ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, совокупность методов биохимии и молекулярной генетики, с помощью которых осуществляется направленное комбинирование генетической информации любых организмов. Генетическая инженерия позволяет преодолевать природные межвидовые барьеры, препятствующие обмену генетической информацией между таксономически удалёнными видами организмов, и создавать клетки и организмы с не существующими в природе сочетаниями генов, с заданными наследуемыми свойствами. Главным объектом генно-инженерного воздействия является носитель генетической информации - дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), молекула которой обычно состоит из двух цепей. Строгая специфичность спаривания пуриновых и пиримидиновых оснований обусловливает свойство комплементарности - взаимного соответствия нуклеотидов в двух цепях. Создание новых сочетаний генов оказалось возможным благодаря принципиальному сходству строения молекул ДНК у всех видов организмов, а фактическая универсальность генетические кода обеспечивает экспрессию чужеродных генов (проявление их функциональной активности) в любых видах клеток. Этому способствовало также накопление знаний в области химии нуклеиновых кислот, выявление молекулярных особенностей организации и функционирования генов (в том числе установление механизмов регуляции их экспрессии и возможности подчинения генов действию «чужих» регуляторных элементов), разработка методов секвенирования ДНК, открытие полимеразной цепной реакции, позволившей быстро синтезировать любой фрагмент ДНК. Важными предпосылками для появления генетической инженерии явились: открытие плазмид, способных к автономной репликации и переходу из одной бактериальной клетки в другую, и явления трансдукции - переноса некоторых генов бактериофагами, что позволило сформулировать представление о векторах: молекулах - переносчиках генов. Огромное значение в развитии методологии генетической инженерии сыграли ферменты, участвующие в преобразовании нуклеиновых кислот: рестриктазы (узнают в молекулах ДНК строго определённые последовательности - сайты - и «разрезают» двойную цепь в этих местах), ДНК-лигазы (ковалентно связывают отдельные фрагменты ДНК), обратная транскриптаза (синтезирует на матрице РНК комплементарную копию ДНК, или кДНК) и др. Только при их наличии создание искусственных структур стало технически выполнимой задачей. Ферменты используются для получения индивидуальных фрагментов ДНК (генов) и создания молекулярных гибридов - рекомбинантных ДНК (рекДНК) на основе ДНК плазмид и вирусов. Последние доставляют нужный ген в клетку хозяина, обеспечивая там его размножение (клонирование) и образование конечного продукта гена (его экспрессию).

Принципы создания рекомбинантных молекул ДНК. Термин «генетическая инженерия» получил распространение после того, как в 1972 году П. Бергом с сотрудниками впервые была получена рекомбинантная ДНК, представлявшая собой гибрид, в котором были соединены фрагменты ДНК бактерии кишечной палочки, её вируса (бактериофага λ) и ДНК обезьяньего вируса SV40 (рис. 1). В 1973 году С. Коэн с сотрудниками использовали плазмиду pSC101 и рестриктазу (EcoRI), которая разрывает её в одном месте таким образом, что на концах двухцепочечной молекулы ДНК образуются короткие комплементарные одноцепочечные «хвосты» (обычно 4-6 нуклеотидов). Их назвали «липкими», поскольку они могут спариваться (как бы слипаться) друг с другом. Когда такую ДНК смешивали с фрагментами чужеродной ДНК, обработанной той же рестриктазой и имеющей такие же липкие концы, получались новые гибридные плазмиды, каждая из которых содержала, по крайней мере, один фрагмент чужеродной ДНК, встроенной в EcoRI-сайт плазмиды (рис. 2). Стало очевидным, что в такие плазмиды можно встраивать фрагменты разнообразных чужеродных ДНК, полученных как из микроорганизмов, так и из высших эукариот.

Основной современной стратегии получения рекДНК сводится к следующему:

1) в ДНК плазмиды или вируса, способных размножаться независимо от хромосомы, встраивают принадлежащие другому организму фрагменты ДНК, содержащие определённые гены или искусственно полученные последовательности нуклеотидов, представляющие интерес для исследователя;

2) образующиеся при этом гибридные молекулы вводят в чувствительные прокариотические или эукариотические клетки, где они реплицируются (размножаются, амплифицируются) вместе со встроенными в них фрагментами ДНК;

3) отбирают клоны клеток в виде колоний на специальных питательных средах (или вирусов в виде зон просветления - бляшек на слое сплошного роста клеток бактерий или культур тканей животных), содержащие нужные типы молекул рекДНК и подвергают их разностороннему структурно-функциональному изучению. Для облегчения отбора клеток, в которых присутствует рекДНК, используют векторы, содержащие один и более маркеров. У плазмид, например, такими маркерами могут служить гены устойчивости к антибиотикам (отбор клеток, содержащих рекДНК, проводят по их способности расти в присутствии того или иного антибиотика). РекДНК, несущие нужные гены, отбирают и вводят в реципиентные клетки. С этого момента начинается молекулярное клонирование - получение копий рекДНК, а следовательно, и копий целевых генов в её составе. Только при возможности разделения всех трансфицированных или инфицированных клеток каждый клон будет представлен отдельной колонией клеток и содержать определённую рекДНК. На заключительном этапе производится идентификация (поиск) клонов, в которых заключён нужный ген. Она основывается на том, что вставка в рекДНК детерминирует какое-то уникальное свойство содержащей его клетки (например, продукт экспрессии встроенного гена). В опытах по молекулярному клонированию соблюдаются 2 основных принципа: ни одна из клеток, где происходит клонирование рекДНК, не должна получить более одной плазмидной молекулы или вирусной частицы; последние должны быть способны к репликации.

В качестве векторных молекул в генетической инженерии используется широкий спектр плазмидных и вирусных ДНК. Наиболее популярны клонирующие векторы, содержащие несколько генетических маркеров и имеющие по одному месту действия для разных рестриктаз. Таким требованиям, например, лучше всего отвечает плазмида pBR322, которая была сконструирована из исходно существующей в природе плазмиды с помощью методов, применяемых при работе с рекДНК; она содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину, а также по одному сайту узнавания для 19 разных рестриктаз. Частным случаем клонирующих векторов являются экспрессирующие векторы, которые наряду с амплификацией обеспечивают правильную и эффективную экспрессию чужеродных генов в реципиентных клетках. В ряде случаев молекулярные векторы могут обеспечивать интеграцию чужеродной ДНК в геном клетки или вируса (их называют интегративными векторами).

Одна из важнейших задач генетической инженерии - создание штаммов бактерий или дрожжей, линий клеток тканей животных или растений, а также трансгенных растений и животных (смотри Трансгенные организмы), которые обеспечивали бы эффективную экспрессию клонируемых в них генов. Высокий уровень продукции белков достигается в том случае, если гены клонируются в многокопийных векторах, т.к. при этом целевой ген будет находиться в клетке в большом количестве. Важно, чтобы кодирующая последовательность ДНК находилась под контролем промотора, который эффективно узнаётся РНК-полимеразой клетки, а образующаяся мРНК была бы относительно стабильной и эффективно транслировалась. Кроме того, чужеродный белок, синтезируемый в реципиентных клетках, не должен подвергаться быстрой деградации внутриклеточными протеазами. При создании трансгенных животных и растений часто добиваются тканеспецифичной экспрессии вводимых целевых генов.

Поскольку генетический код универсален, возможность экспрессии гена определяется лишь наличием в его составе сигналов инициации и терминации транскрипции и трансляции, правильно узнаваемых хозяйской клеткой. Т. к. большинство генов высших эукариот имеет прерывистую экзон-интронную структуру, в результате транскрипции таких генов образуется матричная РНК-предшественник (пре-мРНК), из которой при последующем сплайсинге выщепляются некодирующие последовательности - интроны и образуется зрелая мРНК. Такие гены не могут экспрессироваться в клетках бактерий, где отсутствует система сплайсинга. Для того чтобы преодолеть это препятствие, на молекулах зрелой мРНК с помощью обратной транскриптазы синтезируют ДНК-копию (кДНК), к которой с помощью ДНК-полимеразы достраивается вторая цепь. Такие фрагменты ДНК, соответствующие кодирующей последовательности генов (уже не разделённой нитронами), можно встраивать в подходящий молекулярный вектор.

Зная аминокислотную последовательность целевого полипептида, можно синтезировать кодирующую его нуклеотидную последовательность, получив так называемый ген-эквивалент, и встроить его в соответствующий экспрессирующий вектор. При создании гена-эквивалента обычно учитывают свойство вырожденности генетического кода (20 аминокислот кодируются 61 кодоном) и частоту встречаемости кодонов для каждой аминокислоты в тех клетках, в которые планируется вводить этот ген, так как состав кодонов может существенно отличаться у разных организмов. Правильно подобранные кодоны могут значительно повысить продукцию целевого белка в реципиентной клетке.

