Apa yang luar biasa tentang Hadiah Nobel Kimia yang baru, mengapa air membeku di sekitar biomolekul, dan bagaimana komputer mengubah gambar 2D menjadi 3D, baca situs web tentang karya peraih Nobel tahun 2017 Jacques Dubochet, Joachim Frank, dan Richard Henderson.
Struktur molekul yang diperoleh dalam beberapa tahun terakhir sangat mengesankan. Ini adalah “jarum suntik” salmonella yang menyerang sel, dan protein yang membuat bakteri resisten terhadap antibiotik, dan struktur terindah di dasar flagela, dan enzim yang luar biasa indah. Dari pengetahuan biologi dasar tentang kerja biomolekul dalam sel hingga pemahaman tentang bagaimana molekul obat berperilaku, kita semua dapat memperolehnya berkat metode mikroskop krio-elektron, yang pengembangannya membuat kita dianugerahi Hadiah Nobel Kimia pada tahun 2017. 2017.
Namun apakah metode ini dan mengapa hasil yang sama tidak dapat dicapai tanpanya? Memang, pada saat itu sudah ada kristalografi sinar-X dan mikroskop elektron.
Metode-metode ini memberikan beberapa batasan penting pada para peneliti, untuk mengatasinya, atau lebih tepatnya, “untuk pengembangan metode mikroskop krioelektron untuk menentukan struktur biomolekul dalam larutan dengan resolusi tinggi,” penghargaan bergengsi tersebut diberikan hari ini.
Tahun ini, tiga ilmuwan yang mencetuskan teknologi ini akan menerimanya: orang Prancis Jacques Dubochet, yang bekerja di Universitas Lausanne, Joachim Frank kelahiran Jerman dari Universitas Columbia di New York, dan orang Skotlandia Richard Henderson dari Laboratorium Molekuler. Biologi di Cambridge (omong-omong, sepertinya ini adalah pemenang kelima belas dari laboratorium ini).
Dari kiri ke kanan: Jacques Dubochet, Joachim Frank dan Richard Henderson
Denis Balibouse/Reuters, Universitas Columbia, Laboratorium Biologi Molekuler MRC
Ketika Ernst Ruska menemukan dan mendemonstrasikan mikroskop elektron, yang dapat digunakan untuk melihat posisi atom individu (yang Ruska menerima Hadiah Nobelnya pada tahun 1986), ilmuwan lain, Ladislav Marton, menulis artikel tentang kesulitan mempelajari bahan biologis dengan mikroskop elektron. metode baru, karena biomolekul dan sel dihancurkan di bawah pengaruh aliran elektron. Aliran ini harus sangat lemah agar tidak merusak sampel, namun aliran yang lemah memberikan resolusi yang buruk. Untuk mikroskop elektron, sampel harus tipis dan rata, yang juga memperumit tugasnya - model 3D dari molekul yang diteliti (misalnya, protein) harus diselesaikan dari proyeksi dua dimensi.
Tentu saja, mempelajari sel-sel hidup adalah hal yang mustahil, tetapi dalam keadaan hancur mereka terlihat sangat berbeda dari apa yang mereka lakukan saat bekerja. Selain itu, mikroskop elektron memerlukan ruang hampa, dan semua air di dalamnya menguap, yang membantu biomolekul mempertahankan bentuk aslinya. Semua ini sulit dan tidak nyaman. Sampai mikroskop krioelektron muncul.
Perubahan penggambaran biomolekul terkait dengan karya peraih Nobel 2017
Richard Henderson mengerjakan protein di Cambridge menggunakan kristalografi sinar-X, teknik yang digunakan Rosalind Franklin untuk menghasilkan gambar terkenal yang digunakan Watson dan Crick untuk membuat model heliks ganda DNA mereka. Semuanya baik-baik saja sampai Henderson mulai mengerjakan protein membran yang ditemukan di membran sel. Ketika mereka dikeluarkan dari lingkungan alaminya, mereka menjadi tumpukan atom yang tidak berguna dan kusut. Henderson tidak dapat mengisolasi salah satunya dalam jumlah yang cukup, yang lain tidak dapat dikristalisasi.
Segalanya berubah ketika Henderson mengonsumsi bakteriorhodopsin protein peka cahaya. Ilmuwan memutuskan untuk tidak mengeluarkannya dari membran, tetapi menempatkan seluruh bagian membran di bawah mikroskop elektron bersamanya. Untuk mencegah strukturnya runtuh, ditutup dengan larutan glukosa. Untuk menghindari kerusakan sampel dengan aliran elektron yang kuat, para ilmuwan menembakkan sinar yang lebih lemah. Gambarnya, seperti yang diharapkan, tidak terlalu jelas dan kontras, tetapi di sini mereka menggunakan metode matematika yang sama seperti pada kristalografi sinar-X; hal ini dimungkinkan oleh struktur protein, yang terletak pada membran yang berorientasi ke dalam arah yang sama. Gambar yang diperoleh dari berbagai sudut menunjukkan bahwa protein terpelintir, melewati membran sebanyak tujuh kali (protein tersebut sekarang dikenal sebagai reseptor tujuh heliks). Itu adalah gambar dengan kualitas terbaik yang pernah diperoleh dengan menggunakan mikroskop elektron.
