Yersinia pestis padermių pagrindinio ir smulkaus porūšio biocheminių savybių genetinė analizė Odinokov, Georgijus Nikolajevičius.

Įvadas į darbą

Problemos aktualumas. Maras yra zoonozinė natūrali židininė, ypač pavojinga karantininė bakterinė infekcinė liga, turinti perduodamą patogenų perdavimo mechanizmą [Cherkassky, 1996]. Maras kelia realią grėsmę gyventojams dėl daugybės natūralių maro židinių, kai kurie iš jų yra Rusijos Federacijoje ir kaimyninėse šalyse [Onshtsenko ir kt., 2004]. Didelė tikimybė, kad maro sukėlėjas į Rusiją bus atvežtas iš kaimyninių šalių, kurios nepaliestos šia liga, taip pat dėl ​​bioteroristinių veiksmų. PSO duomenimis, kasmet visame pasaulyje užregistruojama daugiau nei 2000 maro atvejų, daugelis iš jų yra mirtini. 2009 m. Kinijos Hainano Tibeto autonominiame regione įvyko didelis pneumoninio maro protrūkis, kuriame taip pat buvo pranešta apie daugybę mirčių. Dėl visų šių faktų skubiai reikia sukurti naujus, itin veiksmingus, šiuolaikinėmis technologijomis pagrįstus maro sukėlėjo diagnostikos metodus bei jo sukeliamos ypač pavojingos ligos profilaktikos ir gydymo priemones.

Iki šiol naudotos klasifikacijos Yersinia pestis buvo atsižvelgta tik į morfologines, kultūrines, biochemines ir kitas fenotipines charakteristikas [Bezsonova, 1928; Borzenkovas, 1938 m.; Tumanskis, 1957; Timofejeva, 1968 m.; Kutyrev, Protsenko, 1998; Devignat, 1951] ir nebuvo be trūkumų, susijusių su šių savybių kintamumu. Tačiau naujausi fundamentinės genetikos ir molekulinės mikrobiologijos pažanga leidžia maro sukėlėjo sisteminimo problemų sprendimą perkelti į kokybiškai naują lygmenį, remiantis jo molekulinių genetinių savybių panaudojimu.

Pagal šiuo metu priimtą vidaus klasifikaciją maro sukėlėjo padermės skirstomos į pagrindinį ir 4 mažuosius (Kaukazo, Altajaus, Gissaro ir Ulegey) porūšius [Timofejeva, 1985; Kutyrev, Protsenko, 1998]. Pagal bendrą užsienio klasifikaciją, štamai Y. pestis Remiantis daugelio biocheminių savybių skirtumais (gebėjimas fermentuoti glicerolį, redukuoti nitratus, oksiduoti amoniaką) ir istoriniu bei geografiniu pagrindu, jie skirstomi į tris biologinius variantus: antiqua (senovės), medievalis (viduramžių) ir orientalis (rytų). ). Pagal fenotipines savybes pagrindinio porūšio padermės atitinka tris užsienio klasifikacijoje priimtus biovarus (senovės, viduramžių ir rytų). Tačiau padermės Y. pes-

4 tis natūraliuose maro židiniuose cirkuliuojantys Rusijos Federacijoje ir kaimyninėse šalyse lieka nesusisteminti pagal priklausymą tam tikriems biovarams.

Pagal skirtingai reikšmingų biocheminių savybių raišką, aktyviausios yra senojo biovaro padermės, kurios fermentuoja glicerolį ir pasižymi denitrifikaciniu aktyvumu ". pestis nesugeba redukuoti nitratų, bet fermentuoja glicerolį ir arabinozę; Rytinio biovaro padermės nefermentuoja glicerolio, bet aktyviai mažina nitratus ir utilizuoja arabinozę.

Rusijos Federacijoje ir kaimyninėse šalyse cirkuliuojančios pagrindinių porūšių padermės, kaip taisyklė, yra labai virulentiškos ir turi didelę epideminę reikšmę. Jie nefermentuoja ramnozės ir melibiozės, nėra jautrūs PESTICE I, pasižymi dideliu izocitralazės gamybos lygiu. Smulkių porūšių padermės fermentuoja ramnozę ir melibiozę, yra jautrios pesticinui I, nepasižymi izocitrato-liazės aktyvumu, yra selektyviai virulentiškos laboratoriniams gyvūnams ir yra nedidelės epidemijos reikšmės.

Skirtingos biocheminių savybių raiškos genetinės priežastys ir dalijimuisi naudojamos padermės Y. pestisį biovarus ir porūšius iki šiol nėra pakankamai ištirta. Vienintelis patikimai nustatytas dalykas yra tai, kad rytinio biovaro padermių glicerolio fermentacijos trūkumo priežastis yra glicerolio-3-fosfato dehidrogenazės geno mutacija. (glpD). Buvo parodyta, kad šiame gene visose rytinio biovaro padermėse yra 93 bp delecija. . Literatūroje yra tik keli darbai apie genų struktūros skirtumus Y. pestis pagrindinis ir šalutinis porūšis, atsakingas už nitratų mažinimą ir ramnozės fermentaciją [Kukleva et al., 200 2009; Anisimov ir kt., 2004; Zhou ir kt., 2004].

Maro padermių nevienalytiškumo priežastys mitybos poreikių požiūriu lieka nežinomos. Įvairių natūralių maro židinių padermės skiriasi mitybos poreikiais, kuriuos lemia tarpinių medžiagų apykaitos genų sutrikimai, kurie gali būti panaudoti genetinėje padermių diferenciacijos schemoje. Y. pestis nuo įvairių natūralių maro židinių.

Genų struktūros pokyčių, lemiančių skirtingą mikrobiologinių ir biocheminių požymių raišką, nustatymas bus patikima informacija kuriant genetinę schemą maro patogeno padermėms klasifikuoti, taip pat nustatyti pagrindines intraspecifinės evoliucijos kryptis. Y. pestis.

5 Darbo tikslas. Skirtingos biocheminių charakteristikų, naudojamų maro sukėlėjo padermėms skirstant į porūšius ir biovarus, genetinio pagrindo nustatymas.

Tyrimo tikslai:

Apibūdinkite darbe naudojamas padermes Y. pestis, išskirtas natūraliuose maro židiniuose Rusijos Federacijoje ir kaimyninėse šalyse, pagal biochemines savybes (nitratų redukcija, izocitrato liazės gamyba, arabinozės ir melibiozės fermentacija), kuriomis grindžiamas skirstymas į porūšius ir biovarus. Nustatyti, ar Rusijoje ir kaimyninėse šalyse cirkuliuojančios padermės priklauso tam tikriems biovarams.

Ištirti genų, koduojančių diferencines charakteristikas, naudojamų skirstant į biovarus – nitratų redukciją ir arabinozės fermentaciją, struktūrinę ir funkcinę organizaciją.

Nustatykite genų pokyčius Y. pestis, nustatantis melibiozės fermentaciją ir izocitrato liazės gamybą, kurios yra pagrindinės ir smulkesnės maro sukėlėjo porūšių diferenciacijos pagrindas.

Nustatykite padermių mitybos poreikius Y. pestis Kaukazo porūšius ir nustatyti jų auksotrofijos genetinį pagrindą.

Įvertinti perspektyvas panaudoti gautus rezultatus kuriant genetinę schemą intraspecifinei padermių klasifikacijai Y. pestis ir nustatyti pagrindines šio patogeno intraspecifinės evoliucijos kryptis.

Mokslinis darbo naujumas. Remiantis išsamios mikrobiologinės, biocheminės ir genetinės analizės duomenimis, nustatyta, kad Rusijos Federacijos ir kaimyninių šalių gamtiniuose židiniuose cirkuliuojančios maro sukėlėjo padermės priklauso senovės ir viduramžių biovarams.

Pirmą kartą buvo įrodyta, kad kai kurių Rusijos Federacijoje ir kaimyninėse šalyse cirkuliuojančių pagrindinių porūšių padermių nitratus redukuojančio aktyvumo trūkumo priežastis yra vieno nukleotido pakaitalas G -»T 613 pozicijoje. periplazminis nitrato reduktazės genas - pora, kas įrodo, kad šios padermės priklauso viduramžių biovarui. Šio požymio raiškos trūkumas Altajaus ir Gissar porūšių padermėse atsiranda dėl to, kad užkrūčio liaukos nukleotidas (+T) yra įterptas į kito geno 302 padėtį. ssuA, o tai lemia skaitymo rėmo poslinkį ir užkoduoto transportinio baltymo – SsuA, taip pat dalyvaujančio nitratų mažinime, struktūros sutrikimą.

Pirmą kartą buvo nustatyta, kad padermėse nėra arabinozės fermentacijos] pestis Altajaus ir Hissar porūšiai yra susiję su arabinozės operono reguliavimo geno mutacija - taipS, kuriame yra guanino nukleotido (+G) įterpimas 773 padėtyje nuo geno pradžios, dėl kurio atsiranda kadrų poslinkis ir reguliuojamo baltymo AgaC, kuris yra būtinas arabinozės operono genų transkripcijai inicijuoti, struktūra. .

Pirmą kartą buvo nustatytas skirtingos izocitr-liazės gamybos pagrindinio ir mažo porūšio maro patogeno padermėse genetinis pagrindas, susijęs su dviejų nukleotidų (+CC) įterpimu į reguliavimo geną. iclR 26 pozicijoje! 270, kuris sukelia jo koduojamo acetato operono represoriaus baltymo IclR inaktyvavimą ir yra pagrindinės porūšio padermėse vykstančios fermento izocitrliazės konstitucinės sintezės priežastis. Smulkių porūšių padermėse yra shtakto genas iclR ir nesugeba konstitucinės izocitrato liazės sintezės.

Įrodyta, kad melibiozės fermentacijos padermėse nėra Y. pestis pagrindinis potipis atsiranda dėl įterpimo sekos įvedimo IS285 genas melB, koduojančių fermentą galaktozido permeazę. Nepagrindinių porūšių padermėse IS2&5 įterpimas į geną melB nėra.

Pirmą kartą Kaukazo porūšių padermių, kurios yra susijusios, auksotrofijos genetinis pagrindas Suįterpimo sekų įvedimas IS100 genai argA Ir aroF,įterpti 10 bp. į geną aroG, timino nukleotido geno įterpimas thiHv. 13 bp ištrynimas gene thiG.

Gautos padermių molekulinės charakteristikos Y. pestis Pagrindinis ir neo-naujas porūšis, pagrįstas genais, koduojančiais biochemines savybes, kuriomis grindžiamas skirstymas į porūšius ir biovarus, sukuria pagrindą genetinės schemos, skirtos maro sukėlėjo intraspecifinei klasifikacijai, sukūrimui.

Remiantis darbo rezultatais, buvo pateiktos paraiškos išradimui „Maro sukėlėjų padermių porūšių nustatymo sekvenavimo metodu metodas“ (Nr. 2009116913. Prioritetas 2009 m. gegužės 14 d. Gautas sprendimas išduoti patentą ir „ Padermių porūšio diferenciacijos metodas Yersinia pestis daugiasluoksnės sekos tipavimo metodu (Nr. 2009146094. Pirmenybė nuo 11.12.2009).

Praktinė darbo reikšmė. Remiantis darbo rezultatais, parengtos ir patvirtintos metodinės rekomendacijos „Maro sukėlėjų padermių porūšių nustatymas remiantis genų sekos nustatymu“. rhaS Ir taipS, ramnozės ir arabinozės fermentacijos kontrolė“ (patvirtinta RosNIHR „Microbe“ direktoriaus. 2009 m. birželio 16 d. protokolas Nr. 6) ir „Porūšių nustatymas;

7 deformacijos charakteristikos Yersinia pestis kelių lokusų sekos tipavimo metodu (patvirtintas RosNIPCI „Microbe“ direktoriaus. 2010 m. vasario 23 d. protokolas Nr. 1).

Trys padermės yra saugomos Valstybinėje patogeninių bakterijų kolekcijoje: Y. pestis Altajaus KM 910, Gissar KM 596 ir Ulega porūšių KM 1861 kaip etaloninės šių porūšių padermės.

Tyrimo metu gauti duomenys apie genetinę padermių organizaciją Y. pestis naudojami skaitant paskaitas tema „Maro sukėlėjo genetika“ RosNIPCI „Mikrobas“ specializacijos ir kvalifikacijos kėlimo kursuose.

Gynybos nuostatos:

Pagrindinio porūšio maro sukėlėjo padermės, cirkuliuojančios natūraliuose Rusijos Federacijos ir kaimyninių šalių židiniuose, priklauso senovės ir viduramžių biovarams, tai rodo išsamios šių padermių mikrobiologinių, biocheminių ir genetinių savybių analizės duomenys.

Skirtingų biocheminių charakteristikų apraiškų pagrindas, naudojamas dalijant padermes Y. pestis porūšiuose ir biovaruose yra skirtingų tipų mutacijų šiuos požymius koduojančiuose genuose. Nesugebėjimas sumažinti nitratų pagrindinių viduramžių biovaro porūšių padermių yra susijęs su nesąmoningos mutacijos (G-T) buvimu gene. pora periplazminė nitratų reduktazė, o Altajaus ir Gissaro porūšių padermėse - į geną įterpus vieną nukleotidą ssuA periplazminis transportinis baltymas SsuA. Arabinozės fermentacijos nebuvimas Altajaus ir Gissaro porūšių padermėse yra dėl to, kad į genų seką įterptas guanino nukleotidas. taipS.

Skirtingą maro sukėlėjo pagrindinio ir smulkaus porūšio padermių biocheminį aktyvumą pagal daugybę skirtingų charakteristikų lemia juos koduojančių genų sumažėjimas pagrindiniame porūšyje ir nepažeistumas mažame porūšyje. Pagrindinių porūšių padermių melibiozės fermentacijos nebuvimas yra dėl patekimo į geną. melB galaktozido permeazė, o konstitucinė izocitrato liazės sintezė šio porūšio padermėse yra dviejų nukleotidų (CC) įterpimas į reguliavimo geno seką. iclR. Smulkių porūšių padermėse yra nepažeistų genų melB Ir iclR.

Daugelio padermių mitybos poreikių priežastis Y. pestis Kaukazo porūšis yra daugelio genų, skirtų aminorūgščių ir vitaminų biosintezei, inaktyvavimas. Šio porūšio padermių priklausomybę nuo arginino sukelia IS70O įterpimas į geną argA, fenilalaninui – įterpti 10 bp. į geną aroG, tirozinui – įterpimas IS100į geną aroF, tiaminui (BO pašalinus 13 bp – gene thiG ir singlo įterpimas

8-asis nukleotidas MN. Remiantis visu Kaukazo ir kitų porūšių padermių nustatytų mutacijų, taip pat maro patogeno biovarų kompleksu, buvo nustatyti būdingi genotipai, kuriuos galima panaudoti kuriant genetinę intraspecifinės klasifikacijos schemą. Y. pestis.

Darbo aprobavimas. Disertacijos medžiaga pristatyta ir aptarta IX tarpvalstybinėje NVS valstybių narių mokslinėje ir praktinėje konferencijoje „Šiuolaikinės technologijos įgyvendinant pasaulinę kovos su infekcinėmis ligomis strategiją Nepriklausomų Valstybių Sandraugos valstybių narių teritorijoje“, Volgogradas. , 2008; VI tarptautinė konferencija „Molecular Diagnostics and Biosafety“, M., 2009; Federalinės vartotojų teisių apsaugos ir žmogaus gerovės priežiūros tarnybos jaunųjų mokslininkų ir specialistų konferencijos „Šiuolaikinės biologinės saugos užtikrinimo technologijos“ mokslinė ir praktinė mokykla, 2010 m. gegužės 25 - 27 d.; kasmetinėse baigiamose RosNIPCI „Microbe“ konferencijose, Saratovas 2008–2010 m.

Diplominis darbas

Odinokovas, Georgijus Nikolajevičius

Akademinis laipsnis:

Biologijos mokslų kandidatas

Baigiamojo darbo gynimo vieta:

HAC specialybės kodas:

03.02.03, 03.02.07

Specialybė:

Mikrobiologija

Puslapių skaičius:

ĮVADAS

1 SKYRIUS. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Šiuolaikinės idėjos apie 15-ojo maro sukėlėjo genomo organizavimą

1.2. Yersinia pestis tarprūšinės klasifikacijos schemos 28 SAVO TYRIMAI

2 SKYRIUS. MEDŽIAGOS IR METODAI

2.1. Darbe naudojamos bakterijų padermės ir jų auginimo sąlygos 36

2.2. Denitrifikacinio aktyvumo, glicerolio, arabinozės, ramnozės, melibiozės, izocitralazės gamybos Y. pestis padermių 46 gamybos tyrimo metodai.