Значение генетической инженерии. Генетическая инженерия значительно расширила экспериментальные границы молекулярной биологии, поскольку стало возможным вводить в различные типы клеток чужеродную ДНК и исследовать её функции. Это позволило выявлять общебиологические закономерности организации и выражения генетической информации в различных организмах. Данный подход открыл перспективы создания принципиально новых микробиологических продуцентов биологически активных веществ, а также животных и растений, несущих функционально активные чужеродные гены. Многие ранее недоступные биологически активные белки человека, в том числе интерфероны, интерлейкины, пептидные гормоны, факторы крови, стали нарабатываться в больших количествах в клетках бактерий, дрожжей или млекопитающих и широко использоваться в медицине. Более того, появилась возможность искусственно создавать гены, кодирующие химерные полипептиды, обладающие свойствами двух или более природных белков. Всё это дало мощный импульс к развитию биотехнологии.

Главными объектами генетической инженерии являются бактерии Escherichia coli (кишечная палочка) и Bacilltis subtilis (сенная палочка), пекарские дрожжи Saccharomices cerevisiae, различные линии клеток млекопитающих. Спектр объектов генно-инженерного воздействия постоянно расширяется. Интенсивно развиваются направления исследований по созданию трансгенных растений и животных. Методами генетической инженерии создаются новейшие поколения вакцин против различных инфекционных агентов (первая из них была создана на основе дрожжей, продуцирующих поверхностный белок вируса гепатита В человека). Большое внимание уделяется разработке клонирующих векторов на основе вирусов млекопитающих и использованию их для создания живых поливалентных вакцин для нужд ветеринарии и медицины, а также в качестве молекулярных векторов для генной терапии раковых опухолей и наследственных заболеваний. Разработан метод прямого введения в организм человека и животных рекДНК, направляющих продукцию в их клетках антигенов различных инфекционных агентов (ДНК-вакцинация). Новейшим направлением генетической инженерии является создание съедобных вакцин на основе трансгенных растений, таких как томаты, морковь, картофель, кукуруза, салат и др., продуцирующих иммуногенные белки возбудителей инфекций.

Опасения, связанные с проведением генно-инженерных экспериментов. Вскоре после первых успешных экспериментов по получению рекДНК группа учёных во главе с П. Бергом предложила ограничить проведение ряда генно-инженерных опытов. Эти опасения основывались на том, что свойства организмов, содержащих чужую генетическую информацию, трудно предсказать. Они могут приобрести нежелательные признаки, нарушить экологическое равновесие, привести к возникновению и распространению необычных заболеваний человека, животных, растений. Кроме того, отмечалось, что вмешательство человека в генетический аппарат живых организмов аморально и может вызвать нежелательные социальные и этические последствия. В 1975 году эти проблемы обсуждались на международной конференции в Асиломаре (США). Её участники пришли к заключению о необходимости продолжения использования методов генетической инженерии, но при обязательном соблюдении определённых правил и рекомендаций. Впоследствии эти правила, установленные в ряде стран, были существенно смягчены и свелись к приёмам, обычным в микробиологических исследованиях, созданию специальных защитных устройств, препятствующих распространению биологических агентов в окружающей среде, использованию безопасных векторов и реципиентных клеток, не размножающихся в природных условиях.

Часто под генетической инженерией понимают только работу с рекДНК, а как синонимы генетической инженерии используются термины «молекулярное клонирование», «клонирование ДНК», «клонирование генов». Однако все эти понятия отражают содержание лишь отдельных генно-инженерных операций и поэтому не эквивалентны термину «генетическая инженерия». В России как синоним генетической инженерии широко используется термин «генная инженерия». Однако смысловое содержание этих терминов различно: генетическая инженерия ставит целью создание организмов с новой генетической программой, в то время как термин «генная инженерия» поясняет, как это делается - путём манипуляции с генами.

Лит.: Щелкунов С. Н. Клонирование генов. Новосиб., 1986; он же. Генетическая инженерия. 2-е изд., Новосиб., 2004; Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д. Рекомбинантные ДНК. М., 1986; Клонирование ДНК. Методы. М., 1988; Новое в клонировании ДНК: Методы. М., 1989.

Генетическая (генная) инженерия

Генетическая (генная) инженерия – конструирование искусственным путем генетических структур и наследственно измененных организмов. Генетическая инженерия – раздел (прикладная ветвь) молекулярной генетики, связанный с целенаправленным созданием новых молекул ДНК, способных размножаться в клетке-хозяине. При этом происходит искусственное, целенаправленное изменение генотипа организма (микроорганизма) и формирование новых признаков и свойств. Генная инженерия занимается рашифровкой структуры генов, их синтезом и клонированием, вставкой выделенных из клеток живых организмов генов в клетки растений и животных с целью направленного изменения их генетических особенностей.

Хорошо разработанными методами генной инженерии являются трансгенез, микробиологический синтез и др.

Трансгенез – перенос генов от одного вида организмов в другой. Трансгенез осуществляется путем разрезания и сшивания участков ДНК при участии ферментов – рестриктаз и лигаз.

Этапы трансгенеза :

а) выделение генов (фрагментов ДНК) из клеток бактерий, растений или животных с помощью фермента рестриктазы ;

б) соединение (сшивание) генов (фрагментов ДНК) с плазмидой с помощью фермента лигазы ;

в) введение гибридной плазмидной ДНК, содержащей нужный ген в клетку хозяина;

г) копирование (клонирование) этого гена в клетке хозяина и обеспечение его работы по схеме: «Код ДНК – транскрипция – трансляция – белок»

Инструментами генной инженерии являются открытые в 1974 г ферменты – рестриктазы (рестрикционные эндонуклеазы). Рестриктазы узнают участки (сайты) ДНК, вносят разрезы в цепях ДНК. На концах каждого фрагмента образуются одноцепочечные хвосты, называемые «липкими концами», поскольку они могут, как бы слипаться между собой вследствие комплементарности.

Рестриктазы узнают в двухцепочечной ДНК определенную, только свою последовательность нуклеотидов ДНК. Затем рестриктаза прикрепляется к распознаваемому участку нуклеотидов и разрезает его в месте прикрепления. Чаще рестриктазы распознают в молекуле ДНК участки длиной в 4–6 пар нуклеотидов и разрезают обе цепи ДНК посередине этих участков или обычно со смещением. Примеры рестриктаз : рестриктаза Eco RI , которая узнает фрагмент ДНК из шести нуклеотидов ГААТТЦ (место разреза между нуклеотидами Г и А обеих цепей ДНК); рестриктаза Hind III распознает участок ААГЦТТ (место разреза между нуклеотидами А и А обеих цепей ДНК); рестриктаза Bam I распознает участок ГГАТЦЦ (место разреза между нуклеотидами Г и Г обеих цепей ДНК); рестриктаза Hae III распознает участок ГГЦЦ (место разреза между нуклеотидами Г и Ц обеих цепей ДНК); рестриктаза Hpa II распознает участок ЦЦГГ(место разреза между нуклеотидами Ц и Ц обеих цепей ДНК).

Далее для конструирования генетически измененного организма необходимо ввести нужный ген в клетку этого организма. Введение чужеродных генов в организм осуществляется с помощью плазмидного вектора . Вектором является плазмида – маленькая кольцевая молекула ДНК, которую извлекают из цитоплазмы бактериальной клетки. Плазмиды – факторы наследственности, расположенные вне хромосом, представляющие собой внехромосомную ДНК .

Рис . 37.

А – Схема введения чужеродной ДНК в бактериальную плазмиду с использованием ферментов (рестрикционной эндонуклеазы и лигазы).

Б – Схема переноса гена человека, ответственного за синтез гормона инсулина и образование векторной ДНК.

Свойства плазмиды: 1) обладает способностью к автономной репликации; 2) содержит гены, кодирующие антибиотики; 3) способны встраиваться в хромосому клетки-реципиента; 4) распознает участки ДНК, которые могут разрезать ферменты - рестриктазы; 5) рестриктаза может разрезать плазмиду и переводить ее в линейное состояние. Эти свойства плазмиды исследователи используют для получения рекомбинантных (гибридных) ДНК.

Последовательность введения ДНК в плазмиду (плазмидный вектор) с помощью фермента рестриктазы (рис. 37 А):

1) рестрикция – разрезание молекулы ДНК рестриктазой, образование фрагментов ДНК и выделение необходимого гена ;

2) включение выделенного гена в плазмиду , т. е. получение рекомбинантной (гибридной) ДНК путем введения фрагмента чужеродной ДНК в плазмиду;

3) лигирование – сшивание ферментом лигазой плазмидного (векторного) и чужеродного фрагментов ДНК; при этом концы векторной и чужеродной ДНК (т. н. «клейкие концы») комплементарны друг другу;

4) трансформация – введение рекомбинантной плазмиды в геном другой клетки (клетки-реципиента), в частности, бактериальной клетки.

Следует отметить, что плазмиды проникают лишь в часть обработанных бактерий. Трансформированные бактерии вместе с плазмидами приобретают устойчивость к определенному антибиотику, что позволяет их отделить от нетрансформированных, погибающих на среде, содержащей антибиотик. Каждая из трансформированных бактерий, помещенная на питательную среду, размножается и образует колонию из многих тысяч потомков – клон.

5) скрининг – отбор среди трансформированных бактерий тех, которые содержат плазмиды с нужным геном.