Resolusi tujuh angstrom mengesankan banyak orang, tetapi Henderson tidak mau berhenti: dia ingin mencapai resolusi yang sama dengan kristalografi sinar-X, tiga angstrom. Seiring waktu, lensa menjadi lebih baik, dan teknologi pembekuan telah muncul yang memungkinkan sampel disimpan dalam nitrogen cair. Untuk mendapatkan gambaran yang lebih jelas tentang bakteriorhodopsin, Henderson melakukan perjalanan ke berbagai laboratorium menggunakan mikroskop elektron terbaik di dunia. Mereka semua mempunyai kekurangan yang sama, namun saling melengkapi. Dan baru pada tahun 1990, 15 tahun setelah menerima gambar pertama, yang tidak sedap dipandang mata modern, Henderson mencapai tujuannya. Dia menunjukkan bahwa mikroskop krioelektron dapat berguna untuk mempelajari biomolekul, tetapi bakteriorhodopsinnya teratur dan praktis terfiksasi dalam membran sel. Sangat sedikit protein lain yang dapat melakukan hal yang sama, sehingga para ahli biologi merasa metode ini masih sangat terbatas.
Saat ini, di seberang Atlantik, di New York, Joachim Frank telah lama berupaya mencari solusi untuk masalah ini. Sudah pada tahun 1975, ia menemukan pendekatan teoretis, tetapi penerapannya membutuhkan waktu bertahun-tahun. Idenya adalah menciptakan komputer yang dapat membedakan protein yang ditempatkan secara acak dari latar belakang yang kacau. Dia menemukan metode matematika yang memungkinkan komputer menemukan pola berulang yang berbeda dalam sebuah gambar. Komputer mengurutkan pola-pola tersebut, menggabungkan pola-pola serupa, untuk menghasilkan gambar rata-rata namun lebih tajam. Frank telah menerbitkan beberapa makalah dengan model protein 2D resolusi tinggi dari berbagai sudut. Algoritmanya sudah siap pada tahun 1981.
Langkah selanjutnya adalah membuat algoritma yang menemukan gambar 2D serupa dan menyusunnya menjadi struktur 3D. Pada pertengahan tahun delapan puluhan, Frank menerbitkan bagian dari metode ini dan mengambil tugas besar untuk membuat model permukaan ribosom, mesin molekuler raksasa untuk merakit protein di dalam sel.
Metode analisis struktur 3D yang dikembangkan oleh Joachim Frank: 1. Seberkas elektron mengenai protein yang berorientasi acak, sehingga meninggalkan jejaknya pada gambar. 2. Berkat metode pemrosesan informasi fuzzy, komputer mengelompokkan gambar-gambar yang dihasilkan yang mirip satu sama lain ke dalam kelompok. 3. Dengan menggunakan ribuan gambar yang dihasilkan, komputer membuat gambar 2D resolusi tinggi. 4. Komputer menganalisis bagaimana gambar 2D berhubungan satu sama lain di ruang angkasa dan membuat gambar 3D resolusi tinggi.
Johan Jarnestad/Akademi Ilmu Pengetahuan Kerajaan Swedia
Beberapa saat sebelumnya, pada tahun 1978, ilmuwan lain, Jacques Dubochet, mulai memecahkan bagian ketiga dari masalah mikroskop elektron ini. Seperti yang kita ingat, biomolekul sangat menderita, berubah menjadi massa tak berbentuk jika air di sekitarnya menguap, dan dalam ruang vakum mikroskop elektron ia akan menguap. Pembekuan sederhana tidak membuahkan hasil: kristal es, yang mengembang dibandingkan dengan air, dapat memecahkan protein yang sedang dipelajari dan menghancurkan strukturnya. Meskipun Henderson beruntung dengan bakteriorhodopsin, ilmuwan lain kesulitan dengan protein non-membran yang larut dalam air.
Duboche menemukan metode pembekuan ultra-cepat menggunakan nitrogen cair: air tampak “vitrifikasi”, dan aliran elektron dipantulkan dengan sempurna darinya dan memberikan gambaran yang bagus. Hal ini memungkinkan untuk mempersiapkan bahan biologis dengan sempurna untuk pekerjaan, yang dibuktikan Dubochet dengan menerbitkan beberapa struktur virus yang diperoleh dengan metode ini pada tahun 1984.
