влияние на жизнедеятельность микроорганизмов окислительно-восстановительного потенциала.

5 Влияние температуры на рост и размножение микроорганизмов.

6 Влияние концентрации сухих веществ среды на жизнедеятельность микроорганизмов. Плазмолиз, плазмоптис.

7 Взаимоотношения микроорганизмов: симбиоз, метабиоз, антагонизм.

8 Строение дрожжевой клетки.

9 Химический состав дрожжевой клетки.

10 Химический состав и строение биомембран по современным представлениям.

11 Функции биомембран.

12 Транспорт веществ в клетку, виды транспорта.

13 Способы переноса веществ через мембрану (юнипорт, симпорт, антипорт).

14 Производственная инфекция, ее источники. Способы дезинфекции.

15 Основные свойства ферментов как катализаторов и белковых веществ.

16 Классификация ферментов по типу катализируемых реакций.

17 Регулирование активности ферментов: конкурентные, неконкурентные ингибиторы, аллостерические регуляторы.

18 Каталитическая активность ферментов. Стандартная единица активности фермента, удельная активность.

19 Влияние температуры и рН на активность ферментов.

20 Влияние концентрации субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции.

21 Действие гидролитических ферментов: ферментативный гидролиз крахмала, гидролиз некрахмальных полисахаридов, гидролиз белков.

22 Ферменты зерновых культур и микроорганизмов.

23 Ферментные препараты и их номенклатура.

24 Применение ферментных препаратов в производстве пива, спирта, в виноделии.

25 Метаболизм дрожжевой клетки.

26 Оптимальные условия жизнедеятельности дрожжей.

27 Схема спиртового брожения.

28 Вторичные и побочные продукты спиртового брожения.

29 Дрожжи верхового и низового брожения, их характеристика.

30 Расы дрожжей, применяемые в производстве спирта, пива, вина, хлебопекарных дрожжей и требования к ним.

31 Классификация сырья в бродильных производствах.

32 Экономические и технологические требования, предъявляемые к сырью в бродильных производствах.

33 Виды сырья, применяемые в производстве пива, спирта, вина, хлебопекарных дрожжей.

34 Виды зерновых культур.

35 Строение зерна (на примере ячменя).

36 Химический состав зерновых культур.

37 Физические свойства зерновой массы.

38 Биохимические процессы, идущие в зерне при хранении: послеуборочное дозревание, дыхание, самосогревание.

39 Способы хранения зерна.

40 Режимы хранения зерна.

41 Вредители зерна, борьба с ними.

42 Х мель, виноград, картофель: химический состав и хранение.

43 Химический состав мелассы и условия хранения.

44 Характеристика природных вод. Примеси воды.

45 Использование воды в производстве. Общие требования к воде.

46 Жесткость воды: временная, постоянная, общая. Единицы измерения.

47 Щелочность воды.

48 Окисляемость воды. Содержание сухого остатка.

49 Биологические показатели воды.

50 Технологическое назначение воды. Требования к воде в производстве пива, спирта, солода, хлебопекарных дрожжей.

51 Требования к воде в производстве ликероводочных и безалкогольных напитков.

52 Подготовка воды в бродильных производствах. Коагуляция коллоидов, дезодорация воды, обезжелезивание.

53 Способы умягчения воды.

54 Способы обеззараживания воды.

55 Сточные воды бродильных производств, их характеристика. ХПК, БПК.

56 Очистка сточных вод бродильных производств.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИИЙ СПИСОК

1 Болдырев в биохимию мембран.__ М.: Высшая школа, 1986.__ 112 с.

2 Вода и сточные воды в пищевой промышленности .– М.: Пищевая промышленность, 1972. – 384 с.

3 Грачева ферментных препаратов. – М.: Агропромиздат, 1987. – 335 с.

4 Достижения в технологии солода и пива/ Под ред. КолпакчиА. И. __ М.: Пищевая промышленность, Прага: СНТЛ-Издат. технической литературы , 1980. __ 351 с.

5 , Бакушинская микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности.– М.: Пищевая промышленность, 1977. – 501 с

6 , Фараджева: их роль в технологии пищевых продуктов. __ Воронеж: Изд. ВГУ, 1999. __ 118 с.

7 Лхотский А. Ферменты в пивоварении. __ М.: Пищевая промышленность, 1975. __ 318 с.

8 Мальцев бродильных производств.– М.: Легкая и пищевая промышленность, 1980.– 560 с.

9 Методы исследования качества сырья, полупродуктов и готовой продукции бродильных производств. Ч.1. «Анализ сырья бродильных производств» Лабораторный практикум. , Пермякова ТИПП. __ Кемерово, 2001. – 67 с.

10 , Шишацкий хлебопекарных дрожжей. Справочник. __ М.: Агропромиздат, 1990. – 335 с.

11 Справочник по производству спирта. Сырье, технология и технохимконтроль/ , и др. __ М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981.– 336 с.

12 , Федоров технология бродильных производств. __ М.: Колос, 2002. __ 408 с.

13 Ферментные препараты в пищевой промышленности. /Под ред. и. – М.: Пищевая промышленность, 1975. – 535 с.

14 Хмель и хмелевые препараты в пище-вой промышленности /, и др. – М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. – 168 с.

15 , Пономарев переработки винограда. – М.: Агропромиздат, 1990. – 447 с.