2.3. Y. pestis padermių mitybos poreikių nustatymas

2.4. Bakterijų DNR išskyrimas

2.5. Polimerazės grandininės reakcijos vykdymas

2.6. Elektroforetinis rezultatų registravimas

2.7. Genų nukleotidų sekų nustatymas

2.8. Filogenetinės analizės atlikimas

3 SKYRIUS. Y. pestis PIRMINIŲ IR NE PAGRINDINIŲ SUBJEKTŲ MIKROBIOLOGINIŲ IR BIOCHINIŲ SAVYBIŲ ANALIZĖ

MARAS DĖMESIO

3.1. Y. pestis padermių iš įvairių natūralių maro židinių charakteristikos pagal biochemines charakteristikas, kuriomis grindžiamas skirstymas į porūšius ir biovarus

3.2. Kaukazo porūšio K resNB padermių mitybos poreikių nustatymas

4 SKYRIUS. STRUKTŪRINIŲ-FUNKCINIŲ GENŲ, KODUOJANČIŲ BIOCHEMINES CHARAKTERISTES, NUSTATYMAS, NAUDOJAMŲ MARO PRIEŽASTĖS BIOVARŲ DIFFERENCIJAI

4.1. Operono 60 porų genų ir kitų genų, koduojančių nitratų redukciją, struktūrinės ir funkcinės organizacijos nustatymas

4.2. K. operono padermių arabinozės operono genų nukleotidų sekų kintamumo lyginamoji analizė

5 SKYRIUS. GENŲ, KODUOJANČIŲ 83 DIFERENCIALIAS CHARAKTERISTIKAS, POKYČIŲ IDENTIFIKAVIMAS, VARTOJAMAS SKIRSTYJANT MARO PRIEŽASTĮ Į PAGRINDINIUS IR NE PAGRINDINIUS SUBJEKTUS

5.1. 83 pagrindinio ir smulkaus porūšio maro sukėlėjo, koduojančio melibiozės fermentaciją, genų struktūros pokyčių identifikavimas.

5.2 U. periasus padermių izocitrato liazės biosintezės genų mutacijų nustatymas

6 skyrius

6.1. Arginino biosintezėje dalyvaujančių genų nukleotidų sekų kintamumo lyginamoji kompiuterinė analizė

6.2. Fenilalanino, tirozino ir 101 vitamino B1 (tiamino) biosintezės genų mutacijų aptikimas

6.3. Arginino, fenilalanino, tirozino ir vitamino B1 (tiamino) biosintezės genų struktūrinės ir funkcinės būklės tyrimas Kaukazo porūšio padermėse

7 SKYRIUS. GAUTŲ DUOMENŲ PERSPEKTYVUMŲ KURTI GENETINĘ SCHEMĄ, KURIĄ SUKURTI MARO PRIEŽASTINIO NAUDOTOJO TARPINĖS KLASIFIKACIJOS, VERTINIMAS

Disertacijos įvadas (santraukos dalis) Tema „Pagrindinio ir smulkaus porūšio Yersinia pestis padermių biocheminių savybių genetinė analizė“

Problemos aktualumas

Maras yra zoonozinė natūrali židininė, ypač pavojinga karantininė bakterinė infekcinė liga, turinti perduodamą patogenų perdavimo mechanizmą [Cherkassky, 1996]. Maras kelia realią grėsmę gyventojams, nes egzistuoja daugybė natūralių maro židinių, iš kurių 42 yra Rusijos Federacijoje ir kaimyninėse šalyse [Onischenko ir kt., 2004]. Egzistuoja pavojus, kad maro sukėlėjas į Rusiją atkeliaus iš kaimyninių, šios ligos nepaliestų šalių, taip pat dėl ​​bioteroristinių veiksmų. PSO duomenimis, kasmet visame pasaulyje užregistruojama daugiau nei 2000 maro atvejų, daugelis iš jų yra mirtini. 2009 m. Kinijos Hainano Tibeto autonominiame regione įvyko didelis pneumoninio maro protrūkis, kuriame taip pat buvo pranešta apie daugybę mirčių. Dėl visų šių faktų skubiai reikia sukurti naujus, itin efektyvius, šiuolaikinėmis technologijomis pagrįstus maro sukėlėjo diagnostikos metodus, jo sukeliamos ypač pavojingos ligos profilaktikos ir gydymo priemones.

Iki šiol naudotose Yersenia pestis klasifikacijose buvo atsižvelgta tik į morfologines, kultūrines, biochemines ir kitas fenotipines savybes bei patogeninių padermių virulentiškumo skirtumus [Bezsonova, 1928; Berlynas A.JL ir kt., 1938; Tumanskis, 1959; Timofejeva, 1972; Kutyrev ir kt., 1998; Devignat, 1951; Dale ir kt., 2002; Cobbs ir kt., 2004; Dennis ir kt., 2004; Lazarus ir kt., 2004]. Tokios klasifikacijos, žinoma, prisidėjo prie Y. pestis sisteminimo ir paprastai atspindi realiai egzistuojančius filogenetinius ryšius šioje rūšyje. Jie neprarado savo reikšmės iki šių dienų ir vis dar plačiai naudojami praktinėje mikrobiologijoje. Tačiau naujausi fundamentinės genetikos ir molekulinės mikrobiologijos pasiekimai leidžia maro sukėlėjo sisteminimo problemų sprendimą perkelti į kokybiškai naują lygmenį. Remiantis jo molekulinių genetinių ypatybių panaudojimu, esamos maro patogeno klasifikacijos vertimas genetiniu pagrindu pagerins sisteminimo patikimumą, patikimumą ir kokybę, taip pat išvengs klasikinėms schemoms būdingų trūkumų, atsirandančių dėl maro kintamumo. patogeno fenotipinės savybės Bakterijos genomas turi gana konservatyvią struktūrą, apsaugotas nuo atsitiktinių pokyčių DNR atkūrimo sistemomis, todėl genetinės diferenciacijos schemos yra patikimesnės, atkuriamos ir turi didesnę skiriamąją gebą, palyginti su naudojamomis fenotipinėmis klasifikacijomis.

Pagal šiuo metu priimtą vidaus klasifikaciją maro sukėlėjo padermės skirstomos į pagrindinį ir 4 mažuosius (Kaukazo, Altajaus, Gissaro ir Ulegey) porūšius [Kutyrev ir kt., 1998]. Pagal plačiai paplitusią užsienio klasifikaciją, 7. parabenų padermės, remiantis daugelio biocheminių savybių skirtumais (gebėjimas fermentuoti glicerolį, redukuoti nitratus, oksiduoti amoniaką) ir istoriniu bei geografiniu principu, skirstomos į tris biovarus: anpyanaia. (senovės), tesNeuainz (viduramžių) ir openianus (Rytų). Pagal fenotipines savybes pagrindinio porūšio padermės atitinka tris užsienio klasifikacijoje priimtus biovarus (senovės, viduramžių ir rytų). Tačiau natūraliuose maro židiniuose cirkuliuojančios maro sukėlėjo padermės c. Rusijos Federacija ir kaimyninės šalys lieka nesusistemintos pagal priklausomybę biovarams.

Skirtingai reikšmingų biocheminių savybių raiškos požiūriu aktyviausios yra antikvarinio biovaro padermės. Jie fermentuoja glicerolį ir turi denitrifikacinį aktyvumą. Viduramžių biovaro U. reese padermės nesugeba redukuoti nitratų, bet fermentuoja glicerolį ir arabinozę. Rytinio biovaro padermės nefermentuoja glicerolio, bet aktyviai mažina nitratus ir utilizuoja arabinozę.

Skirtingos biocheminių savybių, naudojamų skirstant Y. pestis padermes į biovarus, genetinės priežastys iki šiol nėra pakankamai ištirtos. Literatūroje šiuo klausimu publikacijų yra ribotas. Vienintelis patikimai nustatytas dalykas yra tai, kad rytinio biovaro padermių glicerolio fermentacijos trūkumo priežastis yra glicerolio-3-fosfato dehidrogenazės (glpD) geno mutacija. Buvo parodyta, kad visose rytinio biovaro padermėse šio geno delecija yra 93 bp. . Yra prieštaringų duomenų apie genų pokyčius, kurie lemia kitas biochemines charakteristikas, naudojamas diferencijuojant biovarus.

Y. pestis skirstymas į porūšius pagal klasifikaciją, priimtą 1985 metais visos sąjungos susirinkime dėl maro mikrobų taksonomijos, pagrįstas nevienodu biocheminiu padermių aktyvumu, jų virulentiškumo skirtumais laboratorinių gyvūnų atžvilgiu ir skirtingos kraštovaizdžio-geografinės vietos [ Kutyrev, Protsenko, 1998; Anisimov ir kt., 2004]. Pagrindinių porūšių padermės, kaip taisyklė, yra labai virulentiškos ir turi didelę epideminę reikšmę. Jie nefermentuoja ramnozės ir melibiozės, nėra jautrūs pesticinui I, pasižymi dideliu izocitralazės gamybos lygiu. Smulkių porūšių padermės fermentuoja ramnozę ir melibiozę, yra jautrios pesticinui I, nepasižymi izocitrato-liazės aktyvumu, yra selektyviai virulentiškos laboratoriniams gyvūnams ir yra nedidelės epidemijos reikšmės.

Skirtingų porūšių marą sukeliančių padermių skirtingo biocheminio aktyvumo genetinis pagrindas praktiškai netirtas. Užsienyje ši problema buvo mažai ištirta, nes užsienio kolekcijose nėra smulkių porūšių padermių, kurios daugiausia platinamos natūraliuose Rusijos Federacijos ir kaimyninių šalių židiniuose. Buitinėje literatūroje yra tik keli darbai apie genų sandaros skirtumus, pagrindinio ir nepagrindinio porūšio U. resI; koduojantis nitratų redukciją ir ramnozės fermentaciją [Erošenko ir kt., 2008; Kukleva ir kt., 2008, 2009]. Rusijoje ir kaimyninėse šalyse cirkuliuojančios pagrindinio ir smulkaus porūšio maro sukėlėjo padermės lieka neištirtos pagal genų, dalyvaujančių redukuojant nitratus, fermentuojant glicerolį, arabinozę, melibiozę, izocitrato liazę ir kitas klasifikacijai svarbias savybes, struktūrą. Maro mikrobų padermių nevienalytiškumo priežastis mitybos poreikių atžvilgiu nenustatyta. Skirtingų natūralių maro židinių padermės turi skirtingus mitybos poreikius, nulemtus tarpinio metabolizmo genų sutrikimų, kuriuos galima panaudoti genetinėje padermių diferenciacijos schemoje ¥. kilti iš įvairių natūralių maro židinių.

Genų struktūros pokyčių, lemiančių skirtingą mikrobiologinių ir biocheminių požymių raišką, nustatymas bus patikimas pagrindas kuriant genetinę schemą maro patogeno padermėms klasifikuoti, taip pat nustatyti pagrindines U intraspecifinės evoliucijos kryptis. .

Darbo tikslas. Skirtingos biocheminių charakteristikų, naudojamų maro sukėlėjo padermėms skirstant į porūšius ir biovarus, genetinio pagrindo nustatymas.

Tyrimo tikslai:

1. Apibūdinkite darbe naudojamas G. resiz padermes, išskirtas natūraliuose maro židiniuose Rusijos Federacijoje ir kaimyninėse šalyse, pagal jų biochemines savybes (nitratų redukcija, izocitrato liazės gamyba, arabinozės ir melibiozės fermentacija), kuriais grindžiamas skirstymas į porūšius ir biovarus. Nustatyti, ar Rusijoje ir kaimyninėse šalyse cirkuliuojančios padermės priklauso tam tikriems biovarams.

2. Ištirti diferencines charakteristikas koduojančių genų, naudojamų skirstant į biovarus – nitratų redukciją ir arabinozės fermentaciją, struktūrinę ir funkcinę organizaciją.

3. Nustatyti U. ribbi genų, lemiančių melibiozės fermentaciją ir izocitrato liazės gamybą, pokyčius, kuriais grindžiamas maro sukėlėjo pagrindinio ir smulkaus porūšio diferenciacija.

4. Nustatyti Kaukazo porūšio U. rhenium padermių mitybos poreikius ir nustatyti jų auksotrofijos genetinį pagrindą.

5. Įvertinti gautų rezultatų panaudojimo perspektyvas sukurti U. paratilis padermių intraspecifinės klasifikacijos genetinę schemą ir nustatyti pagrindines šio patogeno intraspecifinės evoliucijos kryptis.

Mokslinis darbo naujumas. Remiantis išsamios mikrobiologinės, biocheminės ir genetinės analizės duomenimis, nustatyta, kad Rusijos Federacijos ir kaimyninių šalių gamtiniuose židiniuose cirkuliuojančios maro sukėlėjo padermės priklauso senovės ir viduramžių biovarams.

Pirmą kartą buvo įrodyta, kad kai kurių pagrindinių Rusijos Federacijoje ir kaimyninėse šalyse cirkuliuojančių pagrindinių porūšių padermių nitratus redukuojančio aktyvumo stokos priežastis yra vieno nukleotido pakaitalas O su T 613 pozicijoje. periplazminis nitrato reduktazės genas – pora A, kuri įrodo, kad šios padermės priklauso viduramžių periodui. Šio bruožo ekspresijos trūkumas Altajaus ir Gissar porūšių padermėse atsiranda dėl timino nukleotido (+T) įterpimo į kito geno 302 padėtį – geno, dėl kurio pasikeičia skaitymo rėmas ir sutrinka koduojamo transportinio baltymo struktūra -8 eA, taip pat dalyvauja redukuojant nitratus.

Pirmą kartą buvo nustatyta, kad arabinozės fermentacijos nebuvimas Altajaus ir Gissar porūšių U. resia padermėse yra susijęs su reguliacinio geno, arabinozės operono agaC, kuriame yra intarpas, mutacija. guanino nukleotidas (+b) 773 padėtyje nuo geno pradžios, lemiantis skaitymo rėmo poslinkį ir reguliuojančio baltymo AgaC struktūros sutrikimą, kuris yra būtinas arabinozės genų transkripcijai inicijuoti. operonas.

Pirmą kartą buvo nustatytas genetinis skirtingos izocitrato liazės gamybos pagrindinio ir šalutinio porūšio maro patogeno padermėse pagrindas, susijęs su dviejų nukleotidų (+CC) įterpimu į reguliacinis genas ShK. 269-270 padėtyje, o tai veda prie jo koduojamo acetato operono represoriaus baltymo IcIR inaktyvavimo ir yra konstitucinės izocitrato liazės fermento sintezės priežastis pagrindinio porūšio padermėse. Smulkių porūšių štamai turi nepažeistą iIII geną ir negali konstitucinės izocitralazės sintezės.

Įrodyta, kad melibiozės fermentacijos nebuvimą pagrindinio porūšio 7. dervos padermėse lemia įterpimo seka 18255 į geną1B, kuri koduoja fermentą galaktozido permeazę. Neesminių porūšių padermėse 1B255 įterpimo į te1B geną nėra.

Pirmą kartą buvo nustatytas Kaukazo porūšio padermių auksotrofijos genetinis pagrindas, susijęs su 1$>100 įterpimo sekų įvedimu į a^A ir agora genus, 10 bp intarpu. į agoO geną, įterpiant timino nukleotidą į d/Ru geną, pašalinant 13 bp. gcJ gene.

Susidariusios U. paratilis padermių pagrindinio ir smulkaus porūšio molekulinės charakteristikos pagal genus, koduojančius biochemines charakteristikas, kuriomis grindžiamas skirstymas į porūšius ir biovarus, sudaro pagrindą sukurti genetinę schemą, skirtą maro sukėlėjo intraspecifinei klasifikacijai.

Remiantis darbo rezultatais, buvo pateiktos paraiškos išradimui „Maro sukėlėjų padermių porūšio priklausomybės nustatymo metodas taikant sekos nustatymo metodą“ (Nr. 2009116913. Prioritetas 2009 m. gegužės 14 d. Gautas teigiamas sprendimas išduoti patentas) ir „Yersinia pestis padermių porūšių diferenciacijos metodas, naudojant daugialokių sekos nustatymo metodą – tipavimas (Nr. 2009146094. Prioritetas 2009-12-11).

Praktinė darbo reikšmė. Remiantis darbo rezultatais, buvo parengtos ir patvirtintos metodinės rekomendacijos „Maro patogenų padermių porūšių nustatymas remiantis rhaS ir agaC genų, kontroliuojančių ramnozės ir arabinozės fermentaciją, sekos nustatymu“ (patvirtintas RosNIPCI direktoriaus). 2009 m. birželio 16 d. protokolas Nr. 6) ir „Yersinia pestis porūšių padermių nustatymas naudojant daugialokių sekos tipavimą (patvirtintas RosNIPCI „Microbe“ direktoriaus. 2010 m. vasario 23 d. protokolas Nr. 1).

Trys padermės buvo deponuotos Valstybinėje patogeninių bakterijų kolekcijoje: Y. pestis KM 910 iš Altajaus, KM 596 iš Gissar ir KM 1861 iš Ulegei kaip etaloninės šių porūšių padermės.

Tyrimo metu gauti duomenys apie Y. pestis padermių genetinę organizaciją naudojami skaitant paskaitas tema „ Maro sukėlėjo genetika Specializacijos kursuose apie ypač pavojingas infekcijas RosNIPCI „Microbe“ ir išplėstinio mokymo kursuose, skirtuose gydytojų „bakteriologijos“ specialybės kvalifikacijos kėlimui RosNIPCHI „Microbe“.

Gynybos nuostatos:

1. Rusijos Federacijos ir kaimyninių šalių gamtiniuose židiniuose cirkuliuojančios pagrindinių porūšių maro sukėlėjo padermės priklauso senovės ir viduramžių biovarams, tai rodo išsamios šių padermių mikrobiologinių, biocheminių ir genetinių savybių analizės duomenys.