Трансгенные животные и растения

Клонированные гены с помощью микроинъекции вводят в яйцеклетку млекопитающих или протопласты растений (изолированная клетка, лишенная клеточной стенки) и далее из них выращивают животных, или растения, в геноме которых действуют чужеродные гены. Растения и животные, геном которых изменен путем генноинженерных операций, получили название трансгенных организов (трансгенных растений и животных) , поскольку в нем содержатся чужеродные гены. Получены трансгенные мыши, кролики, свиньи, овцы. В их геноме работают гены бактерий, млекопитающих, человека. Получены трансгенные растения (кукуруза, перец, томаты, пшеница, рожь, бобовые, картофель и др.), содержащие гены неродственных видов. Трансгенные растения устойчивы к гербицидам, насекомым, неблагоприятным погным условиям и др. Постепенно решается проблема изменения наследственности многих сельскохозяйственных растений.

Генетическая карта хромосом. Генная терапия

Генетической картой хромосом называют схему взаимного расположения генов, находящихся в одной группе сцепления. Такие карты составляются для каждой пары гомологичных хромосом. На генетической карте указан порядок расположения генов в хромосоме и расстояния между ними (процент кроссинговера между определенными генами). Так создание новых штаммов микроорганизмов, способных синтезировать гормоны, белки, лекарственные препараты основывается на знании генетических карт микроорганизмов. Генетические карты человека необходимы для медицинской генетики. Знания о локализации гена в определенной хромосоме используются при диагностике ряда наследственных заболеваний, а также в генной терапии для исправления структуры и функции генов.

Генная терапия – замена дефектных генов на неповрежденные, или исправление их структуры.

Для борьбы с наследственными, онкологическими и возрастными заболеваниями разрабатываются методы генной терапии, безопасные для клеток человека. С использованием методов генной терапии можно заменять в организме дефектные гены, в которых произошли точковые мутации, на неповрежденные. В наше время ученые осваивают методы биобезопасности человека: внедрение нужных генов в клетки организма человека. Это позволит избавиться от многих наследственных заболеваний.

Микробиологический синтез

Методы генной инженерии позволили осуществить микробиологический синтез (рис. 37 Б). С помощью методов генной инжененрии микробиологи смогли получить штаммы бактерий, благодаря которым успешно осуществляется микробиологический синтез. Для этого производится отбор необходимых бактериальных клеток, не содержащих плазмид. Выделяются молекулы ДНК с заданной последовательностью нуклеотидов, определяющих развитие нужного признака. Плазмида с встроенным участком ДНК (геном) вводится в бактериальную клетку, в которой встроенный участок ДНК начинает работать (идут процессы репликации, транскрипции, трансляции), и в бактериальной клетке синтезируется нужный белок (интерферон, генферон, иммуноглобулин, инсулин, соматотропин и др.). В промышленных количествах получены гормоны (инсулин, соматотропин), многие аминокислоты, антибиотики, вакцины и др. Такие бактерии размножают в промышленных масшабах и производят необходимый белок.

С помощью генетических методов получен штамм микроорганизма Pseudomonas denitrificans, который производит в десятки раз больше витамина C, витаминов группы B, чем исходная форма; новый штамм бактерии микрококкус глутамикус выделяет в сотни раз больше аминокислоты лизина, чем исходная (дикая) культура лизинобразующей бактерии.

Клеточная инженерия

Клеточная инженерия – культивирование отдельных клеток или тканей на специальных искусственных средах, разработка методов создания клеток нового типа путем их гибридизации, замены хромосом и выращивание из них гибридов.

1. Метод культуры тканей

Метод заключается в культивировании изолированных клеток или кусочков тканей на искусственной питательной среде в соответствующих микроклиматических условиях. В результате культивирования растительные клетки или кусочки ткани регенерируют в целое растение. Путем микроклонального размножения отдельных клеток, или кусочков тканей (чаще верхушечной меристемы стебля или корня) можно получить множество полезных растений. Микроклиматические условия и питательные среды для регенерации декоративных, культурных, лекарственных растений подбираются экспериментально. Культура тканей также используется для получения диплоидных растений после обработки исходных гаплоидных форм колхицином.

2. Соматическая гибридизация

Соматическая гибридизация включает получение гибридных клеток, а из них – новых форм; искусственное оплодотворение яйцеклеток.

Получение новых гибридных растений путемслияния протопластов (ядро и цитоплазма) различных клеток в культуре тканей. Для слияния протопластов с помощью ферментов разрушают стенку растительной клетки и получают изолированный протопласт. При культивировании таких протопластов разных видов растений осуществляется их слияние и образование форм с новыми полезными признаками. Искусственное оплодотворение яйцеклеток осуществляют посредством метода экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), позволяющего произвести оплодотворение яйцеклеток в пробирке с последующей имплантацией эмбриона на ранней стадии развития, и преодолеть некоторые формы бесплодия у человека.

3. Хромосомная инженерия – замена отдельных хромосом в клетках растений или добавление новых. У диплоидов имеются пары гомологичных хромосом, и такие организмы называются дисомики. Если в одной какой-либо паре оставить одну хромосому, то формируется моносомик. Если добавить в какую-либо пару третью гомологичную хромосому, то формируется трисомик и т. д. Возможна замена отдельных хромосом одного вида на хромосомы другого вида. Полученные формы называются замещенными .

.(Источник: «Биология. Современная иллюстрированная энциклопедия.» Гл. ред. А. П. Горкин; М.: Росмэн, 2006.)

Смотреть что такое "генная инженерия" в других словарях:

Генная инженерия - раздел молекулярной генетики, связанный с целенаправленным созданием in vitro новых комбинаций генетического материала (рекомбинантной ДНК), способного к воспроизводству и функционированию в клетке хозяине. Источник … Словарь-справочник терминов нормативно-технической документации

То же, что генетическая инженерия … Большой Энциклопедический словарь

По определению ФЗ О государственном регулировании в области генно инженерной деятельности от 5 июня 1996 г. совокупность приемов, методов и технологий, в т.ч. технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по … Юридический словарь

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, методика создания молекулы ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты), с желаемым геном, которая затем вводится в клетку бактерии, грибка (дрожжей), растения или млекопитающего с тем, чтобы она вырабатывала требуемый белок. Методика… … Научно-технический энциклопедический словарь

Раздел генетики, разрабатывающий приемы манипуляцй с НК и использующий эти методы для генетических исследований и получения организмов со смешанными геномами, в т. ч. полезных для медицины и народного хозяйства. (Источник: «Словарь терминов… … Словарь микробиологии

Генная инженерия - совокупность методов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы;... Источник … Официальная терминология

генная инженерия - — Тематики биотехнологии EN biomolecular engineering … Справочник технического переводчика

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ - совокупность приемов, методов и технологий, в т.ч. технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых (РНК) и дезоксирибонуклеиновых (ДНК) кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие… … Юридическая энциклопедия

Термин генная инженерия Термин на английском genetic engineering Синонимы генетическая инженерия Аббревиатуры Связанные термины доставка генов, биоинженерия, биологические моторы, геном, ДНК, РНК, олигонуклеотид, плазмида, фермент, генная терапия … Энциклопедический словарь нанотехнологий

То же, что генетическая инженерия. * * * ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, то же, что генетическая инженерия (см. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ) … Энциклопедический словарь

генная инженерия - Gene Engineering Генная инженерия Технология рекомбинантных ДНК. Изменение с помощью биохимических и генетических методик хромосомного материала – основного наследственного вещества клеток. Хромосомный материал состоит из… … Толковый англо-русский словарь по нанотехнологии. - М.

Книги

• Генная инженерия в биотехнологии. Учебник , Журавлева Галина Анатольевна. Учебник`Генная инженерия в биотехнологии` подготовлен в соответствии с ФГОС ВПО по специальности 020400`Биология` и основан на лекциях, читаемых уже более 10 лет на биологическом факультете…

Министерство Сельского Хозяйства Российской Федерации

ФГОУ ВПО «Уральская Государственная сельскохозяйственная Академия»

по дисциплине «Ветеринарная генетика»

на тему: «Генная инженерия – настоящее и будущее»

Выполнила:

Студентка ФВМ

2 курс 2 группа 3 п/группа

Шмакова Т.С.

Проверила:

Ерофеева Л.Ф.

Екатеринбург 2008

Введение

1. Методы генной инженерии

2. Достижения генной инженерии

3. Генная инженерия: за и против

4. Перспективы генной инженерии

Список использованной литературы

Введение

Генная инженерия – совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого организма.

Генная инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя исследования таких биологических наук, как молекулярная биология, цитология, генетика, микробиология. Самым ярким событием, привлёкшим наибольшее внимание и очень важным по своим последствиям, была серия открытий, результатом которых явилось создание методов управления наследственностью живых организмов, причём управления путём проникновения в «святая святых» живой клетки – в её генетический аппарат.

Современный уровень наших знаний биохимии, молекулярной биологии и генетики позволяет рассчитывать на успешное развитие новой биотехнологии – генной инженерии , т.е. совокупности методов, позволяющих путем операций в пробирке переносить генетическую информацию из одного организма в другой. Перенос генов дает возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим. Цель генной инженерии – не воплощение в реальность мифов, а получение клеток (в первую очередь бактериальных), способных в промышленных масштабах нарабатывать некоторые «человеческие» белки.