Metode Dubochet: 1. Saringan logam ditempatkan pada sampel dan menyaring bahan berlebih. 2. Saringan ditempatkan dalam etana pada suhu sekitar -196°C, menyebabkan sampel membentuk lapisan tipis di seluruh lubang saringan. 3. Air berubah menjadi zat seperti kaca dan mengelilingi sampel, kemudian didinginkan oleh nitrogen cair pada pengamatan mikroskop elektron.
Johan Jarnestad/Akademi Ilmu Pengetahuan Kerajaan Swedia
Sejak saat itu, para peneliti mulai beralih ke Dubochet untuk mempelajari metodenya. Frank juga bertemu dengannya untuk mendapatkan struktur permukaan ribosom. Kombinasi metode Dubochet, Frank dan Henderson membentuk dasar mikroskop krioelektron.
Faktanya, kebutuhan untuk mendapatkan struktur ribosom “hidup”lah yang “memotivasi” keinginan untuk segera menguasai metode ini: ribosom adalah salah satu target utama tindakan antibiotik, yang mana penyelarasan spasial dengan lingkungan rongga ribosom sangat penting. Dan sekarang sebagian besar kompleks obat antimikroba potensial dengan ribosom “dilihat” menggunakan metode mikroskop krioelektron.
Metode ini menjadi sangat penting sehingga banyak konferensi besar diadakan di seluruh dunia yang didedikasikan khusus untuk metode CryoEM, sebagaimana disingkat dalam literatur berbahasa Inggris. Pada tahun 2017, konferensi serupa pertama diadakan di Universitas Negeri Moskow.
Keputusan Komite Nobel dikomentari secara khusus untuk situs tersebut oleh kandidat ilmu fisika dan matematika, kepala departemen biofisika molekuler dan radiasi dari Institut Fisika Nuklir St. Petersburg yang dinamai B.P. Konstantinov Andrey Konevega, yang kelompok risetnya sering menggunakan metode CryoEM dalam pekerjaannya:
“Mikroskopi krio-elektron telah merevolusi biologi struktural karena memungkinkan pencitraan makromolekul resolusi tinggi, sekarang dengan resolusi yang sama seperti kristalografi sinar-X, tanpa perlu mengkristalkan protein. Artinya, semua biomolekul selama penelitian berada dalam keadaan alaminya. Selama dekade terakhir, metode ini telah mengalami lompatan kualitatif dalam kualitas struktur yang dihasilkan dan resolusinya. Hal ini dimungkinkan berkat kemajuan teknologi: mikroskop baru, kamera baru, metode pemrosesan baru. Yang penting adalah para ahli biologi kini memiliki sistem komputasi yang cukup kuat sehingga memungkinkan pemrosesan memakan waktu berhari-hari, bukan berbulan-bulan atau bertahun-tahun. Kami sendiri di Rusia memiliki pusat pemrosesan data di Pusat Penelitian "" di Moskow dan di Pusat Penelitian "Kurchatov Institute"-PNPI di Gatchina, jadi kami secara aktif menggunakannya untuk memproses data kami."
Tentang penghargaan:
Selama 117 tahun, 109 hadiah diberikan dalam bidang kimia (seperti dalam disiplin ilmu lain, ada tahun-tahun ketika hadiah tidak diberikan karena perang atau ketika Komite Nobel tidak mencapai kesepakatan). Hadiah pertama diterima pada tahun 1901 oleh Jacob Hendrik van't Hoff. Selama seluruh periode, nama 178 pemenang diumumkan di Stockholm. Benar, hanya 177 orang yang menerima penghargaan tersebut: Frederick Sanger menjadi satu-satunya orang dalam sejarah yang menerima penghargaan tersebut dua kali.
Usia rata-rata pemenang hadiah (tidak termasuk hadiah tahun 2017) adalah 58 tahun. Yang termuda adalah Frédéric Joliot-Curie, yang menerima hadiah pada tahun 1935 pada usia 35 tahun, yang tertua adalah John Fenn: peraih Nobel tahun 2002 berusia 85 tahun. Ngomong-ngomong, hadiahnya tidak mudah bagi perempuan: dalam 117 tahun hanya ada empat pemenang, dan setengahnya berasal dari keluarga yang sama. Marie Curie menerima hadiah tersebut pada tahun 1911, dan putrinya Irene pada tahun 1935. Setengah lainnya untuk kristalografi sinar-X yang sama dengan mikroskop krioelektron yang bersaing. Pada tahun 1964, hadiah tersebut dianugerahkan kepada Dorothy Crowfoot Hodgkin untuk analisis difraksi sinar-X biomolekul, dan pada tahun 2009, pemenangnya adalah Ada Yonath, yang menggunakan teknik ini untuk menentukan struktur ribosom.