2. Skirtingų apraiškų ir biocheminių charakteristikų, naudojamų skirstant Y. pestis padermes į porūšius ir biovarus, pagrindas yra skirtingų tipų genų, koduojančių šias savybes, mutacijos. Nesugebėjimas sumažinti nitratų pagrindinių viduramžių biovaro porūšių padermių yra susijęs su nesąmoningos mutacijos (G T) buvimu periplazminės nitratų reduktazės geno paraA, o Altajaus ir Gissaro porūšių padermėse - su. vieno nukleotido įterpimas į periplazminio transportinio baltymo SsuA ssuA geną. Arabinozės fermentacijos nebuvimas Altajaus ir Gissar porūšių padermėse yra dėl to, kad į agaC geno seką įterptas guanino nukleotidas.

3. Skirtingą maro sukėlėjo pagrindinio ir smulkaus porūšio padermių biocheminį aktyvumą pagal daugybę skirtingų charakteristikų lemia juos koduojančių genų redukcija pagrindiniame porūšyje ir jų nepažeistumas mažame porūšyje. Pagrindinių porūšių padermių melibiozės fermentacijos nebuvimas yra dėl to, kad į melB galaktozido permeazės geną patenka IS2S5, o konstitucinė izocitrato liazės sintezė šio porūšio padermėse vyksta dėl dviejų nukleotidų (CC) įterpimo į iclR reguliuojančio geno seka. Mažų porūšių padermėse yra nepažeistų melB ir iclR genų.

4. Kaukazo porūšio Y. pestis padermių daugialypių mitybos poreikių priežastis yra daugelio aminorūgščių ir vitaminų biosintezės genų inaktyvavimas. Šio porūšio padermių priklausomybę nuo arginino sukelia 100 įterpimas į argA geną, o fenilalanino - 10 bp įterpimas. aroG gene, tirozinui - įvedant IS100 į aroF geną, tiaminui (B]), išbraukiant 13 bp. - į thiG geną ir vieno nukleotido įterpimas į thiH. Remiantis visu Kaukazo ir kitų porūšių padermių identifikuotų mutacijų kompleksu, taip pat maro sukėlėjo biovarais, nustatyti būdingi genotipai, pagal kuriuos galima sukurti genetinę schemą, Y. pestis intraspecifinę klasifikaciją.

Darbo aprobavimas. Disertacijos medžiaga pristatyta ir aptarta IX tarpvalstybinėje NVS valstybių narių mokslinėje ir praktinėje konferencijoje „Šiuolaikinės technologijos įgyvendinant pasaulinę kovos su infekcinėmis ligomis strategiją Nepriklausomų Valstybių Sandraugos valstybių narių teritorijoje“, Volgogradas. , 2008; VI tarptautinė konferencija Molekulinė diagnostika ir biologinė sauga“, M., 2009; mokslinė ir praktinė jaunųjų mokslininkų ir Federalinės vartotojų teisių apsaugos ir žmogaus gerovės priežiūros tarnybos specialistų mokykla-konferencija “ Šiuolaikinės technologijos biologinei saugai užtikrinti“, 2010 m. gegužės 25 - 27 d.; kasmetinėse baigiamose RosNIPCI „Microbe“ konferencijose, Saratovas 2008–2010 m.

Publikacijos. Disertacijos tema paskelbti 7 spaudiniai, iš jų 4 periodiniuose leidiniuose iš „Rusijos švietimo ir mokslo ministerijos Aukštosios atestacijos komisijos rekomenduojamų pirmaujančių recenzuojamų mokslo žurnalų sąrašo“. Išduoti du išradimų patentai " Maro patogenų padermių porūšio diferenciacijos metodas naudojant sekos nustatymo metodą"(Nr. 2009116913. Prioritetas 2009-05-14. Gautas teigiamas sprendimas dėl patento išdavimo) ir "Yersinia pestis padermių porūšio diferenciacijos metodas, naudojant daugialokių sekos tipavimą" (Nr. 2009146094.1o. 11/2009).

Disertacijos struktūra ir apimtis. Disertaciją sudaro 156 puslapiai spausdinto teksto, susideda iš įvado, literatūros apžvalgos skyriaus, penkių savo tyrimo skyrių, išvados ir išvadų. Darbas iliustruotas 11 lentelių ir 34 brėžiniais. Bibliografinėje rodyklėje yra 203 šalies ir užsienio šaltiniai.

Disertacijos išvada tema „Mikrobiologija“, Odinokovas, Georgijus Nikolajevičius

1. Atlikus išsamią natūralių Y pestis padermių iš įvairių natūralių maro židinių biocheminių ir genetinių savybių analizę, nustatyta, kad pagrindinių Rusijos Federacijoje ir kaimyninėse šalyse cirkuliuojančių porūšių padermės priklauso senovės ir viduramžių biovarams.

2. Skirtingo biocheminio požymio - nitratų mažinimo pagrindinių porūšių Y. pestis padermių, išskirtų natūraliuose maro židiniuose Rusijoje ir kaimyninėse šalyse, išraiškos priežastis yra mutacijos buvimas - vieno nukleotido pakeitimas. periplazminės nitratų reduktazės paraA gene, o Altajaus ir Gissaro porūšiuose - vieno nukleotido įterpimas į periplazminio transportinio baltymo ssuA geną.

3. Pirmą kartą nustatytas skirtingos melibiozės fermentacijos požymių raiškos ir izocitrato liazės gamybos genetinis pagrindas maro mikrobo pagrindinio ir šalutinio porūšio padermėse. Buvo įrodyta, kad pagrindinių porūšių padermių nesugebėjimas fermentuoti disacharido melibiozės atsiranda dėl IS2&5 įterpimo į struktūrinio geno melB seką, koduojančią galaktozido permeazę. Nustatyta, kad pagrindiniam maro mikrobo porūšiui būdingą izocitrato liazės konstitucinę sintezę sukelia dviejų nukleotidų (+CC) įterpimas į iclR represoriaus geno 269 - 270 pozicijas.

4. Altajaus ir Gissaro porūšių pestis padermių arabinoneigiamumo priežastis yra arabinozės operono - agaC reguliacinio geno mutacija, kurią sukelia vieno guanino nukleotido įterpimas šio geno 773 padėtyje. .

5. Pirmą kartą nustatytas Kaukazo porūšio U. pestis padermių auksotrofijos genetinis pagrindas. Nustatyta, kad auksotrofija argininui atsiranda dėl IS 100 įvedimo į argA geną, o fenilalaninui – įterpus 10 r.n. aroG, tirozinui - į aro F įterpiant IS 100, vitaminui Bi - išbraukiant 13 bp į thiG ir įterpiant timiną į thiH.

6. Nustatyti maro sukėlėjo pagrindinio (senovės, viduramžių, rytietiškų biovarų) ir smulkiųjų porūšių būdingi genotipai, kurių panaudojimas leidžia Y. pestis intraspecifiškai diferencijuoti. Pateikiamos perspektyvos panaudoti gautus rezultatus kuriant genetinę Y. pestis padermių intraspecifinio klasifikavimo schemą.

IŠVADA

Per daugiau nei šimtmetį trukusius maro sukėlėjo tyrimus po jo atradimo 1894 m., A. Yersen ir S. Kitazato ne kartą pasiūlė įvairias Y. pestis klasifikavimo schemas, kurios buvo pagrįstos skirtingomis mikrobiologinėmis, biocheminėmis ir kt. fenotipinės savybės. Siūlomos klasifikacijos neabejotinai atitiko tyrėjų žinių ir metodinių metodų lygį. Taigi 1928 metais A.A. Bezsonova, visos Y. pestis padermės buvo suskirstytos į dvi grupes pagal gebėjimą fermentuoti glicerolį: glicerino neigiamas ir glicerino teigiamas. 1938 metais A.L. Berlynas ir A.K. Borzenkovas suskirstė maro sukėlėjo atmainas į okeanines ir žemynines rases. R. Devignat 1951 m., remdamasis daugybe biocheminių savybių (skirtingi denitrifikacijos ir glicerolio fermentacijos gebėjimai) ir kraštovaizdžio-geografinės kilmės ypatumais, pasiūlė Y. pestis padermes suskirstyti į tris grupes, kurios šiuo metu įvardijamos kaip geografinės kilmės biovarijos. maro mikrobas: senovės, viduramžių ir rytietiškas. 1985 m. visos sąjungos susitikime dėl maro mikrobų taksonomijos buvo priimta vieninga sisteminė maro sukėlėjo porūšių kategorijų schema, pagrįsta fenotipinėmis savybėmis, virulentiškumu laboratorinių gyvūnų atžvilgiu ir paplitimo sritimi. NVS šalyse ir Mongolijoje cirkuliuojančios maro mikrobų padermės buvo suskirstytos į penkis porūšius: pagrindinį, Kaukazo, Altajaus, Gissaro, Ulegey (Timofejeva 1972; Kutyrev, Protsenko, 1985).

Visos pasiūlytos schemos, žinoma, buvo naudingos tyrėjams ir prisidėjo prie Y. pestis sisteminimo, o daugelis jų (skirstymas į porūšius ir biovarus) plačiai naudojamos ir šiandien. Tačiau spartus šiuolaikinių molekulinės biologijos technologijų vystymasis, patogeninės Yersinia pilnų genomų sekos nustatymas leidžia išspręsti maro patogeno intraspecifinės klasifikacijos tobulinimo problemą šiuolaikiniu molekuliniu genetiniu lygmeniu, remiantis lyginamąja maro patogeno genomika. padermės. Esamų šio patogeno diferencinio klasifikavimo schemų perkėlimas į genetinį lygmenį padidins jų skiriamąją gebą, efektyvumą ir patikimumą, taip pat pagerins Y. pestis rūšių sisteminimo kokybę.

Įvairių porūšių maro patogenų padermių skirtingo biocheminio aktyvumo genetinis pagrindas lieka praktiškai neištirtas. Genuose, naudojamuose Y. pestis intraspecifiniam dalijimuisi, nustatyti tik atskiri genetiniai defektai. Taigi buvo įrodyta, kad pagrindinių viduramžių biovaro porūšių padermių gebėjimo sumažinti nitratų trūkumas yra susijęs su periplazminės nitratų reduktazės porų L struktūrinio geno mutacija, būtina šios savybės pasireiškimas ir rytinio biovaro padermių (glicerolio neigiamų padermių arba okeaninės rasės) nesugebėjimas fermentuoti glicerolį, kurį sukelia glicerolio-3-fosfato dehidrogenazės geno glpD delecija. Gauta įrodymų, kad visų tirtų pagrindinių porūšių padermių ramnozės neigiamumo priežastis yra nesinoniminis vieno nukleotido pakaitalas ramnozės operono rhaS reguliavimo gene [Kukleva ir kt., 2008; 2009]. Apie kitus genus, lemiančius reikšmingus biocheminius požymius, yra arba gana prieštaringa informacija, arba tiesiog trūksta duomenų. Rusijos Federacijos ir kaimyninių šalių gamtiniuose židiniuose išsilaikiusių pagrindinių ir smulkesnių porūšių Y. pestis padermių skirtingai reikšmingų biocheminių savybių genai praktiškai netirti. Įvairių porūšių padermių, esančių skirtinguose Y. pestis evoliucijos etapuose, genetinės organizacijos tyrimas yra svarbi užduotis, nes tai leis nustatyti tas patogeno genomo evoliucines transformacijas, dėl kurių susiformavo labai virulentiškas. bakterija Y. pestis.

Genetiniam pagrindui nustatyti skirtingą biocheminių savybių raišką, naudojamą skirstant maro sukėlėjo padermes į porūšius ir biovarus, naudojome tiek tradicinius mikrobiologinius ir biocheminius metodus, tiek šiuolaikinius molekulinės biologijos metodus – polimerazės grandininę reakciją, sekvenavimą, taip pat bioinformatikos metodus. . Naudoti interneto resursai - NGBI GenBank, KEGG Metabolic Pathways, PF AM, Modeller duomenų bazės ir kompiuterinės programos: Mega 4.0 ir PHYLIP su distancijos matricos metodais.

Genetiniam pagrindui nustatyti skirtingą biocheminių savybių raišką, naudojamą maro patogeno padermėms skirstyti į porūšius ir biovarus, buvo naudojamas bendrasis analizės algoritmas. Pirmajame etape buvo tiriama tiriamo mikrobiologinio arba biocheminio požymio raiška natūraliose Y. pestis padermėse. Diferencijiškai reikšmingų požymių (nitratų redukcija, arabinozės fermentacija, melibiozė, izocitrato liazės gamyba) raiška tirta daugybei (apie šimtui) Y. pestis padermių iš įvairių natūralių maro židinių.

Tuo pačiu metu, naudojant kompiuterinę padermių Y. pestis KIM (viduramžių biovaras), C092 (rytinis biovaras), Antiqua, Angola, Ne-pa1516 (senovinis biovaras), 91001 (microtus biovar), Pestoides F (Kaukazo porūšis) ir Y. pseudotuberculosis padermių analizę. PB1 /+, IP32953, IP31758, YPIII, kurių visi genomų nukleotidai pateikti NCBI GenBank duomenų bazėje, nustatėme kintamus genų regionus, kurių produktai pagal KEGG Metabolic Pathways ir PF AM duomenų bazes dalyvauja ekspresijoje. šio bruožo. Pradmenys buvo sukurti kintamoms genų sritims, kurios, kaip spėjama, ir buvo fenotipinio požymio pasireiškimo nebuvimo priežastis, kurių pagalba PGR būdu buvo amplifikuojami kintamieji genų fragmentai įvairiose natūraliose maro sukėlėjo padermėse. Palyginus genų nukleotidų sekas padermėse, kurios skiriasi tiriamo požymio raiška, buvo nustatytos mutacijos, kurios nulėmė šio požymio nebuvimą.

Naudodami šį algoritmą ištyrėme genų struktūrinę ir funkcinę organizaciją, kurių produktai dalyvauja Y. pestis padermių skirstymo į biovarus pagrindu – nitratų redukcija ir arabinozės fermentacija Lyginamoji kompiuterinė geno analizė porų buvo atliktas operonas, taip pat pagP ir ssuA genai – reguliuojantys (NarP) ir transportiniai (SsuA) baltymai, dalyvaujantys redukuojant nitratus, NCBI GenBank duomenų bazėje pateiktose padermėse, taip pat daugelyje (apie a. šimtas) natūralių Y. pestis padermių ir smulkesnių porūšių, išskirtų įvairiuose gamtiniuose maro židiniuose Rusijos Federacijoje, artimuose ir tolimuose užsienyje.

Nustatyta, kad kai kurių pagrindinių porūšių padermių denitrifikacinio gebėjimo trūkumo priežastis yra vieno nukleotido pakeitimas G į T A poros geno 613 padėtyje, koduojančio baltymą - periplazminę nitratų reduktazę. Priežastis, kodėl Altajaus ir Gissaro porūšių padermės nesugeba sumažinti nitratų, yra skirtinga ir yra susijusi su mutacija transportuojančio baltymo gene - ssuA, kuris šiose padermėse 302 padėtyje turi vieną nukleotido įterpimą (+T). ). Gauti duomenys, kartu su padermių biocheminėmis savybėmis (gebėjimas sumažinti nitratų kiekį, arabinozės ir glicerolio fermentacija), leido daryti išvadą, kad senovės ir viduramžių biovarų padermės cirkuliuoja Rusijos Federacijoje ir kaimyninėse šalyse, o rytų padermės. biovar aptinkami tik tarp užsienio šalių padermių.

Matyt, nitratų kiekį mažinančio aktyvumo trūkumo mikrotuso biovarų padermių priežastis yra ta pati mutacija kaip ir Altajaus ir Gissaro porūšių padermėse – vieno nukleotido įterpimas į ssu geną. Mes nustatėme, kad pairA geno mutacija – vienos poros A geno įterpimas 1021 padėtyje negali būti šio bruožo ekspresijos trūkumo priežastimi microtus padermėse [kaip siūlo D. Zhou et al., 2004] , nes mes taip pat nustatėme jį Kaukazo porūšio padermėse, taip pat pseudotuberkuliozės 7 padermėse, kurios mažina nitratų kiekį. “

Pirmą kartą buvo atlikta arabinozės operono genų struktūrinė ir funkcinė analizė daugelyje natūralių maro sukėlėjo padermių ir visos reguliuojamojo geno agaC nukleotidų sekos, dalyvaujančios reguliuojant marą. buvo nustatyta arabinozės fermentacijos raiška. Nustatyta, kad šio požymio Altajaus ir Gissaro porūšiuose nebuvimo priežastis yra vieno nukleotido įterpimas agaC geno 773 padėtyje nuo geno pradžios. Pagrindinių, Kaukazo ir Ulegėjaus porūšių štamai neturi tokios mutacijos, kuri koreliuoja su jų gebėjimu fermentuoti arabinozę.

Ištirta genų, koduojančių melibiozės fermentaciją ir izocitrato liazės gamybą, struktūros, kurios naudojamos Y. pestis padermes skirstant į pagrindinį ir šalutinį porūšį. Anksčiau genetinis skirtingų šių savybių pasireiškimų nustatymas pagrindinio ir nepagrindinio porūšio padermėse nebuvo tirtas. Literatūroje šiuo klausimu duomenų nėra.