1. Методы генной инженерии

Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных, т.е. содержащих чужой ген, плазмид. Плазмиды представляют собой кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, состоящие из нескольких пар нуклеотидов. Плазмиды являются автономными генетическими элементами, реплицирующимися (т.е. размножающимися) в бактериальной клетке не в то же время, что основная молекула ДНК. Хотя на долю плазмид приходится лишь небольшая часть клеточной ДНК, именно они несут такие жизненно важные для бактерии гены, как гены лекарственной устойчивости. Разные плазмиды содержат разные гены устойчивости к антибактериальным препаратам.

Большая часть таких препаратов – антибиотиков используется в качестве лекарств при лечении ряда заболеваний человека и домашних животных. Бактерия, имеющая разные плазмиды, приобретает устойчивость к различным антибиотикам, к солям тяжелых металлов. При действии определенного антибиотика на бактериальные клетки плазмиды, придающие устойчивость к нему, быстро распространяются среди бактерий, сохраняя им жизнь. Простота устройства плазмид и легкость, с которой они проникают в бактерии, используются генными инженерами для введения в клетки бактерий генов высших организмов.

Мощным инструментом генной инженерии являются ферменты – рестрикционные эндонуклеазы, или рестриктазы. Рестрикция буквально означает «ограничение». Бактериальные клетки вырабатывают рестриктазы для разрушения инородной, в первую очередь фаговой ДНК, что необходимо для ограничения вирусной инфекции. Рестриктазы узнают определенные последовательности нуклеотидов и вносят симметричные, расположенные наискось друг от друга, разрывы в цепях ДНК на равных расстояниях от центра участка узнавания. В результате на концах каждого фрагмента рестриктированной ДНК образуются короткие одноцепочечные «хвосты» (их еще называют «липкими» концами).

Весь процесс получения бактерий, называемый клонированием, состоит из последовательных стадий:

1. Рестрикция – разрезание ДНК человека рестриктазой на множество различных фрагментов, но с одинаковыми «липкими» концами. Такие же концы получают при разрезании плазмидной ДНК той же рестриктазой.

2. Лигитирование – включение фрагментов ДНК человека в плазмиды благодаря «сшиванию липких концов» ферментом лигазой.

3. Трансформация – введение рекомбинантных плазмид в бактериальные клетки, обработанные специальным образом – так, чтобы они на короткое время стали проницаемыми для макромолекул. Однако плазмиды проникают лишь в часть обработанных бактерий. Трансформированные бактерии вместе с плазмидой приобретают устойчивость к определенному антибиотику. Это позволяет их отделить от нетрансформированных бактерий, погибающих на среде, содержащей этот антибиотик. Для этого бактерии высеивают на питательную среду, предварительно разведя так, чтобы при рассеве клетки находились на значительном расстоянии друг от друга. Каждая из трансформированных бактерий размножается и образует колонию из многих тысяч потомков – клон.

4. Скрининг – отбор среди клонов тех бактерий, которые несут нужный ген человека. Для этого все бактериальные колонии накрывают специальным фильтром. Когда его снимают, на нем остается отпечаток колоний, так как часть клеток из каждого клона прилипает к фильтру. Затем проводят молекулярную гибридизацию. Фильтры погружают в раствор с радиоактивно меченым зондом. Зонд – это полинуклеотид комплементарной части искомого гена. Он гибридизуется лишь с теми рекомбинантными плазмидами, которые содержат нужный ген. После гибридизации на фильтр в темноте накладывают рентгеновскую фотопленку и через несколько часов ее проявляют. Положение засвеченных участков на пленке позволяет найти среди множества клонов трансформированных бактерий те, которые имеют плазмиды с нужным геном.

Не всегда удается вырезать нужный ген с помощью рестриктаз. Поэтому в ряде случаев процесс клонирования начинают с целенаправленного получения нужного гена. Для этого из клеток человека выделяют и-РНК, являющуюся транскрипционной копией этого гена, и с помощью фермента – обратной транскриптазы синтезируют комплементарную ей цепь ДНК. Затем и-РНК, служившая матрицей при синтезе ДНК, уничтожается специальным ферментом, способным гидролизовать цепь РНК, спаренную с цепью ДНК. Оставшаяся цепь ДНК служит матрицей для синтеза обратной транскриптазой, комплетентарной второй цепи ДНК.

Получившаяся двойная спираль ДНК носит название к-ДНК (комплементарная ДНК). Она соответствует гену, с которого была считана и-РНК, запущенная в систему с обратной транскриптазой. Такая к-ДНК встраивается в плазмиду, которой трансформируют бактерии и получают клоны, содержащие только выбранные гены человека.

Чтобы осуществить перенос генов, необходимо выполнить следующие операции:

·Выделение из клеток бактерий, животных или растений тех генов, которые намечены для переноса.

·Создание специальных генетических конструкций, в составе которых намеченные гены будут внедряться в геном другого вида.

·Внедрение генетических конструкций сначала в клетку, а затем в геном другого вида и выращивание измененных клеток в целые организмы.

2. Достижения генной инженерии

генная инженерия биотехнология наследственность

Теперь умеют уже синтезировать гены, и с помощью таких синтезированных генов, введенных в бактерии, получают ряд веществ, в частности гормоны и интерферон. Их производство составило важную отрасль биотехнологии.

Так, в 1980 году гормон роста – соматотропин – получили из бактерии кишечной палочки. До развития генной инженерии его выделяли из гипофизов от трупов. Соматотропин, синтезированный в специально сконструированных клетках бактерий, имеет очевидные преимущества: он доступен в больших количествах, его препараты являются биохимически чистыми и свободными от вирусных загрязнений.

В 1982 году гормон инсулин стали получать в промышленных масштабах из бактерий, содержащих ген человеческого инсулина. До этого времени инсулин выделяли из поджелудочных желез забиваемых коров и свиней, что сложно и дорого.

Интерферон – белок, синтезируемый организмом в ответ на вирусную инфекцию, изучают сейчас как возможное средство лечения рака и СПИДа. Понадобились бы тысячи литров крови человека, чтобы получить такое количество интерферона, какое дает всего один литр бактериальной культуры. Ясно, что выигрыш от массового производства этого вещества очень велик. Очень важную роль играет также получаемый на основе микробиологического синтеза инсулин, необходимый для лечения диабета. Методами генной инженерии удалось создать и ряд вакцин, которые испытываются сейчас для проверки их эффективности против вызывающего СПИД вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

Еще одно перспективное направление в медицине, связанное с рекомбинантной ДНК, – генная терапия. В этих работах, которые пока еще не вышли из экспериментальной стадии, в организм для борьбы с опухолью вводится сконструированная по методу генной инженерии копия гена, кодирующего мощный противоопухолевый фермент. Генную терапию начали применять также для борьбы с наследственными нарушениями в иммунной системе.

В сельском хозяйстве удалось генетически изменить десятки продовольственных и кормовых культур. В животноводстве использование гормона роста, полученного биотехнологическим путем, позволило повысить удои молока; с помощью генетически измененного вируса создана вакцина против герпеса у свиней.

3. Генная инженерия: за и против

Несмотря на явную пользу от генетических исследований и экспериментов, само понятие «генная инженерия» породило различные подозрения и страхи, стало предметом озабоченности и даже политических споров. Многие опасаются, например, что какой-нибудь вирус, вызывающий рак у человека, будет введен в бактерию, обычно живущую в теле или на коже человека, и тогда эта бактерия будет вызывать рак. Возможно также, что плазмиду, несущую ген устойчивости к лекарственным препаратам, введут в пневмококк, в результате чего пневмококк станет устойчивым к антибиотикам и пневмония не будет поддаваться лечению. Такого рода опасности, несомненно, существуют.

Генная инженерия – это мощный способ изменить жизнь, но ее потенциал может представлять опасность, причем в первую очередь надо учитывать сложные и трудно предсказуемые эффекты, связанные с возможным воздействием на окружающую среду. Представьте себе некий яд, более дешевый в производстве, чем сложные гербициды с избирательным действием, но который не может быть использован в агротехнике из-за того, что он убивает полезные растения наравне с сорняками. Теперь представьте, что, допустим, в пшеницу, внедрили ген, делающий ее устойчивой к этому яду. Фермеры, засеявшие свои поля трансгенной пшеницей, могут безнаказанно опылять их смертоносным ядом, увеличивая свои доходы, но нанося непоправимый вред окружающей среде. С другой стороны, генетики могут достичь и противоположного эффекта, если выведут такую культуру, которая не нуждается в гербицидах.

Генная инженерия бросила человечеству уникальный вызов. Что несет нам генная инженерия, счастье или беду? О возможной опасности генетически измененных продуктов для здоровья человека трубит уже весь мир. Однозначного и единого мнения ученых по этому поводу нет. Одни считают, что генная инженерия спасет человечество от голодной смерти, другие – что генетически измененные продукты погубят все живое на земле вместе с человеком. Ученые, занимающиеся этим, утверждают, что генетически измененные растения более урожайны, более устойчивы к ядохимикатам, экономически выгоднее обычных. Поэтому за ними будущее. Однако специалисты, не связанные с производителями данного товара, далеки от оптимизма.