Hadiah Nobel Kimia tahun 2017 dianugerahkan kepada Jacques Dubochet, Joachim Frank, dan Richard Henderson atas pengembangan mikroskop krio-elektron mereka, yang memungkinkan mereka melihat molekul dalam organisme hidup dengan sangat detail dan resolusi sangat tinggi.
Jacques Dubouche adalah orang Swiss, bekerja di Universitas Lausanne, Swiss, Joachim Frank adalah orang Amerika dari Universitas Columbia, New York, AS, Richard Henderson adalah ilmuwan Inggris dari Cambridge (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK).
Ditekankan bahwa penelitian para pemenang, yang berlanjut pada tahun 70an - 90an abad terakhir, memberikan terobosan revolusioner dalam biologi, karena memungkinkan untuk melihat pertama kali apa yang sebelumnya sama sekali tidak terlihat - pada molekul biologis individu dan bahkan pada atom-atom yang menyusunnya.
Intinya, para ilmuwan telah memodernisasi mikroskop elektron. Sebelumnya, benda mati diamati menggunakan mikroskop elektron. Para pemenang mengadaptasinya untuk mengamati objek satwa liar. Kami belajar membekukannya dalam larutan air sehingga biomolekul mempertahankan bentuk dan sifatnya dan pada saat yang sama “diperbaiki” dalam bentuk yang nyaman untuk diamati.
Hasilnya, dengan bantuan mikroskop elektron, dimungkinkan untuk memperoleh gambar tiga dimensi dari benda hidup yang dimaksud. Pada tahun 2013, resolusi metode ini menjadi fenomenal. Gambar berbagai macam protein molekuler muncul, seperti protein yang membuat bakteri kebal terhadap antibiotik. Bahkan dimungkinkan untuk “memotret” virus - misalnya virus Zika. Yang menjanjikan kemenangan selanjutnya atas dirinya.
Para peneliti yang telah merambah ke dunia mikro mencatat: gambaran detail suatu objek tertentu adalah jalan terpendek untuk memahami esensinya. Artinya, untuk pengetahuan. Jelas bahwa Akademi Ilmu Pengetahuan Kerajaan Swedia, yang memberikan Hadiah Nobel, memiliki pendapat yang sama.
BANTU KP
Hadiah Nobel Kimia saat ini adalah yang ke-109. Di antara peraih penghargaan ini, penghargaan ilmiah paling terhormat di dunia sejak tahun 1901, adalah 4 wanita.
Ilmuwan Inggris Frederick Sandger, yang termasuk dalam daftar "100 jenius zaman kita", menerima Hadiah Nobel Kimia dua kali - pada tahun 1958 dan 1980. Pertama kali untuk menentukan urutan asam amino yang tepat dalam molekul insulin. Yang kedua - untuk mengembangkan metode untuk menguraikan struktur primer DNA.
Tahun lalu penghargaan tersebut diberikan kepada para ilmuwan dari Perancis, Amerika Serikat dan Belanda. Jean-Pierre Sauvage dari Prancis, Sir James Fraser Stoddart dari Amerika, dan Bernard L. Feringa dari Belanda dianugerahi penghargaan “untuk pengembangan dan sintesis mesin molekuler.” Para Lureates sebenarnya meletakkan dasar material untuk nanoteknologi.
Hadiah Nobel Kimia tahun 2017 dianugerahkan atas pengembangan mikroskop krioelektron resolusi tinggi untuk menentukan struktur biomolekul dalam larutan. Para pemenangnya berasal dari Universitas Lausanne, Joachim Frank dari Universitas Columbia dan dari Universitas Cambridge.
Mikroskop krio-elektron adalah suatu bentuk mikroskop elektron transmisi di mana sampel diperiksa pada suhu kriogenik.
Teknik ini populer dalam biologi struktural karena memungkinkan pengamatan spesimen yang belum diwarnai atau diperbaiki, menunjukkan lingkungan aslinya.
Kriomiroskopi elektron memperlambat pergerakan atom yang memasuki suatu molekul, yang memungkinkan seseorang memperoleh gambaran yang sangat jelas tentang strukturnya. Informasi yang diperoleh tentang struktur molekul sangatlah penting, termasuk untuk pemahaman yang lebih mendalam tentang kimia dan pengembangan obat-obatan.
Banyak terobosan dalam sains yang melibatkan keberhasilan visualisasi objek yang tidak terlihat oleh mata manusia. Mikroskop optik memungkinkan untuk membuktikan keberadaan mikroorganisme, melihat sperma dan sel telur, mempelajari sebagian struktur sel dan bahkan melihat kromosom. Mikroskop elektron, yang menggunakan berkas elektron sebagai pengganti fluks cahaya, memungkinkan mengatasi keterbatasan fisik teleskop optik.