Lyginamoji kompiuterinė NCBI GenBank duomenų bazėje pateiktų Y. pestis ir 7. pseudotuberculosis padermių melibiozės fermentacijos genų (melA, melB ir melR) nukleotidų sekos analizė parodė melB geno buvimą (1232 bp), kuris lemia sintezę. galaktozido permeazės, IS2&5 įterpimo sekos (1322 bp) įterpimas po 73 bp. maro patogeno4 padermėse C092, KIM, Antiqua, Nepal516. Kitose 7 pestis Angola, 91001, Pestoides F padermėse ir visose 7 pseudotuberculosis padermėse rasta nepažeista melB geno struktūra. Atliekant PGR analizę, naudojant apskaičiuotus pradmenis, esančius šalia IS2SJ įterpimo srities, specifiniai melB geno fragmentai buvo gauti iš daugybės natūralių maro patogeno padermių. Ištirtų 7 nepagrindinių porūšių pestis padermių – Kaukazo, Altajaus, Gissaro ir Ulegei – PGR gautos 325 bp dydžio amplifikacijos, kurios atitiko nepažeistą melB geno struktūrą. Priešingai, pagrindinių porūšių padermių fragmentų dydis buvo didesnis – 1648 bp, o tai rodė įterpimo sekos įvedimą į šį geną ir koreliavo su jų fermentinio aktyvumo prieš melibiozę stoka. Taigi pirmą kartą nustatėme genetinę priežastį; skirtinga diferencinio požymio išraiška - melibiozės fermentacija pagrindinio ir smulkaus porūšio maro patogeno padermėse, kuri yra susijusi su melB geno struktūros pažeidimu pagrindinio porūšio padermėse dėl įterpimo sekos įvedimo. IS2 ir 5.

Pagrindinio porūšio Y. pestis padermėms atskirti nuo nepagrindinių ir pseudotuberkuliozės sukėlėjo naudojamas jų gebėjimas konstitutyviai sintetinti fermentą izocitrato liazę. NCBI GenBank duomenų bazėje pateiktų G. pestis ir Y. pseudotuberculosis padermių acetato operono (aceA, aceB, aceK, iclR) genų nukleotidų sekų lyginamoji kompiuterinė analizė parodė, kad iclR yra dviejų nukleotidų intarpas ( geno dydis 843 bp) (+CC) 269-270 padėtyje nuo geno pradžios Y. pestis padermėse C092, KIM, Antiqua, Nepal516. Priešingai, kitos maro mikrobo Angola, 91001, Pestoides F ir visų pseudotuberkuliozės padermių padermės turi nepažeistą iclR geno struktūrą. Mūsų atliktas iclR geno kintamos srities sekos nustatymas natūraliose Y. pestis padermėse atskleidė, kad pagrindinių Y. pestis porūšių padermėse yra ta pati mutacija – dviejų nukleotidų įterpimas (+CC) 269–270 padėtyse, priešingai nei smulkūs porūšiai, kuriuose šio geno struktūra yra nepažeista. Nustatyta mutacija sukelia genų inaktyvaciją ir acetato operono IclR represoriaus baltymo struktūros (ir funkcijos) sutrikimą, susijusį su domeno C-galinio galo (148–271 aa), kuris jungiasi su induktoriaus molekule, praradimu. . Tai lemia konstitucinę acetato operono genų ekspresiją ir koreliuoja su dideliu izocitrato liazės fermento aktyvumu pagrindinių Y. pestis porūšių padermėse.

Anksčiau buvo teigiama, kad seniausios maro mikrobų padermės yra Kaukazo porūšio padermės [Bobrov, Fillipov, 1997; Kukleva ir kt., 2002]. Jų tyrimas yra labai įdomus, nes leidžia nustatyti tuos genomo evoliucinių pokyčių etapus, dėl kurių saprofitinė enteropatogeninė bakterija - pseudotuberkuliozės mikrobas - virto labai virulentišku sisteminiu patogenu, turinčiu iš esmės skirtingą patogeno perdavimo mechanizmą. . Mūsų rezultatai rodo, kad Kaukazo porūšis yra aktyviausias pagal skirtingas biochemines charakteristikas ir turi nepažeistų genų (paraA, ssuA, glpD, araC, melB, iclR), kaip ir pseudotuberkuliozės sukėlėjas. Tai patvirtina didesnį Kaukazo porūšio artumą savo pirmtakui Y. pseudotuberculosis, palyginti su kitais Y. pestis porūšiais.

Taip pat atlikome mikrobiologinius tyrimus, siekdami ištirti Kaukazo porūšio Y. pestis padermių mitybos poreikius, nes literatūroje šiuo klausimu buvo prieštaringos informacijos. Nustatyta, kad visos tirtos Kaukazo porūšio padermės elgėsi vienodai. Jie nustatė, kad reikia dviejų aromatinių aminorūgščių – fenilalanino ir tirozino, taip pat aminorūgšties arginino ir vitamino Bi (tiamino). Be arginino, fenilalanino, tirozino ir vitamino B1 poreikių, Rytų Kaukazo aukštųjų kalnų maro židinio padermės taip pat rodė priklausomybę nuo leucino, o Kaukazo porūšių padermės iš Leninakan, Prisevan, Zangezur-Karabachh ir Araksino natūralių tokios priklausomybės židinių nebuvo.

Nustatyti Kaukazo porūšių padermių auksotrofijos genetinį pagrindą, naudojant KEGG ir PFAM duomenų bazes, medžiagų apykaitos takų analizę ir fermentinių sistemų, dalyvaujančių aromatinių aminorūgščių – fenilalanino, tirozino, aminorūgšties arginino ir arginino – biosintezėje identifikavimą. buvo atlikti vitamino Bt (tiamino) tyrimai. Kaukazo porūšio padermėse aptiktos reikšmingos mutacijos arginino (argA), fenilalanino (aroG), tirozino (aroF) ir vitamino Bl (thiH, thiG) biosintezės genuose. Struktūriniame gene a^A buvo aptiktas vos 196 bp ilgio įterpimo sekos \S100 intarpas, dėl kurio kaukazietiško arginino porūšio auksotrofija atsirado. Ago geno

Taigi mes pirmą kartą nustatėme Kaukazo porūšio padermių auksotrofijos genetinį pagrindą. Gautos Kaukazo porūšių padermių genetinės charakteristikos, pagrįstos diferencinių biocheminių savybių genais ((rgarA, vvi, glpD, agaC, te1B, yIII) ir augimo faktorių biosintezės genais (a^A, agoC, agoras). , ¿/g/C ir ShN) rodo didžiausią šio porūšio senumą, taip pat ilgą jo evoliucijos laikotarpį, nepriklausomą nuo kitų U. re, M"ya porūšių.

Remiantis išsamia U. resib natūralių padermių iš įvairių maro židinių molekuline genetine analize, buvo nustatytos ir kitų porūšių padermių, cirkuliuojančių Rusijoje, artimuose ir tolimuose užsienyje, genetinės savybės. Naudojant nustatytas genetines mutacijas genuose paraA, agaC, glpD, mA ir SHR galima labai efektyviai ir patikimai nustatyti, ar U. pebis padermės priklauso pagrindiniam ar antrajam porūšiui, o pagrindinių porūšių padermės – vienas iš trijų biovarų – senovinis, viduramžių ar rytietiškas. Buvo nustatyti kiekvieno iš šių taksonominių vienetų – Y. pestis rūšies – būdingi genotipai.

Šio darbo metu nustatytas porų A, ssu, araC, melB, iclR, argA, aroH, aog F, thiH ir thiG genų kintamumas kartu su anksčiau nustatytu glpD geno kintamumu buvo panaudotas filogenetiniam atkūrimui. pagrindinio ir smulkiojo maro sukėlėjo padermių porūšių raidos schema, kuri patvirtino kaukazietiškų padermių, taip pat kitų smulkių Y. pestis porūšių senumą (34 pav.).

Kaip matyti iš šios diagramos, maro sukėlėjas yra kilęs iš pseudotuberkuliozės mikrobo ir yra šios enteropatogeninės Yersinia evoliucijos atšaka. Seniausias Y. pestis porūšis yra filogenetiškai artimesnis Y. pseudotuberculosis, palyginti su kitais maro mikrobo porūšiais. Kitai senovinei Y pestis evoliucijos atšakai atstovauja Ulega, Altajaus ir Gissaro porūšiai, kurie yra genetiškai artimi vienas kitam ir, matyt, atskirti nuo bendro evoliucijos kamieno į vieną grupę, kuri vėliau suskilo į atskirus porūšius. . Matyt, seniausias iš jų yra Ulega porūšis, kuriame yra mažesnis gyvybę palaikančių genų mutacijų skaičius (ypač jame nėra agaC geno mutacijos), palyginti su Altajaus ir Gissaro porūšių padermėmis. Pastarosios yra filogenetiškai artimos viena kitai, taip pat mikrotuso grupės padermėms, kurių genuose dėl skirtingų biocheminių savybių yra tos pačios mutacijos kaip ir Altajaus ir Gisaro porūšių padermės. Pirmieji pasiūlėme, kad microtus padermės priklauso Altajaus-Gissaro porūšių grupei.

С092 (orientalis)

KIM 776 (meclievalis) (meclievalis)

NepalSlö (antiqua) subsp. ulegeica subsp. hismrica

91001 (microtus) subsp. altaica.

231, 680 subsp. Kaukazo

Y. pseu dotu bereu losis

34 pav. U. rheaT^ya intraspecifinės evoliucijos schema

Šiame darbe atlikti tyrimai sudaro pagrindą sukurti maro sukėlėjo molekulinę taksonomiją, kurios tikslas – sukurti pilną intraspecifinę Y. pestis taksonomiją, pagrįstą genų kintamumu skirtingam reikšmingam mikrobiologiniam ir biocheminiam poveikiui. maro mikrobų savybės.

Disertacinio tyrimo literatūros sąrašas Biologijos mokslų kandidatas Odinokovas, Georgijus Nikolajevičius, 2010 m

1. Akiev A.K. Apie maro mikrobo fiziologinį kintamumą // Ypač pavojingų infekcijų problemos. - 1969. Laida. 6 (10). - P. 22 - 25.

2. Anisimovas A.P. Yersinia pestis veiksniai, užtikrinantys maro sukėlėjo cirkuliaciją ir išsaugojimą natūralių židinių ekosistemose. 1 pranešimas // Molekulės, genetika. 2002. - Nr. 3. - P. 3 - 23.

3. Anisimovas A.P. Yersinia pestis veiksniai, užtikrinantys maro sukėlėjo cirkuliaciją ir išsaugojimą natūralių židinių ekosistemose. 2 pranešimas // Molekulės, genetika. 2002. - Nr. 4. - P. 3 - 11.

4. Aparinas T.P., Golubinskis E.P. Maro mikrobiologija: vadovas. - Irkutskas / Irkutsko leidykla. Univ., 1989. - 90 p.

5. Bazanova L.P., Innokentyeva T.I. Apie blusų - pagrindinių ir antrinių maro nešiotojų - vaidmenį patogeno cirkuliacijoje Sibiro gamtos židiniuose // Med. paragrafai. ir paralyžius ligų. 2008. - Nr. 3. - P. 54 - 60.

6. Balakhonovas S.B., Tsenjajevas S.N., Erdemabatas A.B. Mongolijoje išskirti nauji maro patogenų padermių plazmidovarai // Molekulės, genetika, mikrobiolas. ir virusolis. - 1991. - Nr. 11. 27 - 29.

9. Bibikova V.A., Klassovsky V.N., Maro pernešimas blusomis. - M.: - Medicina, 1974. 188 p.

10. Bobrovas A.G., Fillipovas A.A. IS285 ir IS 100 paplitimas Yersinia pestis ir Yersinia pseudotuberculosis II Mol. genetika, mikrobiolas. ir virusolis. 1997. - Nr. 2. - P. 36 - 40.f

11. Vaščenokas B.C. Blusos perneša žmonių ir gyvūnų ligų sukėlėjus. - L.: Nauka, 1988. - 160 p.

12. Velichko L.N., Kondrashkina K.I., Ermilov A.P. ir kiti Blusų ekskrementai yra natūrali aplinka ilgalaikiam maro mikrobų saugojimui // Ypač pavojingų infekcijų problemos. - 1978. - Laida. (64). - P. 51 - 53.

13. Volkovas Yu.P., Eroshenko G.A. Kai kurių filogenetinių medžių konstravimo metodų, naudojamų vertinant mikroorganizmų evoliucinius ryšius, efektyvumo analizė // Ypač pavojingų infekcijų problemos. 2009. – Laida. 1 (99). - P. 35 - 41.

14. Gusfield J. Stygos, medžiai ir sekos algoritmuose: kompiuterių mokslas ir skaičiavimo biologija. - Sankt Peterburgas: Nevskio tarmė, BHV-Peterburgas, 2003. 654 p.

15. Goldfarb L.M., Domaradskaya T.I., Japaridze M.N. Izocitato-žiurkės-liazės testo, skirto maro ir pseudotuberkuliozės sukėlėjų diferencijavimui, įvertinimo link // Aktualūs maro ir choleros patogenų laboratorinės diagnostikos ir biochemijos klausimai. - 1984. S. 23 - 27.

16. Goldfarb L.M., Domaradskaya T.I., Japaridze M.N. Izocitrato-liazės aktyvumo testas Yersinia maro intraspecifinei diferenciacijai // Šiuolaikiniai zoonozinių infekcijų prevencijos aspektai. - 1984. - 2 dalis.-S. 21-22.

17. Domaradsky I.V. Maras. M.: Medicina, 1998. - 173 p.

18. Iljina T.S., Romanova Yu.M., Ginzburg A.JI. Bioplėvelė kaip bakterijų egzistavimo aplinkoje ir šeimininko organizme būdas: reiškinys, genetinė kontrolė ir jų vystymosi reguliavimo sistemos // Genetika. - 2004. -T. 40, Nr. 11. - P. 1 12.

19. Klassovskis L.N., Martinevskis I.L., Stepanovas V.M. Apie maro bakterijų padermių, išskirtų Užkaukazės aukštumose iš pelėnų ir jų blusų, augimo faktorius // Ypač pavojingų infekcijų problemos. 1972. – Laida. 1. - 186 - 188 p.

20. Kozlovas M.P. Maras. M.: Medicina, 1979. - 192 p.

21. Kokushkin A.M. Kai kurios laukinių graužikų mitybos infekcijos ypatybės ir maro apraiškos // Probl. ypač pavojingos infekcijos. - 1994.-№5.-S. 23-31.

22. Kokushkin A.M. Socialiniai ir biologiniai maro epidemiologijos aspektai: Autoriaus santrauka. dis. doc. medus. Sci. 1995. - 46 p.

23. Kukleva L.M. Erošenko G.A. Shavina N.Yu. et al. Lyginamoji pseudogenų pasiskirstymo analizė. maro sukėlėjo pagrindinio ir smulkiojo porūšio padermių genomas // Molecular Genet., Microbiol. ir virusolis. 2009. – Nr.2. - P. 32-36.

24. Kukleva L.M., Erošenko-G.A., Pavlova A.I. ir kt. Įvairių porūšių maro sukėlėjų padermių charakteristikos, pagrįstos nitratų redukcija, glicerolio ir arabinozės fermentacija // Ypač pavojingų infekcijų problemos. - 2007.-Nr. 94.-S. 50-53.

25. Kukleva L.M., Eroshenko G.A., Shavina N.Yu. ir kt., lyginamoji pseudogenų pasiskirstymo maro sukėlėjo pagrindinio ir smulkiojo porūšio padermių genome analizė // Molekul, genetics, microbiol. ir virusolis. - 2008. -Nr. 2.-S. 32-36.

26. Kukleva J.M., Kuzmichenko I.A., Protsenko O.A. Skirtingų Yersinia pestis porūšių ir Yersinia pseudotuberculosis II padermių biocheminių savybių lyginamoji charakteristika Ypač pavojingų infekcijų problemos. - 2001.-Nuolata. 1.-S. 105-110.

27. Kukleva J.M., Procenko O.A., Kutyrevas V.V. Šiuolaikinės idėjos apie maro ir pseudotuberkuliozės sukėlėjų ryšį / Molekulės, genetika, mikrobiolas. ir virusol // 2002. Nr.1 ​​- 3 - 7 psl.

28. Kutyrevas V.V., Erošenko G.A., Popovas N.V. ir kiti. Maro sukėlėjo ir bestuburių gyvūnų sąveikos molekuliniai mechanizmai // Molekul, genetic., microbiol. ir virusolis. 2009. Nr. 4. - P. 7 - 12.

29. Kutyrevas V.V., Konnovas N.P., Volkovas Yu.P. Maro sukėlėjo ultrastruktūra ir lokalizacija vektoriuje / Red. V.V. Kutyreva. - M.: Medicina. 2007. 224 p.

30. Kutyrevas V.V., Popovas Yu.A., Protsenko O.A. Maro mikrobo patogeniškumo plazmidės // Mol. genetinis., mikrobiol., virusol. 1986. - Nr.6. - S.Z -11.

31. Kutyrevas V.V., Procenko O.A. Yersinia pestis II klasifikacija ir molekuliniai genetiniai tyrimai Ypač pavojingų infekcijų problemos. 1998. - Nr. 78. - P. 11 - 12.

32. Kutyrev V.V., Smirnova N.I., Genų diagnostika ir maro, choleros ir juodligės patogenų molekulinis tipavimas // Molekul, genetic., microbiol. ir virusolis. - 2003 - Nr. 1. - P. 6 14.

33. Kutyrevas V.V., Smirnova N.I. Ypač pavojingų maro, choleros ir juodligės infekcijų patogenų genetinė įvairovė ir genomų evoliucija: dabartis ir ateitis // Biotechnologija: būklė ir vystymosi perspektyvos.-M., 2005.-Ch. 1.-S. 17.