Предугадать отдаленные последствия, которые могут наступить в результате потребления генетически измененной продукции, на данный момент вообще невозможно. Относительно спокойно относятся к ГМ – продуктам (генетически модифицированным) – в США, где выращивается сегодня около 80 процентов всех генетических культур. Европа же относится к этому крайней негативно. Под натиском общественности и организаций потребителей, которые хотят знать, что они едят, в некоторых странах введен мораторий на ввоз таких продуктов (Австрия, Франция, Греция, Великобритания, Люксембург).

В других принято жесткое требование маркировать генетически измененное продовольствие, что, естественно, очень не понравилось поставщикам. 1 июля 2000 года в России была запрещена продажа генетически измененных продуктов без специальной предупредительной надписи на упаковке. Одним из первых ученых, забивших тревогу о потенциальной опасности ГМ – продуктов, был британский профессор Арпад Пуштай. Он назвал их “пищей для зомби”. Такие выводы позволили сделать результаты опытов на крысах, которых кормили генетически модифицированной пищей. У животных возник целый набор серьезных изменений желудочно-кишечного тракта, печени, зоба, селезенки. Наибольшее беспокойство вызвал тот факт, что у крыс уменьшился объем мозга.

Ученые полагают, что с помощью генетически измененных растений можно сократить потери урожая. Сегодня в России завершаются испытания американского картофеля, устойчивого к колорадскому жуку. Возможно, уже в этом году будет получено разрешение на его промышленное производство. Есть у подобных сортов одно существенное “но”. Когда получают растение с резко повышенной устойчивостью к какому-либо вредителю, через два-три поколения этот вредитель приспособится к растению, и будет пожирать его еще сильнее. Следовательно, устойчивый картофель может породить таких агрессивных вредителей, с которыми мир еще не сталкивался.

4. Перспективы генной инженерии

Настоящей находкой для генетиков стал янтарь, ископаемая древесная смола. В доисторические времена в ней часто застывали насекомые, цветочная пыльца, споры грибов, остатки растений. Текучая смола герметично обволакивала своих пленников, и биологический материал в целости и сохранности поджидал современных исследователей. И вот в 1990 году Джордж О. Пойнар из Калифорнийского университета сделал сенсационное открытие. Изучая термитов, попавших в янтарь 40 миллионов лет назад, он нашел хорошо сохранившуюся генетическую информацию. Позднее Пойнару удалось выделить из янтаря ДНК долгоносика, жившего 120 миллионов лет назад! Сейчас многие ученые работают над тем, чтобы воскресить динозавров, древних ящеров, мамонтов. И это уже не кажется фантастикой, как было всего лишь несколько лет назад. Однако ученые не намерены останавливаться на воскрешении животных. Если можно воскресить их, следовательно, то же самое можно проделать и с людьми.

Развитие науки дает нам потенциал как для плохого, так и для хорошего. Поэтому важно, что бы мы сделали правильный выбор. Основная трудность носит политический характер, – это решение вопроса кто есть «мы» в этом предложении. Если оставить этот вопрос на произвол рыночной стихии, скорее всего, пострадают долгосрочные интересы окружающей среды. Но это можно сказать и про многие другие аспекты жизни.

Список использованной литературы

1. Нейман Б.Я. Индустрия микробов. – Знание, 1983.

2. Рувинский А.О. Общая биология. – Просвещение, 1994.

3. Чебышев Н.В. Биология. − Новая волна, 2005.

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ (син. генетическая инженерия ) - направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью которых является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми, в т. ч. и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств. В основе Г. и. лежит обусловленная последними достижениями молекулярной биологии и генетики возможность целенаправленного манипулирования с фрагментами нуклеиновых к-т. К этим достижениям следует отнести установление универсальности генетического кода (см.), т. е. факта, что у всех живых организмов включение одних и тех же аминокислот в белковую молекулу кодируется одними и теми же последовательностями нуклеотидов в цепи ДНК; успехи генетической энзимологии, предоставившей в распоряжение исследователя набор ферментов, позволяющих получать в изолированном виде отдельные гены или фрагменты нуклеиновой к-ты, осуществлять in vitro синтез фрагментов нуклеиновых к-т, объединить в единое целое полученные фрагменты. Т. о., изменение наследственных свойств организма с помощью Г. и. сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введению этого материала в реципиентный организм, созданию условий для его функционирования и стабильного наследования.

Один из способов получения генов - хим. синтез. После того как Холли (A. Holli) в США, А. А. Баеву в СССР и другим исследователям удалось расшифровать структуру различных транспортных РБГК (тРНК), X. Корана с соавт, осуществил хим. синтез ДНК, кодирующей аланиновую тРНК пекарских дрожжей.

Но наиболее эффективный метод искусственного синтеза генов связан с использованием фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратная транскриптаза), обнаруженного Балтимором (D. Baltimore) и Темином (H. Temin) в онкогенных вирусах (см.). Этот фермент выделен и очищен из клеток, зараженных некоторыми РНК-содержащими онкогенными вирусами, в т. ч. вирусом птичьего миелобластоза, саркомы Рауса, мышиной лейкемии. Обратная транскриптаза обеспечивает синтез ДНК на матрице информационной РНК (иРНК). Использование молекул иРНК как матриц для синтеза ДНК в значительной степени облегчает искусственный синтез отдельных структурных генов высших организмов, поскольку последовательность азотистых оснований в молекуле иРНК является точной копией последовательности азотистых оснований соответствующих структурных генов, а методика выделения различных молекул иРНК достаточно хорошо разработана. Успехи в выделении иРНК белка глобина, входящего в состав гемоглобина человека, животных и птиц, иРНК белка хрусталика глаза, иРНК иммуноглобина, иРНК специфического белка злокачественной опухоли (миеломы) позволили с помощью обратной транскриптазы осуществить синтез структурной части генов, кодирующих некоторые из этих белков.

Однако в организме структурные гены функционируют совместно с регуляторными, нуклеотидная последовательность которых не воспроизводится молекулой иРНК. Поэтому ни один из указанных способов не позволяет осуществить синтез совокупности структурного и регуляторного гена. Решение этой проблемы стало возможным после разработки методов выделения отдельных генов. Для выделения бактериальных генов используют небольшие ДНК-содержащие цитоплазматические структуры, способные реплицироваться (см. Репликация) независимо от бактериальной хромосомы. Эти структуры образуют единую группу внехромосомных генетических элементов бактерий - плазмид (см. Плазмиды). Некоторые из них могут внедряться в бактериальную хромосому, а затем спонтанно либо под воздействием индуцирующих агентов, напр. УФ-облучения, переходить из хромосомы в цитоплазму, захватывая с собой и прилегающие хромосомные гены-клетки хозяина. Внехромосомные генетические элементы бактерий, обладающие такими свойствами, называют эписомами [Ф. Жакоб, Волльман (E. Wollman)]. К эписомам (см.) относят умеренные фаги (см. Бактериофаг), половой фактор бактерий, факторы лекарственной устойчивости микроорганизмов (см.), бактериоциногенные факторы (см.). В цитоплазме гены, захваченные эписомами, реплицируются в их составе и часто образуют множество копий. Разработка эффективного метода выделения плазмид, в частности умеренных фагов, несущих генетический материал бактериальной хромосомы, и выделения включенного в геном бактериофага фрагмента хромосомы бактериальной клетки позволила в 1969 г. Беквиту (J. Beckwith) с соавт, выделить лактозный оперон - группу генов, контролирующих синтез ферментов, необходимых для усвоения кишечной палочкой лактозы. Аналогичная техника была использована для выделения и очистки гена, контролирующего синтез тирозиновой транспортной РНК кишечной палочки (см. Рибонуклеиновые кислоты).

Использование плазмид дает возможность получить в изолированном виде практически любые бактериальные гены, а следовательно, и возможность конструировать молекулы ДНК из различных источников. Такие гибридные структуры можно накопить в клетках в значительных количествах, поскольку многие плазмиды в определенных условиях интенсивно реплицируются в цитоплазме бактерий, образуя десятки, сотни и даже тысячи копий.

Успехи Г. и. связаны с разработкой техники объединения генетических структур из различных источ-i ников в одной молекуле ДНК. Решающим в конструировании гибридных молекул in vitro явилось использование эндонуклеаз рестрикции - особых ферментов, способных разрезать молекулы ДНК в строго определенных участках. Такие ферменты обнаружены в клетках Escherichia coli, несущих плазмиды типа R, обусловливающие устойчивость бактерий к нек-рым лекарственным препаратам, в клетках Haemophilus influenzae, Serratia marcescens и других микроорганизмов. Один из наиболее часто используемых ферментов этого типа - эндонуклеаза рестрикции EcoRI, синтезируемая плазмидой RI в клетках E. coli. Фермент распознает участок ДНК с уникальной последовательностью из шести пар нуклеотидов и разрезает двунитчатую структуру ДНК на этом участке т. о., что с обеих сторон образуются однонитевые концы из четырех нуклеотидов (так наз. липкие концы). Поскольку фермент разрезает молекулы ДНК независимо от их происхождения строго определенным образом, все образовавшиеся в результате действия фермента фрагменты ДНК будут иметь одни и те же липкие концы. Комплементарные липкие концы любых фрагментов ДНК объединяются водородными связями, образуя гибридную кольцевую ДНК (рис.). Для стабилизации гибридной молекулы ДНК используют другой фермент - полинуклеотидлигазу, восстанавливающую ковалентные связи, разорванные ферментом рестрикции. Последовательность, специфично распознаваемая EcoRI, встречается в ДНК не чаще, чем через 4000-16 000 пар нуклеотидов. Следовательно, фрагмент ДНК, образовавшийся под действием EcoRI, может включать по крайней мере один неповрежденный ферментом ген (один ген в среднем содержит 1000-1500 пар нуклеотидов).