Namun, dia juga memiliki kekurangan. Pertama, pancaran elektron yang kuat menghancurkan material biologis. Kedua, agar elektron dapat berakselerasi, mereka memerlukan ruang hampa - oleh karena itu, obat harus berada dalam ruang hampa.
Oleh karena itu, tidak mungkin mempelajari sampel “hidup” dengan bantuannya.
Kontribusi Joachim Frank berkontribusi pada penyebaran metode ini secara luas. Pada tahun 1975-1986, ia mengembangkan metode pemrosesan gambar, yang terdiri dari analisis gambar dua dimensi yang diperoleh dengan menggunakan mikroskop elektron dan membangun struktur tiga dimensi dari objek yang diteliti berdasarkan gambar tersebut.
Jacques Dubochet menyarankan penggunaan air yang didinginkan dengan cepat untuk mengawetkan sampel. Mendinginkan sampel sebagai cara untuk mengawetkannya telah dipertimbangkan oleh para ilmuwan selama beberapa waktu. Namun, ketika air membeku dan kisi kristal terbentuk, struktur sampel hancur. Dan dalam bentuk cair, ia menguap dalam ruang vakum mikroskop elektron, sekali lagi menyebabkan kehancuran molekul yang diteliti.
Akhirnya, ditemukan cara untuk melewati fase kristalisasi dan memastikan bahwa air berubah menjadi keadaan seperti kaca. Metode ini disebut vitrifikasi.
Selama vitrifikasi, air mampu melindungi molekul dari kehancuran bahkan dalam ruang hampa.
Penemuan ini memberikan dorongan yang kuat bagi perkembangan mikroskop elektron. Pada tahun 2013, para ilmuwan mampu memeriksa bahkan atom-atom materi secara individual. Resolusi tinggi tersebut memungkinkan untuk memeriksa ribosom dan mitokondria sel, saluran ion, dan kompleks enzim.
Pada tahun 2015, jurnal Nature Methods menobatkan mikroskop krioelektron partikel tunggal sebagai metode terobosan tahun ini.
Kemajuan teknis terkini di bidang ini telah memungkinkan para ilmuwan untuk beralih dari metode kristalografi sinar-X, kelemahan utamanya adalah kebutuhan untuk mengkristalkan protein, yang mungkin menyulitkan protein dengan struktur kompleks. Jurnal ilmiah dalam beberapa tahun terakhir penuh dengan gambaran detail permukaan virus Zika dan protein penyebab resistensi antibiotik. Secara khusus, kita dapat melihat bagaimana bakteri Staphylococcus aureus menolak tindakan antibiotik dan gambaran struktur virus corona yang menembus sel.
Meskipun kemajuan pesat dalam bidang ini, biaya peralatan dan metode standar telah memperlambat penerapan teknologi mikroskop krioelektron secara luas.
Di antara pesaing Hadiah Nobel Kimia adalah seorang Rusia - seorang peneliti terkemuka di Institut Fisika Kimia (ICP). N. N. Semenov, bersama dengan rekan-rekannya dari Amerika, memberikan kontribusi yang signifikan di bidang fungsionalisasi karbon-hidrogen - cabang yang mengembangkan metode baru untuk sintesis senyawa organik. Yang juga masuk dalam daftar kemungkinan pemenang adalah Jens Norskov dari Denmark atas kemajuan mendasar di bidang katalisis heterogen pada permukaan padat dan tim ahli kimia Tsutomu Miyasaki, Nam-Kyu Park, dan Henry Snaith atas penemuan mineral perovskit dan pengembangan berdasarkan mineral tersebut. .
Pada tahun 2016, hadiah diberikan kepada Jean-Pierre Sauvage, Stoddart, dan Bernard Feringa atas penemuan mesin molekuler.
Minggu lalu diumumkan bahwa Hadiah Nobel Kimia 2017 akan diberikan kepada Jacques Dubochet dari Swiss, Joachim Frank dari Jerman-Amerika, dan Richard Henderson dari Skotlandia atas “pengembangan teknik mikroskop krio-elektron resolusi tinggi untuk menentukan struktur tiga dimensi biomolekul. dalam solusi.” Pekerjaan mereka memungkinkan, mulai tahun 1980-an, untuk menguji dan secara bertahap meningkatkan jenis mikroskop ini sedemikian rupa sehingga dalam beberapa tahun terakhir para ilmuwan dapat memeriksa molekul biologis kompleks dengan sangat rinci. Komite Nobel mencatat bahwa mikroskop krio-elektron telah membawa biokimia ke era baru, mengisi banyak kesenjangan dalam pengetahuan tentang molekul kehidupan dan sistem kehidupan.