34. Laboratorinė ypač pavojingų infekcinių ligų diagnostika. Praktinis vadovas / Redagavo G.G. Onishchenko, V.V. Kutyrev.-M.: Medicina, Shiko, 2009. 472 p.

35. Maniatis T., Fritsch E., Sambrook J. Molekulinis klonavimas. M.: Mir, 1984.-480 p.

36. Martinevskis I.L. Yersinia II genties taksonomija Mat. 4-asis mokslinis konf. pagal prigimtį židinys, o prof. maras - Alma-Ata, 1965. P. 142 - 148.

37. Martinevskis I.L. Maro ir glaudžiai susijusių mikrobų biologija ir genetinės savybės. M.: Medicina, 1969. - 295 p.

38. Martinevskis I.L., Stepanovas V.M., Kenžebajevas A.Ya. Maro ir susijusių mikrobų taksonomija, mutacijos ir patogeniškumo genetika. Nukus. Iš „Karakalpakstan“, 1990. - 151 p.

39. Bendrosios bakteriologijos metodai, red. F. Gerhardt ir kt. M.: Mir, 1984. -264 p.

40. Michailova P.S. Maro mikrobo, cirkuliuojančio tarp pelėnų Užkaukazės aukštumose, taksonomija // Konferencijos medžiaga, skirta. Mikrobų instituto 50-metis. Saratovas, 1968. - P. 67 - 68.

41. Raktas į bakterijas Bergey, red. J. Houltas. N. Kriegas, P. Sneathas, J. Staley ir Williamsas. - M.: Mir, 1997. 9 leidimas. (2 tomais). - 799 p.

42. Oniščenko G.G., Kutyrevas V.V., Popovas N.V. ir kiti natūralūs maro židiniai Kaukaze, Kaspijos regione, Vidurinėje Azijoje ir Sibire / Red. G.G. Oniščenka, V.V. Kutyreva. -M.: Medicina, 2004. 192 p.

43. Peisakhis L.A., Stepenov V.M. Intraspecifinė maro sukėlėjo klasifikacija pagal geografinio zonavimo principą // Ypač pavojingų infekcijų problemos. 1975. – Laida. 2. - 5 - 9 p.

44. Popovas Yu.A. DNR zondų projektavimas ir naudojimas Yersinia genties atstovams // Genetika, mikrobiolas. ir laboratorinių metodų tobulinimas. diagnozė yra ypač pavojinga. inf. Saratovas, 1991. - P. 3-13.

45. Popovas Yu.A. Struktūrinis ir funkcinis plazmidžių organizavimas ir genų inžinerijos raida pagal šį modelį: Daktaro darbas. biol. Sci. Saratovas, 1991. - 248 p.

46. ​​Popovas Yu.A., Gorshkov O.V., Savostina E.P. et al., Yersinia pestis padermių genotipavimas iš įvairių natūralių maro židinių // Molekul, genetics, microbiology and virusology 2000. - Nr. 3. - P. 12-17.

47. Popovas Ju.A., Procenka O.A., Anisimovas P.I., Kokuškinas A.M., Mozharovas

48. T. Maro mikrobo pesticinogeniškumo plazmidžių nustatymas elektroferezės būdu agarozės gelyje // Ypač pavojingų prevencija. inf.- Saratovas, 1980.-P. 20-25.

49. Popovas N.V., Sludskis A.A. Udovikov A.I. ir kt. Yersinia pestis bioplėvelių vaidmuo maro enzootijos mechanizme // Zhurn. mikrobiol., epidemiol. imunol. 2008. - Nr. 4. - P. 118 - 120.

50. Popov Yu.A., Fursov V.V., Pesticinogeniškumo plazmidžių darinių, paženklintų transpozonais Tn1 ir Tn9, struktūrinis organizavimas // Mol. biol., genetinis. ir imunol. maras ir cholera Saratovas, 1983. - 34 - 39 p.

51. Popovas Ju.A., Jašečkinas Ju.I., Drozdovas I.G. Įvairių biovarų maro patogenų padermių pFra plazmidžių DNR struktūros molekulinė genetinė analizė // Genetika. 1998. - T. 34. - P. 198 - 205.

52. Procenko O.A., Anisimovas P.I., Mozharovas O.T. ir kiti. Maro mikrobo plazmidžių, lemiančių pesticino1, antigeno frakcijos I ir egzotoksino „pelės“ toksino sintezę, identifikavimas ir apibūdinimas // Genetika. 1983. -T. 19, Nr.7.-S. 1081-1090.

53. Ratner V.A. Molekulinė genetika: principai ir mechanizmai. Novosibirskas: Nauka, 1983. - 256 p.

54. Rozanova G.N., Serdyukova T.V., Shekhikyan M.T. et al. Maro sukėlėjas iš lauko tipo židinių Kaukaze Moksliniai tyrimai. Kaukazo ir Užkaukazės kovos su maru institutas. Stavropol, 1987. 17 p.

55. Savostina E.P., Popov Yu.A., Pagrindinių maro sukėlėjo porūšių padermių genominis polimorfizmas // Molekul, genetics, microbiology and virusology 2009. - Nr. 4. - P. 23 - 26.

56. Smirnovas G.B. Bakterijų genomų genetinės informacijos gavimo ir praradimo mechanizmai // Šiuolaikinės biologijos pažanga. 2008. - T. 128. - Nr. 1.-S. 52-76.

57. Smirnovas I.V. Jersiniozės ir susijusių mikroorganizmų sukėlėjas // Klin, mikrobiolis. antimikrobinis preparatas, chemoteris. - 2004. - T. 6, Nr. 1. - P. 10 -21.

58. Smirnova N.I., Kutyrev V.V., Lyginamoji genomų molekulinių genetinių savybių ir jų evoliucinių transformacijų choleros, maro ir juodligės sukėlėjų analizė // Molekul, genetic., mikrobiol. ir virusolis. 2006. - Nr. 2. - P. 9 - 19.

59. Stybaeva G.S., Atshabar B.B. Maro sukėlėjo molekulinės genetinės savybės (literatūros apžvalga) // Karantinas ir zoonozinės infekcijos Kazachstane. 2003. - Nr.1 ​​(7). - P. 52 - 67.

60. Suleimenovas B.M. Enzootinio maro mechanizmas. Almata, 2004. - 236 p.

61. Sultanovas G.V., Kozlovas M.P. Maras. Mikrobiologija, patogenezė, diagnostika. 1 tomas. Makhachkala: Iš akad. kaimo Mokslai, 1995. 223 p.

62. Timofejeva L.A. Apie maro mikrobo taksonomiją // Ypač pavojingų infekcijų problemos. 1972. – Laida. 1(23).- P. 15 - 22.

63. Timofejeva L.A., Aparinas T.P., Trofimenko N.Z. Sibiro židiniuose išskirtų maro mikrobų padermių aminorūgščių reikalavimai // Dokl. Irkutskas, kovos su maru institutas. Irkutskas, 1971. – Laida. 9. - 43 - 44 p.

64. Timofejeva L.A., Zhamyan Suren, Sotnikova A.N. ir kitos 1969–1971 m. Mongolijoje išskirtų maro mikrobų padermių biologinės savybės. // Ypač pavojingų infekcijų problemos. 1974. - Nr.3 (37). - P. 37 - 42.

65. Timofejeva BĮ. A., Logachev A.I. Yersinia pestis ulegeica yra naujas Mongolijoje išskirtas maro mikrobų porūšis. Knygoje: Epidemiologija ir ypač pavojingų infekcijų prevencija Mongolijoje ir SSRS. - Ulan Batoras: B.I., 1975. - P. 63 -64.

66. Tumanskis V.M. Maro mikrobo kintamumas natūraliomis maro židinio sąlygomis // Knyga: Gamta, židiniai ir epidemiologija. ypač pavojinga informacija - Saratovas, 1959. S. 189 - 199.

67. Filippovas A.A., Kutyrevas V.V., Vidjajeva N.A. ir kiti Yersinia pestis (Lehmann, Neumann) priklausomybės nuo kalcio plazmidės, koduojančios išorinės membranos baltymo (BVM2) sintezę, lokuso klonavimas // Genetika. 1991. - T. 27, Nr. 4.-S. 598-606.

68. Filippovas A.A., Solodovnikovas N.S., Kukleva L.M. ir kiti. Maro patogenų padermių iš įvairių natūralių židinių plazmidės sudėties tyrimas // JMEI. 1992. - Nr. 3. - P. 10 - 13.

69. Tseneva G.Ya., Solodovnikova N.Yu., Voskresenskaya E.A. Yersinia virulentiškumo molekuliniai aspektai // Klin, mikrobiolis. antimikrobinis preparatas, chemoteris. 2002. - T. 4, Nr. 3. - P. 248 - 266.

71. Yashechkin Yu.I., Kirillina O.A., Popov Yu.A. ir kiti 68 ppm plazmidės Y pestis 231 fizinis kartografavimas // Ypač pavojingų infekcijų problemos. -1999 m. -Nr. 1 S. 26-28.

72. Achtman M., Morelli G., Zhu R. ir kt. Maro bacilos, Yersinia pestis II Proc, mikroevoliucija ir istorija. Natl". Acad. Sei. USA. 2004. - 101. - P. 17837-17842.

73. Achtman M., Zurth K., Morelli G. ir kt. Yersinia pestis, maro sukėlėjas, yra neseniai atsiradęs Yersinia pseudotuberculosis II PNAS klonas. 1999. - V. 96;N24. -P. 14043-14048.

74. Anisimov A.P.*, Lindler L.E., Pier G.B. Yersinia pestis II Clin tarprūšinė įvairovė. Microbiol. 2004. - V. 17(2). - P. 434 - 464.

75. Anisimovas P.I., Popovas Iu.A., Kokushkin A.M. Funkcinis fenotipinis maro patogeno ir maro enzootijos kintamumas // Med. Parazitolis. (Mosk). 2001. - N2.-P. 35-40.

76. Bai G., Smith E., Golubov A., Pata J. ir kt. Diferencinis genų reguliavimas Yersinia pestis ir Yersinia pseudotuberculosis: hipoksijos poveikis ir galimas plazmidės reguliatoriaus vaidmuo // Adv. Exp. Med. Biol. 2007. - V. 603. - P. 131 - 144.

77. Baxevanis A.D., Francis-Ouellette B.F./ Bioinformatika. Praktinis genų ir baltymų analizės vadovas / John-Willey N.Y., 2001. 470 p.

78. Bearden S.W., Sexton C., Pare J. ir kt. Susilpninti enzootiniai (pestoidiniai) Yersinia pestis izoliatai išreiškia aktyvią aspartazę // Mikrobiologija. 2009 – V.155. -P. 198-209.

79. Beale J., Lee S.Y., Iwata S., Beis K. Alifatinio sulfonatą surišančio baltymo SsuA struktūra iš Escherichia coli II Acta Cryst. 2010. - V. 66. - P. 391 -396.

80. Ben-Gurion R., Hertman J., Yersinia enterocolitica linijinės plazmidės profagas su bakteriocinu panašia medžiaga kovalentiškai uždarais galais // Moll. Microbiol. - 1958-V. 48.-P. 989-1003.

81. Bercovier H. Yersinia pestis giminingumas tarp rūšinių ir tarprūšinių DNR hibridizacijos būdu ir jo ryšys su Yersinia pseudotuberculosis II Curr. Microbiol. 1980. - Nu 4. - P. 225 - 229.

82. Bobrovas A.G., Kirillina O.A., Forman S. ir kt. Įžvalga apie Yersinia pestis bioplėvelės vystymąsi: hms vidinės membranos baltymų, dalyvaujančių egzopolisacharidų gamyboje, topologija ir sąveika // Environ.microbiol. - 2008. V. 10, N 6.-P. 1419-1432 m.

83. Bobrovas A.G., Perry R.D. Yersinia pestis lacZ išreiškia mažo fermentinio aktyvumo beta-galaktozidazę // FEMS Microbiol. Lett. 2006. - V. 255, N 1. - P. 43 -51.

84. Brubaker R.R. Purino mononukleotidų tarpusavio konversija Pasteurella pestis II Infect. Imunitetas. 1970. - V. 1. - P. 446 - 454.

85. Brubaker R.R. Yersinia gentis: virulentiškumo biochemija ir genetika // Current Topics in Microbiol and Immunol. 1972. -N 57. - P. 293 - 299.

86. Brubaker R.R. Neseniai atsiradęs maras: nusikalstamos evoliucijos procesas // Mikrobų ekologija. 2004. - V. 47. - P. 293 - 299.

87. Burrows T.W. Pasteurella pestis virulentiškumas ir imunitetas marui // Er-geb Mikrobiol Immunitatsforsch Exp Ther. 1963 - V. 37. - P. 59-113.

88. Buchrieser C., Prentice M., Carniel E. 102 kilobazių nestabilus Yersinia pestis regionas apima didelio patogeniškumo salą, susietą su pigmentacijos segmentu, kuriame vyksta vidinis persitvarkymas // J. Bacterid. - 1998. - V. 180. - P. 2321-2329.

89. Cao Y., Huang H., Meng K. ir kt. Yersinia pestis biovaro Microtus str. a-galaktozidazės klonavimas ir funkcinė ekspresija. 91001 //Biosci. Biotechnol. Biochem. 2008.-V. 72, N 8. - P. 2203 - 2205.

90. Grandinė P.S., Carniel E., Larimer F.W. ir kt. Įžvalgos apie Yersinia pestis evoliuciją, palyginus visą genomą su Yersinia pseudotuberculosis! I Proc. Natl. Akad. Sei. JAV. 2004. - V. 191, N38.-P. 13826-13831.

91. Grandinė P. S., Hu P., Malfatti S. A. ir kt. Visiška Yersinia pestis padermės Antiqua ir Nepal516 genomo seka: atsirandančio patogeno genų mažinimo įrodymai // J. Bacterid. 2006. - V. 188, N 12. - P. 4453 - 4463.

92. Chuang Peng / Atstumais pagrįsti filologetinių medžių statybos metodai, p. 1 -11,2007.

93. Cobbs C.G., Chansolme D.H. Maras. // Klin. Dermatolis. 2004. - V. 22(3). -P. 303-312f

94. Cornells G.R., Boland A., Boyd A.P. ir kt. Yersinia, antišeimininko genomo, virulentiškumo plazmidė // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - V. 62, Nr.4. -P. 1315-1352.

95. Cowan C. ir kt., Yersinia pestis invazija į epitelio ląsteles: Y. pestis specifinės invazijos įrodymai // Infect. Imunitetas. 2000. - V. 68(8). - P. 4523 - 4530.

96. Dale C., Wang B. ir kt. Maras // Proc. Natl. Akad. Sei. JAV. 2002. -T.99, Nr.19.-P. 12397-12402.

97. Darby C., Ananth S.L., Tan L., Hinnebusch B.J. GmhA Yersinia pestis geno, reikalingo blusų blokadai, identifikavimas naudojant Caenorhabditis elegans bioplėvelę// Infect.Immun.- 2005. V.73, N11. - P. 7236 - 7242.

98. Deng W., Burland V., Plunkett G. ir kt. Yersinia pestis KIM genomo seka // J. Bacteriol. 2002 – V. 184 – P. 4601 – 4611.

99. Dennis D.T., Chow C.C. Maras // J. Pediatr. Užkrėsti. Dis. 2004. - V. 23(1). -P. 69-71.

100. DeSalle R., Giribet G., Wheeler W. / Molekulinės sistematikos ir evoliucijos metodai / Birkhauser, 2002. 420 p.

101. Devignat R. Variétés de l'espèce Pasteurella pestis // Bull. 1951. - V. 4.-247.

102. Epinger M., Guo Z., Sebastian T., Song Y., Lindl er L.E., Yang R., Ravel J. Yersinia pestis izoliatų genomo sekų juodraštis iš natūralių endeminio maro židinių kine // J. Bacteril. 2009. - V. 191. - P. 7628 - 7629.

103. Epinger M., Rosovitz M.J., Fricke W.F. ir kt. Visa Yersinia pseudotuberculosis IP31758 genomo seka, Tolimųjų Rytų skarlatina karštligė // Plos Genetics 2007. - V. 3 - P. 1508 - 1522.

104. Eppinger M., Worsham P.L., Nikolich M.P. ir kt. Giliai įsišaknijusios Yersinia pestis padermės Angola genomo seka atskleidžia naujų įžvalgų apie maro bakterijos evoliuciją ir pangenomą // J. Bacteriol. 2010. - V. 192, N 6. - P.i1685-1699.

105. Felek S., Tsang T.M., Krukonis E.S. Trys Yersinia pestis adhezinai palengvina Yop patekimą į eukariotų ląsteles ir prisideda prie maro virulentiškumo // Infect. Imunitetas. V. 77 (2). - P. 825 - 836.

106. Felsenstein J., PHYLIP-Phylogeny Inference Package (3.2 versija). Kladistika, 1989, t. 5, p. 164–166, http://evolution.genetics.washington.edu/philip.html.

107. Fetherston J.D., Perry R.D. Yersinia pestis KIM6+ pigmentacijos lokusas yra šalia įterpimo seka ir apima struktūrinius pesticino jautrumo ir HMWP2 genus // Mol. Microbiol. 1994. - V. 13, Nr. 4. - P. 697 - 708.

108. Forman S., Wulff C. R., Myers-Morales T. ir kt. Yersinia pestis yadBC, naujas buboninio maro virulentiškumas // Infect Immun. - 2008. V. 76 (2). -P. 578-587.