Применение эндонуклеаз рестрикции и ряда других ферментов дает возможность получать сложные рекомбинантные ДНК. Группа исследователей в США под руководством Берга (P. Berg) сумела объединить в составе одной молекулы ДНК генетическую информацию из трех источников: полный геном (см.) онкогенного вируса обезьян SV40, часть генома умеренного бактериофага λ и группу генов кишечной палочки, ответственных за усвоение галактозы. Сконструированная рекомбинантная молекула не была исследована на функциональную активность, поскольку авторы этой работы остановились перед потенциальной опасностью распространения онкогенных вирусов животных в популяции бактерий, обитающих в кишечнике человека. Известно, что очищенная ДНК вирусов может проникать в различные клетки млекопитающих и стабильно наследоваться ими.

Впервые функционально активные молекулы гибридной ДНК удалось сконструировать в США Коэну (S. Cohen) с соавт. Группа Коэна последовательно решала проблему объединения и клонирования (избирательного накопления) молекул ДНК, выделенных из видов, все более удаленных друг от друга в филогенетическом отношении. Процедура клонирования обычно заключается в том, что ДНК из различных источников фрагментируют с помощью эндонуклеаз рестрикции, затем эти фрагменты объединяют in vitro в общую структуру и вводят в реципиентный организм, к-рым в опытах Коэна служит кишечная палочка. Установлено, что клетки нескольких видов бактерий (в т. ч. Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus) могут быть трансформированы (см. Трансформация) с помощью рекомбинантных молекул ДНК. При этом плазмидная часть гибридной молекулы (либо одна из плазмид, если в составе гибридной молекулы объединены две плазмиды из различных источников) служит вектором, т. е. обеспечивает перенос в реципиентные клетки филогенетически чужеродного генетического материала и его размножение в них. Первой плазмидой, использованной Коэном с соавт, в качестве вектора, была полученная им in vitro плазмида pSC101, контролирующая устойчивость бактерий к тетрациклину. Эта небольшая плазмида состоит всего из 8000 пар нуклеотидов. Она атакуется ферментом EcoRI лишь в одном участке, причем фермент не повреждает способность плазмиды к последующей репликации в клетках E. coli и контролировать устойчивость к тетрациклину. Эти особенности позволили использовать ее для конструирования in vitro гибридных молекул ДНК. На первых этапах к pSC101 присоединили плазмидную ДНК, выделенную из различных видов бактерий, а затем и из высших организмов. Так были созданы «химерные» плазмиды (т. е. не способные возникать в природных условиях), объединившие в своем составе генетический материал кишечной палочки, участок ДНК из ооцитов шпорцевой лягушки Xenopus laevis, контролирующий синтез рибосомных РНК, и участок ДНК морского ежа, контролирующий синтез белков- гистонов, либо ДНК митохондрий мыши. В клетках кишечной палочки, в которые вводили такие гибридные, «химерные», плазмиды, была зарегистрирована работа генов высших организмов.

В отличие от pSC101, присутствующей в клетке лишь в 4-6-й копиях, некоторые другие плазмиды, используемые в качестве векторов, в определенных условиях могут многократно реплицироваться, образовывая несколько тысяч копий в одной клетке. Такими свойствами обладает, напр., плазмида ColEI, контролирующая синтез колицина (см. Бактериоциногения). Подобно pSC101, ColEI разрезается ферментом EcoRl лишь в одном участке, а к образовавшейся линейной молекуле с липкими концами легко присоединяется чужеродная ДНК, также обработанная EcoRI. Т. о., к ColEI удалось «подшить» гены триптофанового оперона кишечной палочки. В клетках, несущих множество копий сконструированной гибридной плазмиды, резко увеличилась продукция белков-ферментов, контролируемых генами биосинтеза триптофана. В системе in vitro удалось присоединить плазмиду ColEI к нек-рым R-факто-рам и умеренному фагу. Подобные работы впервые выполнены в СССР под руководством академика А. А. Баева и профессора С. И. Алиханяна. Комбинированные векторные плазмиды, образованные ColEI и R-факторами, способны интенсивно размножаться в бактериальных клетках, подобно ColEI, и в то же время обусловливают устойчивость клеток к антибиотикам, что значительно упрощает отбор бактерий - носителей гибридных плазмид.

В качестве векторов используют и умеренные фаги. В системе in vitro сконструированы гибридные частицы бактериофага, включившие в свою структуру бактериальные гены, ДНК других фагов либо высших организмов (напр., ДНК плодовой мушки-дрозофилы).

Функциональную активность гибридных ДНК определяют возможностью их переноса в клетки реципиентных организмов и последующего умножения (амплификации) в этих клетках. В качестве реципиентов уже сейчас эффективно используют не только бактерии, о чем упоминалось выше, но и клетки высших организмов, пока, однако, лишь в виде культуры ткани, культивируемой вне организма. Имеются указания на возможность проникновения ДНК фагов, несущих бактериальные гены, в клетки соединительной ткани (фибробласты) человека, в протопласты либо в недифференцированную культуру (каллус) клеток растений. В 1971 г. амер. исследователь Меррил (С. R. Merril) с соавт, сообщил об опытах по исправлению наследственного дефекта - галактоземии (см.) путем введения в «больные» клетки галактозных генов бактерий, включенных в состав ДНК трансдуцирующего фага. В результате клетки больного галактоземией, дефектные по ферменту бета-D-галактозо-1-фосфатуридилтрансферазе, не способные усваивать галактозу, восстанавливали нормальную способность к росту в присутствии галактозы, а в их экстрактах была зарегистрирована ранее отсутствовавшая ферментативная активность. Сходный результат был получен Хорстом (J. Horst) с соавт, при введении бактериального гена, контролирующего синтез бета-галактозидазы в фибробласты больного с генерализованным ганглиозидозом, характеризующимся резкой недостаточностью этого фермента. Маньон (W. Munyon) и его сотр. с помощью вируса герпеса перенесли ген, контролирующий синтез тимидинкиназы, из клеток человека в клетки мыши, восстановив способность дефектных мышиных фибробластов синтезировать этот фермент.

Одним из путей передачи генетической информации в культуре клеток человека, животных и растений является гибридизация соматических клеток, разработанная Эфрусси (В. Ephrussi) и Барски (G. Barski). Эффективность этого метода значительно повысилась после того, как было обнаружено, что частицы инактивированного вируса парагриппа типа Сендай увеличивают частоту слияния клеток из самых различных источников. Продемонстрирована возможность передачи отдельных генов из изолированных хромосом китайского хомячка в клетки соединительной ткани мыши. Описаны гибриды клеток человека и мыши, в которых часть хромосом человека удаляется, а часть остается функционально активной. Развитие методов микрохирургии клеток позволило пересаживать клеточные ядра из соматических клеток в оплодотворенные яйцеклетки и получать в результате абсолютно идентичные организмы. Гибридизация клеток дала возможность индуцировать синтез глобина человека в зародышевых клетках лягушки. Все эти примеры демонстрируют потенциальные возможности Г. и.

Практическое значение Г. и. для медицины связано с перспективами исправления наследственных дефектов обмена у человека (см. Генотерапия), создания микроорганизмов, потерявших свою патогенность, но сохранивших способность к формированию иммунитета, синтеза антибиотиков, аминокислот, гормонов, витаминов, ферментов, иммуноглобулинов и т. д., основанного на использовании микроорганизмов, включивших соответствующие гены. Исключительные результаты могут быть получены в ближайшее время Г. и. растений. С помощью методов Г. и. пытаются создать растения, способные усваивать атмосферный азот, и улучшить белковый состав растительной пищи. Успешное решение этих задач позволит резко повысить продуктивность растений, сократить производство и потребление минерального азота, а тем самым значительно оздоровить окружающую среду (см.). Изучается возможность создания совершенно новых форм животных и растений за счет преодоления межвидовых барьеров скрещиваемости. Однако при оценке Г. и. как новой формы освоения живой природы следует учитывать не только ее возможную революционизирующую роль в биологии, медицине и сельском хозяйстве, но и возникающие в связи с ее развитием возможности появления новых форм патогенных микроорганизмов, опасность распространения в популяциях бактерий, обитающих у человека, гибридных ДНК, несущих Онкогенные вирусы, и т. д. Конечно, преднамеренное использование достижений науки, и в т. ч. Г. и., в антигуманных, человеконенавистнических целях возможно лишь в обществе, в к-ром благо человека приносится в жертву наживе и агрессии.