Mari kita segera mencatat bahwa hampir tidak mungkin untuk menyebut mikroskop elektron kriogenik sebagai metode yang secara fundamental baru dan mandiri untuk mempelajari materi secara fisik. Sebaliknya, ini adalah jenis mikroskop elektron transmisi (salah satu penulis metode ini, Ernst Ruska, menerima Hadiah Nobel pada tahun 1986), yang secara khusus diadaptasi untuk mempelajari objek mikrobiologi.
Dalam mikroskop elektron transmisi, seberkas elektron dilewatkan melalui sampel yang cukup tipis sehingga menjadi transparan terhadap elektron (biasanya sepersepuluh dan seperseratus mikron), yang ketika melewati sampel, diserap dan dihamburkan, mengubah arah. pergerakan. Perubahan ini dapat didaftarkan (saat ini matriks CCD paling sering digunakan sebagai detektor, yang penciptanya, Willard Boyle dan George Smith, menjadi pemenangnya) dan, setelah dianalisis, memperoleh gambar objek yang diteliti di dalam pesawat. tegak lurus terhadap balok. Karena panjang gelombang intrinsik elektron (puluhan pikometer pada karakteristik energi mikroskop elektron) jauh lebih pendek daripada panjang gelombang cahaya di wilayah tampak (ratusan nanometer), mikroskop elektron dapat “melihat” detail yang jauh lebih halus daripada mikroskop optik, termasuk termasuk mikroskop fluoresensi resolusi tinggi (HRFM), dikembangkan oleh pemenang Eric Betzig, Stefan Hell dan William Moerner.
Resolusi maksimum mikroskop elektron - beberapa angstrom (sepersepuluh nanometer) - hampir tercapai. Hal ini memungkinkan untuk memperoleh gambar yang, misalnya, atom individu dapat dibedakan. Sebagai perbandingan: batas kemampuan HRFM adalah 10-20 nm. Namun membandingkan metode yang berbeda berdasarkan resolusi maksimum saja tidak ada gunanya. Mikroskop elektron memiliki resolusi tinggi, tetapi tidak selalu memungkinkan untuk digunakan. Faktanya adalah bahwa sampel, selain dihancurkan selama persiapan, selama penelitian itu sendiri juga mengalami penyinaran yang cukup serius dengan berkas elektron (secara kasar, semakin kuat berkasnya, semakin sedikit kesalahan dan semakin baik hasilnya), sedangkan berada dalam ruang hampa (ruang hampa diperlukan agar media tidak menyebarkan elektron di luar sampel, sehingga menimbulkan distorsi yang tidak perlu). Kondisi seperti itu sama sekali tidak cocok jika Anda perlu mempelajari molekul dan objek biologis yang kompleks - mereka rusak dalam lingkungan yang dijernihkan dan terdapat banyak ikatan yang agak lemah di dalamnya yang akan hancur begitu saja selama penelitian.
Pemahaman bahwa tanpa perbaikan tambahan, mikroskop elektron tidak dapat disesuaikan dengan studi biomolekul dan sistem kehidupan muncul segera setelah penemuannya. Misalnya, fisikawan Hongaria Ladislav Marton menulis tentang hal ini tiga tahun setelah demonstrasi prinsip operasi mikroskop elektron oleh Ernst Ruska pada tahun 1931 (L. Marton, 1934. Mikroskop Elektron Benda Biologi). Dalam artikel yang sama, Marton juga mengusulkan cara untuk mengatasi masalah ini. Secara khusus, ia juga menunjukkan bahwa pembekuan sampel dapat mengurangi kerusakan akibat penyinaran berkas elektron. Penting untuk dicatat bahwa, meskipun tidak disebutkan dalam makalah Marton, membekukan sampel juga membantu mengurangi getaran termal molekul, yang juga meningkatkan kualitas gambar yang dihasilkan.
Pada tahun 1970-an dan 80-an, ilmu pengetahuan dan teknologi mencapai tingkat perkembangan yang cukup untuk mengatasi segala kesulitan. Dan hal ini sebagian besar terjadi berkat upaya para pemenang penghargaan tahun ini.
Richard Henderson adalah orang pertama yang menggambarkan protein asimetris pada resolusi atom menggunakan mikroskop elektron transmisi (dengan sampel didinginkan). Dia memulai penelitiannya pada pertengahan tahun 70an. Apalagi pada awalnya Henderson mencoba memperoleh struktur beberapa protein dari membran sel, dengan menggunakan metode analisis difraksi sinar-X, yang itupun dapat memberikan resolusi beberapa angstrom. Namun, dengan cepat menjadi jelas bahwa metode ini tidak dapat mencapai hasil yang baik: zat yang diteliti harus dalam bentuk kristal, dan protein membran, yang diekstraksi dari lingkungannya, mengkristal dengan buruk atau bahkan kehilangan bentuknya. Kemudian dia beralih ke mikroskop elektron.