109. Garcia E., Worsham P., Bearden S. ir kt. Pestoides F, netipinė Yersinia pestis atmaina iš buvusios Sovietų Sąjungos // Adv Exp Med Biol. 2007. - V. 603. -P. 17-22.

110. Gascuel O. / Evoliucijos ir filogenijos matematika. / Clarendon spauda. Oksfordas. 2004.-33 p.

111. Gintsburg A.L., Shovadaeva G.A., Shubin F.N. ir kt. Integracija su chromosoma - alternatyvi nuo kalcio priklausomų plazmidžių būsena Yersinia // Mol. Gen. mikrobiol. Virusolis. 1989. -N 5. -P. 7-11.

112. Guiyoule A., Gerbaud G., Buchriester C. ir kt. Perkeliamas plazmidės sukeltas atsparumas streptomicinui klinikiniame Yersinia pestis II Emerg izolate. Užkrėsti. Dis. 2001. – T. 7, Nr. 1. - P. 43 - 48.

113. Guo Y., Zhang L., Xia L. ir kt. Yersinia pestis biocheminės savybės, išskirtos iš Kinijos Yunnan provincijos Yulong apygardos // Endem. Dis. Bull. -2008.-V. 23.-P. 12-14.

114. Hall-Stoodley L., Costerton J.W., Stoodley P. Bakterijų bioplėvelės: nuo natūralios aplinkos iki infekcinių ligų. Nat. Rev. Microbiol. 2004, N2. - P 95 -108.

115. Hare J.M., McDonough K.A. Aukšto dažnio RecA priklausomi ir nepriklausomi Kongo raudonųjų surišimo mutacijų mechanizmai Yersinia pestis. H J Bakteriolis. 1999.-V. 181(16). - P. 4896-4904.

116. Hillier S.L., Charnetzky W.T. Greitasis diagnostinis testas, naudojant izocitrato liazės aktyvumą Yersinia pestis II J.Clin.Microbiol. - 1981. V.13, N4. -P. 661-665.

117. Hinnebusch B.J. Blusų pernešamo perdavimo evoliucija Yersinia pestis II Curr. Problemos Mol. Biol. 2005. - V. 7, N2. - P. 197 - 212.

118. Hinnebusch B.J., Fisher E.R., Schwan T.G. Yersinia pestis plazminogeno aktyvatoriaus ir kitų plazmidės koduojamų faktorių vaidmens įvertinimas nuo vidutinio klimato priklausomo blusos blokavimo // Infect. Imunitetas. 1998. - V. 178. - P. 1406 -1415.

119. Hinnebusch B.J., Perry R.D., Schwan T.G. Yersinia pestis hemin saugyklos (hms) lokuso vaidmuo perduodant marą blusomis // Mokslas. 1996. - V 273, N5273-P. 367-370.

120. Hinnebusch B.J., Rudolf A.E., Cherepanov P.et al. Yersinia pelių toksino vaidmuo išgyvenant Yersinia pestis blusų vektoriaus vidurinėje žarnoje // Mokslas. - 2002.-V. 296.-P. 733-735.

121. Hoiczyk E., Roggenkamp A., Reichenbecher M. ir kt. Yersinia YadA ir Moraxella UspAs struktūros ir sekos analizė atskleidžia naują adhezinų klasę // J. EMBO 2000. - V. 19(22). - P. 5989 - 5999.

122. Iriarte M., Cornelis G.R. Yersinia patogenezės molekuliniai veiksniai // Microbiologia. 1996.-V. 12 straipsnio 2 dalį. - P. 267-280.

123. Jackson S., Burrows T.W. Virulentiškumą didinantis geležies poveikis nepigmentuotiems virulentiškų Pasteurella pestis padermių mutantams // Br. J. Exp. Pathol. - 1956. -Y. 37.- P. 577-583.

124. Joshua G.W.P., Karlyshev A.V., Smith M.P. ir kt. Caenorhabditis elegans Yersinia infekcijos modelis: bioplėvelės susidarymas ant biotinių paviršių // Mikrobiologija. 2003. - V. 149. - P. 3221 - 3229.

125. Kienle Z., Emody L., Svanborg C., O"Toole P.W. Lipniosios savybės, kurias suteikia Yersinia pestis plazminogeno aktyvatorius. II J. Gen. Microbiol. 1992. -V. 138.-1679-1687.

126. Kitching I.J., Forey P.L., Humphries C.J., Williams D.M. / Kladistika. Parsimumo analizės teorija ir praktika. - Oksfordo mokslo publikacijos, 1998. - 223 p.

127. Kutyrevas V.V., Boolgakova E.G., Yidyaeva N.A. ir kt. Lyginamosios skirtingų Yersinia genties bakterijų grupių charakteristikos // Natural Infect. Dis.: Abst. of Scient. Konf. gruodžio 6 d. Ulan Batoras, 2001. – P. 39–40.

128. Kutyrevas V.V., Filippovas A.A., Oparina O.S. ir kt. Yersinia pestis chromosomų determinantų Pgm+ ir Psts, susijusių su virulentiškumu, analizė // Microb. Pa-tog. 1992.-V. 12.- P. 177-186.

129. Kutyrevas V.Y., Vidjajeva N.A., Bobrovas A.G. ir kt. Pelės toksino genas koduoja išskiriamą fosfolipazę D // Bakterijų baltymų toksinai. Jena-Štutgartas. - 1997.-P. 59-60.

130. Lahteenmaki K., Virkola R., Saren A. ir kt. Yersinia pestis plazminogeno aktyvatoriaus pla ekspresija padidina bakterijų prisirišimą prie žinduolių ekstraląstelinės matricos // Infect Immun. 1998. - V. 66(12). - P. 5755 - 5762.

131. Lathem W.W., Price P.A., Miller V.L., Goldman W.E. Plazminogeną aktyvuojanti proteazė konkrečiai kontroliuoja pirminio pneumoninio maro vystymąsi // Mokslas. 2007. - V. 315 (5811). - P. 509 - 513.

132. Lazarus A.A., Decker C.F. Maras // Respir Care Clin. N Am. 2004.-V. 10(1).-P. 83-98.

133. Li Y., Hauck Y., Platonov M.E. ir kt., ML VA atlikta Yersinia pestis genotipų nustatymas ir analizė: Vidurinės Azijos maro židinių išplitimo visame pasaulyje įžvalgos // PLoS ONE. 2009.-V. 4 (6)., e6000.j

134. Liang Y., Hou X., Wang Y. ir kt. Visiškai sekvenuotų Yersinia pestis II padermių genomo pertvarkymai J. Clin. Microbiol. - 2010. - V. 48 (5). - P. 1619-1623.

135. Lillard J.W., Fetherston J.D., Pedersen L. ir kt. Yersinia pestis II geno hemino saugojimo (hms) sistemos seka ir genetinė analizė. - 1997. V. 193. - P. 13-21.

136. Lindler LE. Maro patogeno Yersinia pestis II tipavimo metodai J. AOAC Int. 2009. - V. 92(4). - P. 1174 - 1183.

137. Lindler L.E. Yersinia pestis – specifinės plazmidės pFra ir pPla // Yersinia molekulinė ir ląstelių biologija / Red.: E. Carniel, B.J. Yinnebusch. Horison Bioscience, 2004. – sk.

138. Matsumoto H., jaunasis G.M. Perkelti Yersinia efektoriai // Curr. Nuomonė. Microbiol. 2009. - V. 12(1). - P. 94 - 100.

139. McDonough K.A., Barnes A.M., Quan T.J. ir kt. Yersinia pestis pla geno mutacija keičia maro bacilos ir blusos (Siphonaptera: Cerato-phyllidae) sąveikos eigą I I J.Med. Enthomilis. 1993. - V. 30. - V. 772 - 780.

140. Mollaret H., Mollaret C. Yersina genties melibiozės fermentacija ir jos reikšmė Y. pestis II Bull Soc Pathol Exot Filiales veislių diagnostikai. 1965.-V. 58(2).-P. 154-156.

141. D. W. kalnas / Bioinformatika. Sekos ir genomo analizė. Gold Spring Harbor laboratorinė spauda, ​​2003. - 50 p.

142. Naumovas A.V., Kuz"michenko I.A., Taranenko T.M. ir kt. Maro sukėlėjo patogeniškumo biocheminiai aspektai // Med. Parazitol. (Mosk). 1995. - N 4 - P. 17-22.

143. Navid A., Almaas E. Genomo masto metabolinio tinklo rekonstrukcija Yersinia pestis, padermė 91001 // Mol. Biosyst. 2009. - V. 5 (4). - P. 368 -375.

144. Odaert M., Berche P., Simonet M. Yersinia pseudotuberculosis molekulinis tipavimas naudojant IS200 tipo elementą // J. Clin. Microbiol. 1996. - V. 34(9). -P. 2231-2235.

145. Paerregaard A., Espersen F., Skurnik M. Yersinia išorinės membranos baltymo YadA vaidmuo adhezijoje prie triušio žarnyno audinio ir triušio žarnyno šepetėlio kraštinės membranos pūslelių // APMIS. 1991. - V. 99(3). - P. 226 - 232.

146. Paiva Nunes M., Suassuna I., Rocco Suassuna I. Yersinia pestis mėginių, išskirtų Brazilijoje, biocheminės charakteristikos // Rev. Latinoam. Microbiol. 1977. -V. 19(4).-P. 189-197.

147. Pan N.J., Brady M.J., Leong J.M., Goguen J.D. Nukreipimas į III tipo sekreciją Yersinia pestis II Antimicrob. Chemother agentai. 2009. - V. 53 (2). - P. 385 -392.

148. Panina E.M., Vitreschak A.G., Mironovas A.A., Gelfand M.S. Aromatinių aminorūgščių sintezės reguliavimas gama-proteobakterijose // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V. 3, N 4. - P. 529 - 543.

149. Parhill J., Wren B:W., Thomson N.R. ir kt. Yersinia pestis, maro sukėlėjo, genomo seka // Gamta. 2001. - V. 413. - P. 523 - 527.

150. Patel C.N., Wortham B.W., Lines J.L. ir kt. Poliaminai būtini maro bioplėvelei susidaryti // J. Bacteriol. 2006.-V. 188, N 7. - P. 2355 - 2363.

151. Pendrakas M.L., Perry R.D. Yersinia pestis I I Biol. hemino saugojimo lokuso apibūdinimas. Metalai 1991. - V. 4. - P. 41 - 47.

152. Pendrakas M.L., Perry R.D. Baltymai, būtini Yersinia pestis II Mol Hms+ phe-notipo ekspresijai. Microbiol. 1993. - V.8. - P. 857 - 864.

153. Perry R.D., Pendrak M., Schuetze P. Hemino saugojimo lokuso, dalyvaujančio Yersinia pestis II J. Bacteriol pigmentacijos fenotipe, identifikavimas ir klonavimas. 1990. - V. 172. - P. 5929 - 5937.

154. Perry R.D., Balbo P.B., Jonesas H.A. ir kt. Yersiniabactin from Yersinia pestis." sideroforo biocheminis apibūdinimas ir jo vaidmuo geležies transporte ir reguliavime // Mikrobiologija. 1999. - V. 145, 5 dalis. - P. 1181 - 1190.

155. Perry R.D., Fetherston J.D. Yersinia pestis etiologinis maro sukėlėjas // Clin. mikrobiol. Rev. 1997. - V. 10. - P. 35.

156. Perry R.D., Lucier T.S., Sikkema D.J. ir kt., Hemino ir neorganinės geležies rezervuarai Yersinia pestis II Infect. Imunitetas. - 1993. V. 61. - P. 32 - 39.

157. Perry R.D., Straley S.C., Fetherston J.D. ir kt. Yersinia pestis KIM5 mažo Ca2+ atsako plazmidės pCDl DNR sekos nustatymas ir analizė // Infect. Imunitetas. 1998. - V. 6, N 10. - P. 4611 - 4623.

158. Perry R.D. Blusų maras: Yersinia pestis II išgyvenimas ir perdavimas ASM naujienos. 2003. - V.69, N 7. - P. 385 - 389.

159. Maras. Faktų lapai N267. Pasaulio sveikatos organizacija, prieinama adresu: http//www.who.int/mediacentre/factssheets/fs267/en/index.htm.Prieiga 2006 m. balandžio 18 d.

160. Portnoy D.A., Moseley S.L., Falkow S. Yersinia enterocolitica patogenezės plazmidžių ir su plazmidėmis susijusių determinantų apibūdinimas // Infect. Imunitetas. 1981. - V. 31. - P. 775 - 782.

161. Pouillot F., Fayolle C., Camiel E. Yersinia pseudotuberculosis konservuotų ir Yersinia pestis I I Infect prarastų chromosomų regionų apibūdinimas. Imunitetas. 2008. - V. 76(10). - P. 4592 - 4599.

162. Prasad Maharjan R., Yu P.L., Seeto S., Ferenci T. Izocitrato liazės ir glioksilato ciklo vaidmuo Escherichia coli auginant ribotą gliukozės kiekį // Res. Microbiol. 2005. - V. 156(2). - P. 178 - 183.

163. Prentice MB, Rahalison L. Plague // Lancet. 2007. - V. 369, N 9568. - P. 1196-1207.

164. Price S.B., Cowan C., Perry R.D., Straley S.C. Yersinapestis V antigenas yra reguliuojantis baltymas, būtinas nuo Ca2(+) priklausomam augimui ir maksimaliai mažai Ca2+ atsako virulentiškumo genų ekspresijai // J. Bacterid. 1991. - V. 173(8). - P. 2649 - 2657.

165. Rakin A., Boolgakowa E., Heesemann J. Yersinia pestis bakteriocino pesticino genų klasterio struktūrinė ir funkcinė organizacija // J. Microbiol. 1996.-V. 142.-P. 3415-3424.

166. Richardson D.J., Berks B.C., Russell D.A. ir kt. Funkcinė, biocheminė ir genetinė prokariotinių nitratų reduktazių įvairovė // CMLS. 2001. - V. 58. - P. 165-178.

167. Sneath P.H., Socal R.R. Skaitmeninė taksonomija II Gamta. 1962. - N 193. - P. 855 - 860.

168. Quan T., Van der Linden J., Tsuchiya K. Galiojančio izocitrato liazės tyrimo įvertinimas greitam numanomam Yersinia pestis II identifikavimui J. Clin. Microbiol. 1982.-V. 15,N16.-P. 1178-1179.

169. Sanger F., Nicklen L., Coulson A. DNR sekos nustatymas naudojant grandinės nutraukimo inhibitorius // Proc. Natl. Akad. Sci. JAV. 1977. – T. 74. - P. 5463 -5467.

170. Savostina E.P., Popov Iu.A., Kashtanova T.N. ir kt. Pagrindinių maro sukėlėjų padermių porūšių genominis polimorfizmas // Mol. Gen. mikrobiol. Virusolis. -2009-N4. P. 23-27.

171. Sebbane F., Jarrett C. O., Gardner D. ir kt. Yersinia pestis plazminogeno aktyvatoriaus vaidmuo sergant skirtingomis septicinėmis ir buboninėmis blusų pernešamo maro formomis // Proc.Natl. AcadlSci.USA. 2006. – V.103, N 14 – P.5526 – 5530.

172. Sebbanas F., Jarrett G.O., Linkenhoker J.R., Hinnebusch B.J. Konstitucinio izocitrato liazės aktyvumo įvertinimas Yersinia pestis užsikrėtus blusų pernešėju ir "žinduolių šeimininku" // Infect, and Immun - 2004. V. 72, N 12. - P. 7334-7337.

173. Semple C., Steel M. / Filogenetika. Oksfordo universiteto leidykla, 2003 m. – 256 p

174. Simonet M., Riot B., Fortineau N., Berche P. Yersinia pestis invazinų gamyba panaikinama įterpus į IS200 panašų elementą į inv geną // Infect Immun. 1996. - V. 64(1). - P. 375 - 379.

175. Skrzypek E., Straley S.C. Skirtingas lcrV delecijų poveikis V antigeno sekrecijai, mažo Ca2+ atsako reguliavimui ir Yersinia pestis II virulentiškumui J. Bacteriol. 1995. - V. 177(9). - P. 2530 - 2542.

176. Song Y., Tong Z., Wang J. ir kt., Visiška Yersinia pestis padermės 91001 genomo seka, žmonėms avirulentiškas izoliatas // DNA Res. 2004. - V. 11 (3). -P. 179-197.

177. Stenseth N.C., Atshabar B.B., Begon M. ir kt. Maras: praeitis, dabartis ir ateitis // PLoS Med. 2008. - V. 5(1)., e3.

178. Straley ir kt., Genų ekspresijos ir patogenezės aplinkos moduliavimas Yersinia // Trends Microbiol. 1995. - V. 3(8). - P. 310 - 317.

179. Sun Y.C., Hinnebusch B.J., Darby C. Eksperimentiniai neigiamos atrankos įrodymai Yersinia pestis pseudogene evoliucijoje // Proc. Natl. Akad. Sei. JAV. 2008. V. 105, N 2. - P. 8097 - 8101.tyf

180. Surgalla M. J., Beesley E. D. Kongo raudonojo agaro terpė, skirta Pasteurella pestis pigmentacijai aptikti // Appl. Microbiol. - 1969. V. 18(5). - P. 834 -837.

181. Tahir Y., Skurnik M. YadA, daugialypis Yersinia adhezinas // Tarpt. J. Med. Microbiol. 2001. - V. 291(3). - P. 209 - 218.