Из дополнительных материалов

Генетическая инженерия продолжает оставаться быстро прогрессирующим методом исследования в молекулярной биологии и генетике. Необходимо отметить, что понятия «генетическая инженерия» и «генная инженерия» не являются полными синонимами, т. к. исследования, относящиеся к генетической инженерии, не ограничиваются только манипуляциями с генами как таковыми. В настоящее время методы генетической инженерии позволяют проводить наиболее глубокий и детальный анализ природных нуклеиновых к-т - веществ, ответственных за хранение, передачу и реализацию генетической информации (см. Нуклеиновые кислоты.), а также создавать модифицированные или абсолютно новые, не встречающиеся в природе гены (см. Ген), комбинации генов и с высокой эффективностью экспрессировать их в живой клетке (см. Экспрессивность гена). Из конкретных практических достижений генетической инженерии в последнее десятилетие наиболее важным следует признать создание продуцентов биологически активных белков - инсулина (см.), интерферона (см.), гормона роста (см. Соматотропный гормон) и др., а также разработку генно-инженерных способов активизации тех звеньев обмена веществ, к-рые связаны с образованием низкомолекулярных биологически активных веществ. Таким путем получены продуценты нек-рых антибиотиков, аминокислот и витаминов, во много раз более эффективные, чем продуценты этих веществ, выведенные традиционными методами генетики и селекции. Разрабатываются способы получения чисто белковых вакцин против вирусов гепатита, гриппа, герпеса, ящура, реализована идея использования вакцинации вирусом осповак-цины, в геном к-рого встроены гены, кодирующие синтез белков других вирусов (напр., вирусов гепатита или гриппа): в результате прививки сконструированным таким образом вирусом организм вырабатывает иммунитет не только против оспы, но и против гепатита, гриппа или другого заболевания, вызываемого тем вирусом, белок к-рого кодируется встроенным геном.

Существенно выросла мировая коллекция рестрикционных эндонуклеаз - рестриктаз, основных «инструментов» генно-инженерных манипуляций. Выделено более 400 рестриктаз, «узнающих» ок. 100 различных по структуре специфических участков (сайтов) в молекулах ДНК (см. Дезоксирибонуклеиновые кислоты) и расщепляющих полинуклео-тидную цепь ДНК по этим участкам. С помощью одного такого фермента или комбинации нескольких рестриктаз можно выделить практически любой ген в составе одного или нескольких фрагментов ДНК (так наз. рестрикционных фрагментов). Это расширило возможности генетической инженерии не только в отношении выделения генов, но и в отношении активизации их работы, анализа структуры генов и их молекулярного окружения. Разработаны методы синтеза целых генов с заданной последовательностью нуклеотидов, появилась возможность снабжать синтезированные и природные гены различными регуляторными нуклеотидными последовательностями, заменять, вставлять, удалять единичные нуклеотиды в строго заданных участках гена, укорачивать или достраивать его нуклеотидную цепь с точностью до одного нуклеотида.

Достижением генетической инженерии явилось ее проникновение в организацию и функционирование механизмов наследственности клеток высших организмов, в т. ч. и человека. Именно на высших эукариотах с помощью методов генетической инженерии получены наиболее интересные данные. Успехи генетической инженерии во многом связаны с получением новых специализированных векторов, позволяющих эффективно клонировать (размножать) индивидуальные фрагменты ДНК (гены) и синтезировать белки, кодируемые этими генами.

Рестрикционные фрагменты, соединенные с ДНК-векторами, клонируют в живой клетке, используя способность таких векторов воспроизводиться (реплицироваться) в клетке во множестве копий. В зависимости от размеров фрагментов, подлежащих клонированию, и цели исследования используют векторы одного из четырех типов - плазмиды (см.), фаги (см. Бактериофаг), космиды или производные фагов с однонитевой ДНК.

Для клонирования сравнительно небольших фрагментов ДНК (до 10 тыс. пар нуклеотидов) применяют плазмидные векторы (pBR322, рАТ 153, pUR250, pUC19 и др.). Достижением генетической инженерии последних лет было получение векторов на основе фага X (Харон 4А, gtwes-B), в к-ром часть генома замещена фрагментом чужеродной ДНК. Гибридный геном искусственным путем «упаковывают» в белковую оболочку и этим реконструированным фагом заражают бактерии. Образуя при размножении в клетке несколько тысяч копий, реконструированный фаг лизирует ее и выделяется в культуральную среду. С помощью таких векторов клонируют фрагменты ДНК длиной 10-25 тыс. пар нуклеотидов.

Космидные векторы (pIB8, MUA-3) представляют собой гибрид фага X и плазмиды. Они содержат так наз. COS-последовательности ДНК фага, необходимые для упаковки геномов фага в белковую оболочку, и участок ДНК плазмиды, позволяющий кос-мидным векторам реплицироваться в бактериях так же, как это делают плазмиды. Таким образом, полученный рекомбинантный геном с высокой эффективностью заражает бактерии подобно бактериофагу, но размножается в них как плазмида, не вызывая гибели бактериальной клетки. Космиды применяют для клонирования фрагментов ДНК длиной до 35-45 тыс. пар нуклеотидов.

Векторы, представляющие собой производные фагов с однонитевой ДНК (М13 mp8, М13, тр73 и др.), сконструированы на основе кольцевой молекулы ДНК бактериофага М13. Для встраивания чужеродной ДНК используют репликативную двуспиральную молекулу ДНК фага. Вектор, несущий чужеродную ДИК, вводят в бактериальные клетки, где рекомбинантные молекулы размножаются, не лизируя эту клетку, и «отпочковываются» в культуральную среду как вирусная частица с однонитевой молекулой ДНК. Эти векторы используют для клонирования фрагментов ДНК (до 300-400 пар нуклеотидов).

Ген, необходимый для генно-инженерных манипуляций, получают путем клонирования соответствующих рекомбинантных молекул ДНК и отбора таких клонов. В тех случаях, когда клонируют гены высших организмов и человека/ экспрессия к-рых в E. coli (чаще всего используемой для таких целей) невозможна, процедуру клонирования и отбора проводят в несколько этапов. На первом этапе создают так наз. библиотеку генов из фрагментов ДНК (клонированных непосредственно из генома клетки) или из клонированных ДНК-копий (кДНК) соответствующей матричной РНК. Сравнивая структуру фрагментов геномной ДНК и соответствующих кДНК, получают важную информацию об организации генетического материала, а в случае наследственных болезней - о характере аномалий в генетическом материале, следствием к-рых и является это заболевание. Из библиотеки генов, пользуясь современными приемами, можно извлечь необходимый ген с окружающими его участками генома. В настоящее время созданы полные библиотеки генов многих микроорганизмов, растений и животных (вплоть до млекопитающих и человека). Уже клонировано и в той или иной мере изучено несколько сот генов и других последовательностей нуклеотидов в ДНК человека.

Возможности генно-инженерных исследований не ограничиваются клонированием гена и получением большого числа его копий. Часто необходимо не только клонировать ген, но и обеспечить его экспрессию в клетке, т. е. реализовать заключенную в нем информацию в аминокислотную последовательность полипеп-тидной цепи белка, кодируемого этим геном. Если вводимый в бактериальную клетку ген получен из бактерий той же (или близкой) видовой принадлежности, то бывает достаточно выделить ген с регуляторными элементами, контролирующими его экспрессию. Однако, если не считать нескольких исключений, регуляторные нуклеотидные последовательности эволюционно далеких друг от друга организмов не являются взаимозаменяемыми. Поэтому, чтобы добиться, напр., экспрессии эукариотического гена в клетках Е. coli, у него удаляют регуляторную область, а структурную часть такого гена присоединяют (на определенном расстоянии) к регуляторной области бактериального гена. Существенный прогресс в разработке этой методики был достигнут после открытия фермента нуклеазы Ва131, к-рая обладает уникальным свойством гидролизовать обе цепи двуспиральной линейной молекулы ДНК начиная с конца молекулы, т. е. этот фермент удаляет с конца фрагмента ДНК «лишние» последовательности нуклеотидов любой протяженности. В настоящее время структурную и регуляторную области выделяют порознь с помощью тех рестриктаз, участки «узнавания» к-рых расположены наиболее удачно на полинуклеотидной цепи, затем убирают «лишние» нуклеотидные последовательности и соединяют структурную область эукариотического гена с регуляторной областью бактериального гена. Таким путем удается добиться не только экспрессии генов эукариотов в бактериальных клетках, но и, наоборот, бактериальных генов в клетках высших и низших эукариотов.

Успехи генетической инженерии тесно связаны с развитием и совершенствованием методов определения последовательности нуклеотидов (секвенирования) в молекулах ДНК. Значительное число рестриктаз, имеющихся в распоряжении исследователей, позволяет с абсолютной специфичностью выделять определенные фрагменты ДНК, а разработка и совершенствование методов клонирования дает возможность получать фрагменты даже уникальных генов в количествах, необходимых для анализа. Методы секвенирова-ния ДНК оказались настолько эффективными, что часто через определение последовательности нуклеотидов ДНК получают данные о последовательности нуклеотидов в молекулах соответствующих РНК и о последовательности аминокислотных остатков в синтезирующейся молекуле белка. При обработке результатов секвенирования ДНК широко используют ЭВМ. Для более полной и быстрой интерпретации полученных экспериментальных данных создаются национальные и международные компьютерные «банки» нуклеотидных последовательностей. В настоящее время определены полные последовательности нуклеотидов геномов ряда бактериальных плазмид и вирусов, уже решается проблема определения полных нуклеотидных последовательностей сначала отдельных хромосом, а затем и всего генома высших организмов, в т. ч. и человека.