Protein spesifik dipilih - bakteriorhodopsin - dan diputuskan untuk tidak mengekstraknya dari membran, tetapi untuk mempelajarinya langsung di dalamnya. Para ilmuwan juga melapisi sampel dengan larutan glukosa untuk melindunginya agar tidak mengering dalam ruang hampa. Hal ini membantu memecahkan masalah pemeliharaan struktur. Kemudian Henderson dan rekan-rekannya dihadapkan pada masalah penghancuran sampel di bawah pengaruh berkas elektron yang telah dijelaskan. Kombinasi beberapa faktor membantu menyelesaikannya.
Pertama, bakteriorhodopsin terletak secara teratur di dalam membran, jadi pertimbangan yang cermat terhadap keteraturan ini dikombinasikan dengan pengambilan gambar dari sudut yang berbeda sangat membantu dalam membuat gambar. Hal ini membantu mengurangi intensitas sinar dan mempersingkat waktu pemaparan, namun meningkatkan kualitas. Sudah pada tahun 1975, gambar protein ini dapat diperoleh dengan resolusi 7 angstrom (Gbr. 3, lihat R. Henderson, P. N. T. Unwin, 1975. Model tiga dimensi membran ungu diperoleh dengan mikroskop elektron).
Kedua, Henderson berkesempatan melakukan perjalanan ke berbagai pusat penelitian dan mencoba berbagai mikroskop elektron. Karena tidak ada penyatuan pada tahun-tahun itu, mikroskop yang berbeda memiliki kelebihan dan kekurangannya masing-masing: derajat evakuasi ruang yang berbeda, derajat pendinginan sampel yang berbeda (ini mengurangi kerusakan akibat iradiasi elektron), energi berkas elektron yang berbeda, dan sensitivitas detektor yang berbeda. Oleh karena itu, kemungkinan mempelajari objek yang sama pada mikroskop yang berbeda memungkinkan untuk terlebih dahulu memilih kondisi yang “paling tidak menguntungkan” untuk memperoleh suatu gambar, dan kemudian secara bertahap memperbaikinya. Jadi Henderson mengumpulkan data dan memperoleh struktur bakteriorhodopsin yang lebih akurat. Pada tahun 1990, artikelnya diterbitkan, yang menyajikan model protein ini dengan resolusi atom (R. Henderson et al., 1990. Model struktur bakteriorhodopsin berdasarkan cryo-mikroskopi elektron resolusi tinggi).
Dalam penelitian perintis ini, Henderson menunjukkan bahwa mikroskop krio-elektron dapat menghasilkan gambar dengan resolusi sebaik difraksi sinar-X, sebuah terobosan pada saat itu. Benar, hasil ini secara signifikan mengeksploitasi fakta bahwa bakteriorhodopsin secara teratur terletak di membran sel, dan tidak jelas apakah resolusi tersebut dapat dicapai untuk molekul “tidak beraturan” lainnya.
Masalah pemrosesan sinyal lemah dari molekul aktif biologis yang ditempatkan secara acak diselesaikan oleh pemenang Hadiah Nobel 2017 lainnya, Joachim Frank. Kontribusi utamanya pada mikroskop krio-elektron adalah penciptaan algoritma untuk menganalisis gambar dua dimensi yang diperoleh dengan menggunakan mikroskop krio-elektron, yang memungkinkan pembangunan model tiga dimensi berkualitas tinggi. Algoritma serupa telah dikembangkan untuk teknik mikroskop lainnya. Frank mengoptimalkan dan menyempurnakan metode analisis matematis yang memungkinkan untuk memisahkan informasi berguna yang diperoleh dari mikroskop elektron dari sinyal akibat kebisingan. Kebisingan terjadi pada perangkat elektronik presisi karena berbagai alasan: fluktuasi acak pada arus dan tegangan mungkin disebabkan oleh emisi elektron yang tidak merata di blok vakum, proses pembentukan dan rekombinasi pembawa muatan yang tidak merata (elektron konduksi dan lubang) di blok semikonduktor, pergerakan termal dari pembawa arus dalam konduktor (kebisingan termal), atau kebisingan eksternal (terlepas dari kenyataan bahwa semuanya biasanya terisolasi dengan baik).