182. Takahashi H., Watanabe H. Maras // Nippon Rinsho. 2007. - V. 65. - P. 54-59.

183. Tiball R.W., Hill J., Lawton D.J., Brown K.A. Yersinia pestis ir maras I I Biochem. Soc. Trans. 2003. - V. 31. - P. 104 - 107.

184. Weerasingle J.P., Dong T., Schertzberg M.R. ir kt. Stacionarios fazės arginino biosintetinio operono argCBH ekspresija Escherichia coli II BMC mikrobiologijoje. 2006. - V. 6. - P. 14 - 26.

185. Williamson ED. Maras. // Vakcina. 2009. - V. 4. - P. 56 - 60.

186. Wren B.W. Mikrobų genomo analizė: virulentiškumo įžvalgos. Šeimininko prisitaikymas ir evoliucija // Nature Rev. Genet. 2000. - V. 1. - P. 30 - 39.

187. Wren B.W. Yersinia – pavyzdinė gentis, skirta tirti sparčią bakterijų patogeno evoliuciją//Gamtos apžvalgos. Mikrobiologija. 2003.-V.l. - P.55-64.

188. Worsham P.L., Roy C. Pestoides F, Yersinia pestis padermė, neturinti plazminogeno aktyvatoriaus, yra virulentiška aerozoliniu būdu // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. - V. 529. -P. 129-131.

189. Xiong Jin / Essential bioinformatics. Kembridžo univ. paspauskite. 2006. 361 p.

190. Zhou D., Han Y., Song Y. ir kt. Lyginamoji ir evoliucinė Yersinia pestis II užkrečiamų mikrobų genomika. 2004. - V. 6(13). - P. 1226 - 1234.

191. Zhou D., Tong Z., Song Y. ir kt. Metabolinių variacijų tarp Yersinia pestis biovarų genetika ir naujo biovaro, mikroto, pasiūlymas // J. Bacteriol. -2004 m. V. 186. - P. 5147 - 5152.

Atkreipkite dėmesį, kad aukščiau pateikti moksliniai tekstai yra paskelbti tik informaciniais tikslais ir buvo gauti naudojant originalų disertacijos teksto atpažinimą (OCR). Šiuo atžvilgiu juose gali būti klaidų, susijusių su netobulais atpažinimo algoritmais.
Mūsų pristatomuose disertacijų ir santraukų PDF failuose tokių klaidų nėra.

Yersinia pestis pagrindinis ir nedidelis porūšis

03.02.03 – mikrobiologija

disertacijos akademiniam laipsniui gauti

biologijos mokslų kandidatas

Saratovas – 2010 2

Darbas buvo atliktas federalinėje valstybinėje institucijoje „Federalinės vartotojų teisių apsaugos ir žmogaus gerovės priežiūros tarnybos Rusijos tyrimų kovos su maru institutas „Mikrobas““

Moksliniai vadovai:

Rusijos medicinos mokslų akademijos narys korespondentas, medicinos mokslų daktaras, profesorius Vladimiras Viktorovičius Kutyrevas biologijos mokslų daktaras, vyresnioji mokslo darbuotoja Galina Aleksandrovna Erošenko

Oficialūs varžovai:

Biologijos mokslų daktarė, profesorė Lidija Vladimirovna Karpunina Medicinos mokslų daktarė Natalija Ivanovna Mikšis

Vadovaujanti organizacija: įsteigta Rusijos medicinos mokslų akademija „Epidemiologijos ir mikrobiologijos tyrimų institutas, pavadintas garbės akademiko N.F. Gamaleja RAMS

Gynimas vyks „_“2010_val. daktaro ir kandidato disertacijų gynimo disertacijos tarybos posėdyje D 208.078.01 Federalinėje valstybinėje institucijoje „Rusijos tyrimų kovos su maru institutas „Mikrobas“ (410005, Saratovas, Universitetskaya). St., 46).

Disertaciją galima rasti Federalinės valstybinės institucijos „Rusijos tyrimų kovos su maru institutas „Mikrobas“ mokslinėje bibliotekoje.

Disertacijos tarybos mokslinis sekretorius, biologijos mokslų daktaras, vyresnysis mokslo darbuotojas A.A. Sludskis

BENDROSIOS DARBO CHARAKTERISTIKOS

Iki šiol naudotose Yersinia pestis klasifikacijose buvo atsižvelgta tik į morfologines, kultūrines, biochemines ir kitas fenotipines charakteristikas [Bezsonova, 1928; Borzenkovas, 1938 m.; Tumanskis, 1957; Timofejeva, 1968 m.; Kutyrev, Protsenko, 1998; Devignat, 1951] ir nebuvo be trūkumų, susijusių su šių savybių kintamumu. Tačiau naujausi fundamentinės genetikos ir molekulinės mikrobiologijos pažanga leidžia maro sukėlėjo sisteminimo problemų sprendimą perkelti į kokybiškai naują lygmenį, remiantis jo molekulinių genetinių savybių panaudojimu.

Pagal šiuo metu priimtą vidaus klasifikaciją maro sukėlėjo padermės skirstomos į pagrindinį ir 4 mažuosius (Kaukazo, Altajaus, Gissaro ir Ulegey) porūšius [Timofejeva, 1985; Kutyrev, Protsenko, 1998]. Pagal plačiai paplitusią užsienio klasifikaciją Y. pestis padermės, remiantis daugelio biocheminių savybių skirtumais (gebėjimas fermentuoti glicerolį, redukuoti nitratus ir oksiduoti amoniaką) ir istoriniu bei geografiniu pagrindu, skirstomos į tris biologinius variantus: antiqua. (antikvariniai), medievalis (viduramžiai) ir orientalis ( rytietiški). Pagal fenotipines savybes pagrindinio porūšio padermės atitinka tris užsienio klasifikacijoje priimtus biovarus (senovės, viduramžių ir rytų). Tačiau Rusijos Federacijoje ir kaimyninėse šalyse natūraliuose maro židiniuose cirkuliuojančios Y. pestis padermės lieka nesusistemintos pagal priklausymą konkretiems biovarams.

Skirtingai reikšmingų biocheminių savybių raiškos požiūriu aktyviausios yra antikvarinio biovaro padermės. Jie fermentuoja glicerolį ir turi denitrifikacinį aktyvumą. Viduramžių biovaro Y padermės.

pestis nesugeba redukuoti nitratų, bet fermentuoja glicerolį ir arabinozę.

Rytinio biovaro padermės nefermentuoja glicerolio, bet aktyviai mažina nitratus ir utilizuoja arabinozę.

Rusijos Federacijoje ir kaimyninėse šalyse cirkuliuojančios pagrindinių porūšių padermės, kaip taisyklė, yra labai virulentiškos ir turi didelę epideminę reikšmę. Jie nefermentuoja ramnozės ir melibiozės, nėra jautrūs pesticinui I, pasižymi dideliu izocitralazės gamybos lygiu. Smulkių porūšių padermės fermentuoja ramnozę ir melibiozę, yra jautrios pesticinui I, nepasižymi izocitrato-liazės aktyvumu, yra selektyviai virulentiškos laboratoriniams gyvūnams ir yra nedidelės epidemijos reikšmės.

Skirtingos biocheminių savybių, naudojamų skirstant Y. pestis padermes į biovarus ir porūšius, genetinės priežastys iki šiol nėra pakankamai ištirtos. Vienintelis patikimai nustatytas dalykas yra tai, kad rytinio biovaro padermių glicerolio fermentacijos trūkumo priežastis yra glicerolio-3-fosfato dehidrogenazės (glpD) geno mutacija. Buvo parodyta, kad visose rytinio biovaro padermėse šio geno delecija yra 93 bp. . Literatūroje yra tik keli tyrimai, nustatantys pagrindinio ir šalutinio porūšio Y. pestis genų struktūros skirtumus, koduojančius nitratų redukciją ir ramnozės fermentaciją [Kukleva ir kt., 2008;

2009 m.; Anisimov ir kt., 2004; Zhou ir kt., 2004].

Maro mikrobų padermių nevienalytiškumo priežastys mitybos poreikių požiūriu lieka nežinomos. Skirtingų natūralių maro židinių padermės skiriasi mitybos poreikiais, kuriuos lemia tarpinės apykaitos genų sutrikimai, kuriuos galima panaudoti genetinėje schemoje, skirtoje Y. pestis padermėms atskirti nuo skirtingų natūralių maro židinių.

Genų struktūros pokyčių, kuriais grindžiama skirtinga mikrobiologinių ir biocheminių požymių raiška, nustatymas bus patikimas pagrindas kuriant genetinę schemą maro patogeno padermėms klasifikuoti, taip pat nustatyti pagrindines Y intraspecifinės evoliucijos kryptis. pestis.

Darbo tikslas. Skirtingos biocheminių charakteristikų, naudojamų maro sukėlėjo padermėms skirstant į porūšius ir biovarus, genetinio pagrindo nustatymas.

Tyrimo tikslai:

Apibūdinti darbe naudojamas Y. pestis padermes, išskirtas iš natūralių maro židinių Rusijos Federacijoje ir kaimyninėse šalyse, jų biocheminėmis savybėmis (nitratų redukcija, izocitrato liazės gamyba, arabinozės ir melibiozės fermentacija), kuriomis grindžiamas skirstymas į porūšiai ir biovarai. Nustatyti, ar Rusijoje ir kaimyninėse šalyse cirkuliuojančios padermės priklauso tam tikriems biovarams.

Ištirti genų, koduojančių diferencines charakteristikas, naudojamų skirstant į biovarus – nitratų redukciją ir arabinozės fermentaciją, struktūrinę ir funkcinę organizaciją.

Nustatyti Y. pestis genų, lemiančių melibiozės fermentaciją ir izocitrato liazės gamybą, pokyčius, kuriais grindžiamas maro sukėlėjo pagrindinio ir smulkaus porūšio diferenciacija.

Nustatyti Kaukazo porūšio Y. pestis padermių mitybos poreikius ir nustatyti jų auksotrofijos genetinį pagrindą.

Įvertinti gautų rezultatų panaudojimo perspektyvas sukurti Y. pestis padermių intraspecifinės klasifikacijos genetinę schemą ir nustatyti pagrindines šio patogeno intraspecifinės evoliucijos kryptis.

Mokslinė naujovė dirbti. Remiantis išsamios mikrobiologinės, biocheminės ir genetinės analizės duomenimis, nustatyta, kad Rusijos Federacijos ir kaimyninių šalių gamtiniuose židiniuose cirkuliuojančios maro sukėlėjo padermės priklauso senovės ir viduramžių biovarams.

Pirmą kartą buvo įrodyta, kad kai kurių Rusijos Federacijoje ir kaimyninėse šalyse cirkuliuojančių pagrindinių porūšių padermių nitratų redukcinio aktyvumo stokos priežastis yra vieno nukleotido pakaitalo G T buvimas periplazminės nitratų reduktazės padėtyje. genas – napA, kuris įrodo, kad šios padermės priklauso viduramžių biovarui. Šio bruožo ekspresijos trūkumas Altajaus ir Gissar porūšių padermėse atsiranda dėl timino nukleotido (+T) įterpimo į kito geno ssuA 302 padėtį, dėl ko pasikeičia skaitymo rėmas ir sutrinka koduojamo transportinio baltymo SsuA, kuris taip pat dalyvauja redukuojant nitratus, struktūrą.

Pirmą kartą buvo nustatyta, kad arabinozės fermentacijos nebuvimas Y.

Altajaus ir Gissaro porūšių pestis yra susijęs su mutacija arabinozės operono – araC – reguliavimo gene, kuriame yra guanino nukleotido (+G) įterpimas 773 padėtyje nuo geno pradžios, todėl skaitymo rėmo poslinkis ir reguliuojančio baltymo AraC struktūros sutrikimas, būtinas genų transkripcijos arabinozės operono inicijavimui.

Pirmą kartą buvo nustatytas skirtingos izocitrato liazės gamybos pagrindinio ir mažo porūšio maro patogeno padermėse genetinis pagrindas, susijęs su dviejų nukleotidų (+CC) įterpimu į reguliavimo geną iclR. 269 ​​padėtyje, o tai lemia jo koduojamo acetato operono IclR represoriaus baltymo inaktyvavimą ir yra konstitucinės fermento izocitrato liazės sintezės priežastis pagrindinio porūšio padermėse. Smulkių porūšių štamai turi nepažeistą iclR geną ir negali konstitucinės izocitrato liazės sintezės.

Įrodyta, kad pagrindinių porūšių Y. pestis padermių melibiozės fermentacijos nebuvimą lemia įterpimo sekos IS285 įvedimas į melB geną, kuris koduoja galaktozido permeazės fermentą. Neesminių porūšių padermėse IS285 įterpimo į melB geną nėra.

Pirmą kartą buvo nustatytas Kaukazo porūšio padermių auksotrofijos genetinis pagrindas, susijęs su IS100 įterpimo sekų įvedimu į argA ir aroF genus, 10 bp intarpu. į aroG geną, timino nukleotido įterpimas į thiH geną ir 13 bp delecija. thiG gene.

Pagrindinio ir šalutinio porūšio Y. pestis padermių molekulinės charakteristikos genais, koduojančiais biochemines charakteristikas, kuriomis grindžiamas skirstymas į porūšius ir biovarus, sudaro pagrindą sukurti genetinę maro sukėlėjo intraspecifinio klasifikavimo schemą.

Remiantis darbo rezultatais, paraiškos išradimui „Maro sukėlėjų padermių porūšių nustatymo sekvenavimo būdu metodas“ (Nr. 2009116913. Prioritetas 2009 m. gegužės 14 d. Gautas sprendimas išduoti patentą) ir „Metodas Yersinia pestis padermių porūšių diferenciacija naudojant daugialokių sekos tipavimą (Nr. 2009146094) 2009-12-11.

Praktinė reikšmė dirbti. Remiantis darbo rezultatais, buvo parengtos ir patvirtintos metodinės rekomendacijos: „Maro sukėlėjo padermių porūšių nustatymas remiantis rhaS ir araC genų, kontroliuojančių ramnozės ir arabinozės fermentaciją, sekos nustatymu“ (patvirtintas direktoriaus 2009 m. birželio 16 d. RosNIPCI „Mikrobas“ protokolas Nr. 6) ir „Yersinia pestis porūšių padermių nustatymas naudojant daugialokių sekos tipavimą (patvirtintas RosNIPCI „Microbe“ direktoriaus). 2010 m. vasario 23 d. protokolas Nr. .

Trys padermės buvo deponuotos Valstybinėje patogeninių bakterijų kolekcijoje: Y. pestis KM 910 iš Altajaus, KM 596 iš Gissar ir KM 1861 iš Ulegei kaip etaloninės šių porūšių padermės.

Tyrimo metu gauti duomenys apie Y. pestis padermių genetinę organizaciją naudojami skaitant paskaitas tema „Maro sukėlėjo genetika“ RosNIPCI „Mikrobas“ specializacijos ir kvalifikacijos kėlimo kursuose.

Nuostatos gynybai:

1. Rusijos Federacijos ir kaimyninių šalių gamtiniuose židiniuose cirkuliuojančios pagrindinių porūšių maro sukėlėjo padermės priklauso senovės ir viduramžių biovarams, tai rodo išsamios šių padermių mikrobiologinių, biocheminių ir genetinių savybių analizės duomenys.

2. Skirtingų biocheminių savybių apraiškų, naudojamų skirstant Y. pestis padermes į porūšius ir biovarus, pagrindas yra skirtingų tipų genų, koduojančių šias savybes, mutacijos. Nesugebėjimas sumažinti nitratų pagrindinių viduramžių biovaro porūšių padermių yra susijęs su nesąmoninga mutacija (G T) periplazminės nitratų reduktazės geno napA, o Altajaus ir Gissaro porūšių padermėse - su vieno nukleotido įterpimas į periplazminio transportinio baltymo SsuA ssuA geną. Arabinozės fermentacijos nebuvimas Altajaus ir Gissaro porūšių padermėse yra dėl to, kad į araC geno seką įterptas guanino nukleotidas.

3. Skirtingą maro sukėlėjo pagrindinio ir smulkaus porūšio padermių biocheminį aktyvumą pagal daugybę skirtingų charakteristikų lemia juos koduojančių genų redukcija pagrindiniame porūšyje ir jų nepažeistumas mažame porūšyje.

Pagrindinių porūšių padermių melibiozės fermentacijos nebuvimas yra susijęs su IS285 patekimu į melB galaktozido permeazės geną, o konstitucinė izocitrato liazės sintezė šio porūšio padermėse vyksta dėl dviejų nukleotidų (CC) įterpimo į iclR reguliuojančio geno seka. Mažų porūšių padermėse yra nepažeistų melB ir iclR genų.

4. Kaukazo porūšio Y. pestis padermių daugialypių mitybos poreikių priežastis yra daugelio aminorūgščių ir vitaminų biosintezės genų inaktyvavimas. Šio porūšio padermių priklausomybę nuo arginino sukelia IS įterpimas į argA geną fenilalaninui, tai sukelia 10 bp įterpimas. aroG gene, tirozinui - įvedant IS100 į aroF geną, tiaminui (B1) delecija 13 bp. - į thiG geną ir vieno nukleotido įterpimas į thiH. Remiantis visu Kaukazo ir kitų porūšių padermių nustatytų mutacijų, taip pat maro sukėlėjo biovarų kompleksu, buvo nustatyti būdingi genotipai, pagal kuriuos galima sukurti genetinę Y. pestis intraspecifinės klasifikacijos schemą.