С помощью методов генетической инженерии были обнаружены отклонения в строении определенных участков генов человека, что являлось причиной наследственных болезней. Чаще всего таким методом служит так наз. б лот-анализ. Выделенную клеточную ДНК подвергают гидролизу рестриктазой, полученные фрагменты разделяют по величине с помощью электрофореза в агарозе или полиакриламидном геле. Разделенные фрагменты переносят («перепечатывают») на специально обработанную хроматографическую бумагу, нитроцеллюлозу или нейлоновый фильтр и снова подвергают электрофоретическому разделению. Вырезают места электрофореграмм, соответствующие отдельным фракциям и содержащие однотипные фрагменты ДНК; вырезанные участки электрофореграмм инкубируют с ранее клонированным геном или его частью либо с полученной путем хим. синтеза последовательностью нуклеотидов, содержащими радиоактивную метку. Меченая ДНК связывается только с теми фрагментами анализируемой клеточной ДНК, к-рые имеют комплементарные ей последовательности нуклеотидов. Изменение распределения и количества фиксированной метки по сравнению с нормой позволяет судить о перестройках в анализируемом гене или близлежащих к нему последовательностях нуклеотидов.

Участки «узнавания» определенных рестриктаз в молекуле ДНК располагаются неравномерно, поэтому при гидролизе этими ферментами молекула ДНК расщепляется на ряд фрагментов различной длины. Перестройка структуры ДНК, в результате к-рой исчезают имевшиеся или появляются новые участки «узнавания», приводит к изменению набора этих фрагментов (так наз. рестрикционных фрагментов), т. е. к появлению полиморфизма длин рестрикционных фрагментов(ГВДРФ). Перестройки в молекуле ДНК могут вызывать или не вызывать изменения в процессе синтеза или в структуре кодируемого белка; перестроек, не вызывающих изменений, большинство, и они служат причиной нормального ПДРФ. Выяснилось, что ПДРФ является четким генетическим признаком. В настоящее время анализ ПДРФ стал одним из наиболее точных методов, используемых в генетике человека и медицинской генетике. Для ряда наследственных болезней описаны формы ПДРФ, прямо свидетельствующие о наличии заболевания или о носительстве патологически измененного гена.

Генетическая инженерия положила начало новому направлению исследований, получившему название «генетика наоборот». Традиционный генетический анализ (см.) проводится в следующей последовательности: выбирается признак, устанавливается связь признака с генетической детерминантой и локализация этой детерминанты по отношению к уже известным. В «генетике наоборот» все происходит в обратном порядке: выбирают фрагмент ДНК с неизвестной функцией, устанавливают сцепление этого фрагмента ДНК с другими областями генома и его связь с определенными признаками. Этот подход позволил разработать методы ранней диагностики и выявления носителей таких заболеваний, как хорея Гентингтона, болезнь Дюшен-на, муковисцидоз, биохимическая природа наследственных дефектов при к-рых пока не известна. При генеалогическом методе установления закономерностей наследственной передачи хореи Гентингтона было показано, что выделенный из генома человека фрагмент ДНК G8 тесно сцеплен с геном, определяющим заболевание, и по форме ПДРФ фрагмента G8 в данной популяции можно диагностировать это заболевание и выявлять носителей дефектных генов.

На пути внедрения в медицинскую практику методов, используемых в генетической инженерии, еще много трудностей технического порядка. Во многих лабораториях мира активно ведется разработка практически пригодных генно-инженерных диагностических методов, и можно надеяться, что такого рода методы уже в ближайшем будущем найдут применение, если и не для массового генетического просеивания (скрининга) при диспансеризации населения, то, но крайней мере, для выборочного обследования групп повышенного риска в отношении наследственных болезней.

Генетическая инженерия позволяет не только копировать природные соединения и процессы, но и модифицировать их, делать их более эффективными. Примером этого может служить новое направление исследований, названное белковой инженерией. Расчеты, производимые на основании данных об аминокислотной последовательности и пространственной организации молекул белков, показывают, что при определенных заменах нек-рых аминокислотных остатков в молекулах ряда ферментов возможно значительное усиление их ферментативной активности. В изолированном гене, кодирующем синтез конкретного фермента, методами генетической инженерии проводят строго контролируемую замену определенных нуклеотидов. При синтезе ферментного белка под контролем такого модифицированного гена происходит заранее спланированная замена строго определенных аминокислотных остатков в полипептидной цепи, что вызывает повышение ферментативной активности во много раз по сравнению с активностью природного прототипа.

В области сельского хозяйства от генетической инженерии ожидают большого вклада в селекцию новых высокоурожайных сортов растений, устойчивых к засухе, болезням и вредителям, а также в выведение новых высокопродуктивных пород с.-х. животных.

Как и любое достижение науки, успехи генетической инженерии могут быть использованы не только на благо, но и во вред человечеству. Специально проведенные исследования показали, что опасность неконтролируемого распространения рекомбинантных ДНК не так велика, как представлялось ранее. Рекомбинантные ДНК и несущие их бактерии оказались очень неустойчивыми к влияниям окружающей среды, нежизнеспособными в организме человека и животных. Известно, что в природе и без вмешательства человека имеются условия, к-рые обеспечивают активный обмен генетической информацией, это так наз. поток генов. Однако на пути проникновения в организм чужеродной генетической информации природа создала много эффективных барьеров. В настоящее время очевидно, что при работе с большинством рекомбинантных молекул ДНК вполне достаточно обычных мер предосторожности, к-рые применяют, напр., микробиологи при работе с инфекционным материалом. Для особых случаев разработаны эффективные способы как биологической защиты, так и физической изоляции экспериментальных объектов от человека и окружающей среды. Поэтому весьма жесткие первые варианты правил работы с рекомбинантными ДНК были переработаны и значительно смягчены. Что касается преднамеренного использования достижений генетической инженерии во вред человеку, то и ученые, и общественность должны активно бороться за то, чтобы эта опасность так и осталась возможной лишь теоретически.

См. также Биотехнология.

Библиография: Алиханян С. И. Успехи и перспективы генной инженерии, Генетика, т. 12, Jvft 7, с. 150, 1976, библиогр.; АлиханянС. И. и др. Получение функционирующих рекомбинантов (гибридных) молекул ДНК, in vitro, там же, т. И, № 11, с. 34, 1975, библиогр.; Баев А. А. Генетическая инженерия, Природа, М1,с. 8, 1976; Тихомирова Л. П. и д р. Гибридные молекулы ДНК фага X и плазмиды ColEl, Докл. АН СССР, т. 223, №4, с. 995, 1975, библиогр.; Brown D. D. a. S t e r n R. Methods of gene isolation, Ann. Rev. Biochem., v. 43, p. 667, 1974, bibliogr.; C h a n g A. C. Y. a. o. Studies of mouse mitochondrial DNA in Escherichia coli, Cell, v. 6, p. 231,1975, bibliogr.; Hedgpeth J., Goodman H. M. a. B o y e r H. W. DNA nucleotide sequence restricted by the R1 endonuclease, Proc. nat. Acad. Sci. (Wash.), v. 69, p. 3448, 1972, bibliogr.; Hershfield V. a. o. Plasmid ColEl as a molecular vehicle for cloning and amplification of DNA, ibid., v. 71, p. 3455, 1974; Morrow J. F. a. o. Replication and transcription of eukaryotic DNA in Escherichia coli, ibid., p. 1743; T e m i n H. M. a. Mizu-t ani S. RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus, Nature (Lond.), v. 226, p. 1211, 1970.

Биотехнология, под ред. А. А. Баева, М., 1984; Б о ч к о в Н. П., Захаров А. Ф. и Иванов В. И. Медицинская генетика, М., 1984; М а н и а-тис Г., ФричЭ. и Сэмбрук Д ж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование, пер. с англ., М., 1984; A n t о n a r a k i s S. E. a. o. DNA polymorphism and molecular pathology of human globin gene clusters, Hum. Genet., v. 69, p. 1, 1985; Beaudet A. L. Bibliography of cloned human and other selected DNAs, Amer. J. hum. Genet., v. 37, p. 386, 1985; В o t s t e i n D. a. o. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms, ibid., v. 32, p. 314, 1980; G u s e 1 1 a J. E. a. o. DNA markers for nervous system diseases, Science, v. 225, p. 1320, 1984; Motulsky A. G. Impact of genetic manipulation on society and medicine, ibid., v. 219, p. 135, 1983; White R. a. o. A closely linked genetic marker for cystic fibrosis, Nature (Lond.), v. 318, p. 382, 1985; Wo о S. L. C., L i d s к у A. S. a. Guttler F. Prenatal diagnosis of classical phenylketonuria by gene mapping, J. Amer. med. Ass., v. 251, p. 1998, 1984.

Л. С. Чернин, В. H. Калинин.