Tugas ini semakin rumit karena hal ini. Jika objek, meskipun sama atau kira-kira sama, seperti yang seharusnya terjadi dalam penelitian semacam itu, tidak teratur, maka objek tersebut memberikan sinyal yang strukturnya sedikit berbeda, yang dapat mengaburkan satu sama lain. Selain itu, alasan keburaman tersebut - apakah itu noise atau kesalahan algoritma - tidak mudah untuk ditentukan. Prinsip pemrosesan data ditunjukkan secara skematis pada Gambar. 5: banyak gambar datar dari molekul yang diteliti dibersihkan dari noise dan diketik menurut "sudut", kemudian profil berkualitas lebih tinggi dibuat dari gambar dengan sudut dekat, dan, terakhir, model tiga dimensi dibuat dari profil ini. .
Pada tahun 1981, Frank merangkum model matematika dalam versi pertama program komputer SPIDER (System for Processing Image Data from Electron microscopy and Associated field - Sistem untuk memproses data dari mikroskop elektron dan bidang terkait, pertama kali diterbitkan: J. Frank dkk. , 1981. Spider - Sistem perangkat lunak modular untuk pemrosesan gambar elektron). Paket perangkat lunak ini masih ada dan diperbarui hingga saat ini; terlebih lagi, program-program ini didistribusikan secara gratis, yang tentunya memudahkan pekerjaan para ilmuwan di seluruh dunia. Frank menggunakan algoritmanya sendiri untuk mendapatkan gambar permukaan ribosom - organel sel yang terdiri dari untaian RNA dan protein terkait yang berfungsi untuk biosintesis protein dari asam amino berdasarkan informasi genetik.
Awalan "cryo-" muncul dalam mikroskop elektron berkat pemenang ketiga, Jacques Dubochet. Dia mengembangkan metode pendinginan cepat larutan berair dengan sampel (J. Dubochet, A. W. McDowall, 1981. Vitrifikasi air murni untuk mikroskop elektron). Selain itu, air harus membeku begitu cepat sehingga molekul-molekulnya tidak punya waktu untuk berbaris dalam kisi kristal, membeku secara acak (lihat es amorf). Hal ini dicapai dengan merendam lapisan tipis larutan dengan sampel secara cepat ke dalam wadah berisi etana cair yang didinginkan hingga –160°C (Gbr. 6). Metode pembekuan yang benar dapat disebut sebagai kunci keberhasilan keseluruhan metode, karena kristal es yang teratur dapat menyebabkan difraksi elektron, sehingga mendistorsi informasi tentang molekul yang diteliti. Karena berat molekul protein dan asam nukleat yang besar, molekul-molekul ini menjadi kikuk, sehingga ketika dibekukan tidak sempat mengubah posisinya atau berubah bentuk. Artinya, struktur molekul yang aktif secara biologis tidak berubah selama pembekuan cepat dengan metode ini. Dengan menggunakannya, Dubochet adalah orang pertama yang menggunakan mikroskop krio-elektron untuk mempelajari struktur virus (Gbr. 7, lihat M. Adrian et al., 1984. Mikroskop virus krio-elektron).
Selama tahun 1990-an dan 2000-an, mikroskop krio-elektron secara bertahap berkembang dan ditingkatkan seiring dengan kemajuan dalam daya komputasi dan presisi instrumen. Namun perkembangan mikroskop krioelektron yang sebenarnya dimulai pada tahun 2012. Hal ini terkait dengan munculnya detektor elektron langsung berbasis CMOS (CMOS), yang dapat langsung menangkap elektron yang melewati suatu sampel. Hal ini memungkinkan penyederhanaan desain mikroskop elektron dengan menghilangkan sistem pemfokusan dan konversi sinyal yang rumit serta mengurangi jumlah node yang dapat menimbulkan gangguan acak. Hasilnya, resolusi metode mikroskop krioelektron meningkat menjadi 2-3 angstrom (Gbr. 8).
Salah satu contoh penerapan praktis mikroskop krioelektron di bidang ini adalah studi tentang virus Zika (Gbr. 10). Selama merebaknya epidemi Zika di Brazil pada tahun 2016, para peneliti hanya membutuhkan beberapa bulan untuk memperoleh informasi tentang struktur virus menggunakan mikroskop krio-elektron (D. Sirohi et al., 2016. Struktur cryo-EM resolusi 3,8 Å dari virus Zika).
Contoh lain - tahun ini, mikroskop krioelektron memungkinkan untuk memperoleh struktur kapsid dari perwakilan terbesar keluarga virus herpes - sitomegalovirus manusia (X. Yu et al., 2017. Struktur atom kapsid sitomegalovirus manusia dengan komposisinya mengamankan lapisan tegument pp150). Hasil penelitian tersebut menjadi dasar pencarian kemungkinan wilayah kapsid virus yang dapat menjadi target molekuler obat antivirus.
Arkady Kuramshin