Darbo aprobavimas. Disertacijos medžiaga pristatyta ir aptarta IX tarpvalstybinėje NVS valstybių narių mokslinėje ir praktinėje konferencijoje „Šiuolaikinės technologijos įgyvendinant pasaulinę kovos su infekcinėmis ligomis strategiją Nepriklausomų Valstybių Sandraugos valstybių narių teritorijoje“, Volgogradas. , 2008; VI tarptautinė konferencija „Molecular Diagnostics and Biosafety“, M., 2009; 2010 m. gegužės 25 – 27 d. mokslinė praktinė mokyklinė jaunųjų mokslininkų ir Federalinės vartotojų teisių apsaugos ir žmogaus gerovės priežiūros tarnybos specialistų konferencija „Šiuolaikinės biologinės saugos užtikrinimo technologijos“; kasmetinėse baigiamose RosNIPCI „Microbe“ konferencijose, Saratovas 2008–2010 m.

Disertacijos struktūra ir apimtis. Disertacija pateikiama 157 puslapių spausdinimo mašinėle, susideda iš įvado, literatūros apžvalgos skyriaus, penkių savo tyrimo skyrių, išvados ir išvadų. Darbas iliustruotas 11 lentelių ir 34 brėžiniais. Bibliografinėje rodyklėje yra 203 šalies ir užsienio šaltiniai.

PAGRINDINIS DARBO TURINYS

1.3.2569-09 „Laboratorijų, naudojančių nukleorūgščių amplifikacijos metodus dirbant su medžiaga, turinčia I – IV patogeniškumo grupių mikroorganizmų, darbo organizavimas“. PGR būdu gautų produktų analizė atlikta 0,8 – 2 % agarozės gelyje pagal T. Maniatis ir kt. rekomendacijas. . Genų nukleotidų sekos buvo nustatytos genetiniu analizatoriumi „CEQ 8000“ (Beckman Coulter) pagal F. Sanger metodą. Lyginamoji Y. pestis ir Y. pseudotuberculosis genomų ir metabolinių kelių augimo faktorių biosintezei analizė atlikta naudojant NCBI GenBank ir KEGG Metabolic Pathways duomenų bazių BLAST algoritmą. Filogenetinė padermių analizė atlikta naudojant Mega 4.0, PHYLIP ir SplitsTree4 programas bei distancijos matricos metodus: UPGMA, FITCH, Kitch, Neighbor-Joining, Minimum Evolution.

TYRIMO REZULTATAI

Tiriant Y. pestis padermes skirstant į biovarius naudotas biochemines charakteristikas – nitratų redukciją, arabinozės ir glicerolio fermentaciją, nustatytas šių savybių heterogeniškumas pagrindinio ir smulkaus porūšio padermėse. Kai kurios Rusijos Federacijoje ir kaimyninėse šalyse išskirtos pagrindinių porūšių padermės nitratų nesumažino, o tai rodo, kad jos priklausė viduramžių biovarui. Smulkių porūšių padermės – Altajaus, Gissaro ir Ulegei – taip pat nesumažino nitratų, o kaukazietiškos padermės šiai savybei buvo teigiamos.

Pagal antrąjį diferencialinį požymį – arabinozės fermentaciją, visos darbe tirtos pagrindinės, Kaukazo ir Ulega porūšių Y. pestis padermės buvo vienarūšės ir naudojo šį monosacharidą. Altajaus ir Gissaro porūšių padermės nefermentavo arabinozės, o skirtingos šio požymio raiškos genetinis pagrindas liko nežinomas.

Gebėjimo fermentuoti glicerolį trūkumas (kitas diferencinis biocheminis požymis) yra būdingas biovaro orientalis štamų požymis. Tačiau Rusijos Federacijoje ir kaimyninėse šalyse židinių su nuolatine tokių padermių cirkuliacija nenustatyta. Literatūroje yra tik pavienių pranešimų apie izoliuotų glicerino neigiamų Y. pestis padermių išskyrimą šiose teritorijose [Sagymbek ir kt., 2003; Onishchenko ir kt., 2004].

Būdingas biovar orientalis padermių genetinis požymis yra 93 bp delecija. glpD gene – glicerol-3-fosfato dehidrogenazė.

Mes nustatėme, kad visos Y. pestis padermės iš natūralių maro židinių Rusijos Federacijoje ir kaimyninėse šalyse neturėjo rytietiškam biovarui būdingos 93 bp delecijos glpD gene, o tai patvirtina, kad tarp jų nėra orientalis biovaro padermių (1 pav. ). Tokios padermės buvo aptiktos tik tarp užsienio šalyse gautų izoliatų.

1 pav. Y. pestis padermių PGR analizė su glpD geno pradmenimis: 1 – 16 – pagrindinių porūšių padermių iš natūralių maro židinių Rusijos Federacijoje ir kaimyninėse šalyse; 17 – 19 – rytinio biovaro padermės iš užsienio šalių; 20 – neigiama kontrolė.

Rodyklės rodo suformuotų stiprintuvų dydžius.

Taigi mūsų tirtos Y. pestis padermės, išskirtos Rusijos Federacijos ir kaimyninių šalių teritorijoje, pagal biocheminių savybių kompleksą (glicerolio fermentacija, nitratų redukcija) priklauso senovės ir viduramžių biovarams, kas koreliuoja su visuotinai priimta nuomone. kad šių biovarų atmainos apsiriboja žemyniniais maro židiniais, o rytinio biovaro padermės – žiurkės tipo židiniais, išsidėsčiusiais palei vandenyno pakrantes.

Šio darbo metu daug dėmesio buvo skirta Kaukazo porūšio maro sukėlėjo padermių tyrimams, nes, pasak daugelio tyrinėtojų [Bobrov, Filippov, 1997], jos yra seniausios iš išlikusių maro atmainų. patogeną ir yra arčiausiai jo pirmtako Y.

pseudotuberkuliozė. Pagal biochemines savybes šio porūšio padermės pasirodė esančios aktyviausios tarp visų Y. pestis porūšių. Jie turėjo nitratų kiekį mažinantį aktyvumą ir fermentavo glicerolį, arabinozę, ramnozę ir melibiozę. Kadangi literatūroje buvo prieštaringų duomenų apie šio porūšio padermių mitybos poreikius [Martinevsky, 1969; Aparin, Golubinsky, 1989], atlikome tyrimus, siekdami išsiaiškinti Kaukazo porūšio padermių mitybos poreikius.

Nustatyta, kad visos tirtos Kaukazo porūšio padermės elgėsi gana vienodai. Jie nustatė aminorūgščių – fenilalanino, tirozino, arginino ir vitamino B1 (tiamino) poreikį. Be šių augimo faktorių reikalavimų, Rytų Kaukazo aukštųjų kalnų maro židinio atmainos taip pat parodė priklausomybę nuo leucino, o kaukazietiškų porūšių iš Leninakan, Prisevan, Zangezur-Karabachh ir Araksin natūralių židinių neturėjo. tokia priklausomybė.

Kadangi Kaukazo porūšio padermių auksotrofijos priežastys aminorūgštims ir vitaminui B1 (tiaminui) nėra žinomos, vėliau atlikome šio porūšio padermių auksotrofijos genetinio pagrindo tyrimą.

2. Genų, koduojančių biochemines charakteristikas, naudojamų maro sukėlėjo biovarams diferencijuoti, struktūrinės ir funkcinės struktūros nustatymas Gebėjimo redukuoti nitratus nebuvimas yra būdingas viduramžių biovaro Y. pestis padermių bruožas, išskiriantis jas nuo padermių. senovės ir rytų biovarų. Rusijos Federacijoje ir kaimyninėse šalyse natūraliuose židiniuose cirkuliuojančios smulkių maro mikrobo porūšių padermės taip pat skiriasi savo denitrifikaciniu aktyvumu. Tačiau genetinės priežastys, lėmusios skirtingus šio bruožo pasireiškimus juose, lieka nežinomos.

Remiantis lyginamąja kompiuterine Y genomų analize.

pestis ir Y. pseudotuberculosis, pateiktus NCBI GenBank duomenų bazėje, buvo nustatyta, kad nitratų redukcijoje dalyvaujantys genai yra sujungti į identiškos struktūros nap operoną, susidedantį iš šešių genų: napA-F ir napP (2 pav.). .

Buvo tiriami ir kiti genai, dalyvaujantys redukuojant nitratus: narP ir ssuA, koduojantys atitinkamai reguliuojantį baltymą NarP ir transportinį baltymą SsuA 2 pav. Nap operono struktūra Y. pestis padermėse Kompiuterinės analizės rezultatas nap operono genai, vieno nukleotido pakaitalai visuose šio operono genuose, tačiau reikšmingiausias buvo G T nukleotido pakeitimas 613 padėtyje nuo napA geno, periplazminės nitratų reduktazės, kuri anksčiau buvo nustatyta Y. pestis KIM ir kitos medievalis biovaro padermės. Remiantis kompiuterine analize, naudojant MEGA 4.0 programą, buvo nustatyta, kad ši mutacija lemia GAA TAA tripleto, kuris yra stop kodonas ir sukelia priešlaikinį polipeptidinės grandinės transliacijos nutraukimą (po 204 aminorūgščių liekanos) pasikeitimą. šio fermento molekulė.

Mes nustatėme dar vieną mutaciją, reikšmingą denitrifikacinio aktyvumo pasireiškimui chromosomų geno ssuA (geno dydis – 1123 bp), kurioje buvo timino nukleotido įterpimas 302 padėtyje mikrotuso biovaro (NCBI GenBank) 91001 padermėje. Remiantis kompiuterine analize, naudojant programą Mega 4.0, ši mutacija lemia skaitymo rėmo poslinkį ir SsuA baltymo struktūros sutrikimą.

Kintamoms napA ir ssuA genų sritims buvo sukurti pradmenys, kurių pagalba PGR buvo amplifikuoti šių genų fragmentai ir vėliau nustatyta jų nukleotidų seka. Skirtingo Y. pestis padermių denitrifikacinio aktyvumo priežastims nustatyti ištyrėme 90 pagrindinio ir smulkaus porūšio Y. pestis padermių iš įvairių natūralių maro židinių, taip pat 10 įvairios kilmės Y. pseudotuberculosis padermių. Atlikus analizę buvo nustatyta, kad pagrindinių Rusijos Federacijoje ir kaimyninėse šalyse išskirtų porūšių padermės, negalinčios redukuoti nitratų, 613 padėtyje turėjo vieną nukleotidų pakaitalą G T, būdingą biovaro medievalis padermėms, o tai lemia periplazminės nitrato reduktazės molekulės kodono pasikeitimas (GAA TAA) ir priešlaikinis transliacijos polipeptidinės grandinės nutraukimas. Būdingas nukleotidų pakaitalas 613 padėtyje, kuris yra medievalis biovaro genetinis ženklas, kai kuriose ištirtų pagrindinių porūšių padermių, taip pat jų denitrifikacinio aktyvumo stoka, yra pagrindas jas klasifikuoti kaip viduramžius. biovar.

Tuo pačiu metu Altajaus ir Gissaro porūšių, kurie taip pat negali sumažinti nitratų, napA geno mutacijos neaptikome. Nustatyta, kad šių padermių denitrifikacinio aktyvumo stokos priežastis yra kita mutacija, kurią sukelia timino nukleotido įterpimas į periplazminio transportinio baltymo SsuA geno ssuA 302 padėtį. Ši mutacija nustatyta ne tik Altajaus ir Gissaro porūšių padermėse, bet ir 91001 mikrobų biovaro padermėje, kuri taip pat negali sumažinti nitratų.

Kita svarbi biocheminė savybė, naudojama maro patogenų padermių vidiniam diferencijavimui, yra arabinozės fermentacija. Šį angliavandenį gali panaudoti visos pagrindinės, Kaukazo ir Ulega porūšių padermės, o Altajaus ir Gissaro porūšių padermės, taip pat mikrotijos biovaro padermės – ne. Tačiau genetinės priežastys, kodėl šis bruožas nepasireiškia maro sukėlėjo Altajaus ir Gissaro porūšių padermėse, lieka nežinomos.

Remiantis lyginamąja kompiuterine Y. pestis ir Y. genomų analize.

pseudotuberculosis (NCBI GenBank) buvo nustatyta, kad visose maro ir pseudotuberkuliozės mikrobų atmainose arabinozės operonas turi identišką struktūrą ir susideda iš šešių genų. Jį sudaro penki struktūriniai – araA, araB, araH, araF, araG ir vienas reguliavimo genas araC (3 pav.).

3 pav. Y. pestis arabinozės operono struktūra Lyginamosios kompiuterinės arabinozės operono genų, taip pat Y. pestis ir Y. pseudotuberculosis padermių araD geno (NCBI GenBank) genų analizės rezultatas. nustatyta, kad buvo reikšminga reguliacinio geno araC mutacija, kurioje buvo delecija 112 bp. (26 – 137) ir guanino įterpimas 773 padėtyje mikrotuso biovaro padermėje 91001, kaip anksčiau nustatė D. Zhou ir kt. .

Dvi persidengiančios pradmenų poros, besiribojančios su visa šio geno nukleotidų seka, buvo sukurtos kintamoms araC geno sritims, o jo amplifikacijos buvo gautos PGR.

Atlikus visos araC geno sekos seką natūraliose Y. pestis padermėse ir 10 Y. pseudotuberculosis padermių, nustatyta, kad tik Altajaus ir Gissaro porūšių padermės turėjo araC geno mutaciją, kuri buvo susijusi. su guanino nukleotido įterpimu 773 padėtyse, tuo tarpu kaip ir kitų porūšių padermės bei pseudotuberkuliozės mikrobų padermės turėjo nepažeistą šio geno struktūrą. Ištirtų Y. pestis padermių, išskirtų Rusijos Federacijoje ir kaimyninėse šalyse, 112 bp delecijos, būdingos microtus biovaro padermėms, buvimas nebuvo aptiktas.

Taigi, pirmą kartą nustatėme, kad nesugebėjimas panaudoti arabinozės Altajaus ir Gissaro porūšių padermėse yra susijęs su vieno nukleotido įterpimu į araC geną.

3. Genų, koduojančių skirtingas charakteristikas, pakitimų, naudojamų skirstant maro sukėlėją į pagrindinį ir šalutinį porūšį, identifikavimas.

pseudotuberkuliozė turi fermentinį aktyvumą disacharido melibiozės atžvilgiu. Gebėjimas panaudoti melibiozę taip pat buvo nustatytas Y. pestis biovar microtus padermėse. Priešingai, visos labai virulentiškos pagrindinių porūšių Y. pestis padermės nefermentuoja melibiozės. Genetinės priežastys, kodėl jiems trūksta šio biocheminio aktyvumo, lieka nežinomos.

Remdamiesi lyginamąja kompiuterine Y. pestis ir Y. pseudotuberculosis padermių genomų analize, pateikta NCBI GenBank duomenų bazėje, nustatėme, kad maro ir pseudotuberculosis sukėlėjų melibiozės operonas turi identišką struktūrą ir yra vaizduojamas trimis. genai – melA (YP_1469), melB (YP_1470) ir melR (YP_1471) (4 pav.).

Atlikus šių genų sandaros analizę, nustatyta, kad struktūriniame gene melB, koduojančiame transportinį baltymą MelB – galaktozido permeazę, yra tiriamos savybės pasireiškimui svarbi mutacija. Šio geno nukleotidų sekoje pagrindinių porūšių padermių - CO92, KIM, Antiqua ir Nepal516 (NCBI GenBank) - buvo aptiktas įterpimo sekos - IS285 įterpimas po 73 nukleotidų. Priešingai, Y. pestis Pestoides F padermė (Kaukazo porūšis) ir visos Y. pseudotuberculosis padermės turi nepažeistą melB geno struktūrą.

Pora pradmenų, besiribojančių su IS285 įterpimo sritimi, buvo sukurta melB geno kintamoms sritims, o šio geno fragmentas buvo amplifikuotas PGR. Visų darbe naudojamų pagrindinių porūšių Y. pestis padermių (51 padermė) naudojant šią pradmenų porą gautos amplifikacijos buvo 1648 bp dydžio, o tai rodė IS285 (1324 bp) patekimą į melB genų seką m. šios padermės ir koreliavo su jų fermentinio aktyvumo prieš melibiozę stoka. Skirtingai nuo pagrindinių porūšių, PGR atskleidė mažesnio dydžio (325 bp) stiprintuvus nepagrindinio potipio padermėse, o tai parodė nepažeistą melB geno struktūrą ir atitiko jų gebėjimą fermentuoti šį disacharidą (5 pav.).

Taigi nustatėme, kad pagrindinės porūšio Y. pestis padermių nesugebėjimo fermentuoti melibiozę priežastis yra melB geno struktūros pažeidimas, sukeltas IS285 įterpimo. Smulkių porūšių padermėse yra nepažeistas melB genas.

Norint atskirti pagrindinio maro sukėlėjo porūšio padermes nuo smulkių porūšių ir pseudotuberkuliozės mikrobų padermių, taip pat naudojamas pirmųjų gebėjimas konstitutyviai sintetinti fermentą izocitrato liazę.

5 pav. MelB geno PGR analizė patogeno padermėse: 1 – 3 – Kaukazo porūšiai;

4 – 5 gisarų porūšiai; 6 – 7 – Altajaus porūšis; 8 – Ulegai porūšis; 9 – 17 – pagrindinis porūšis; 18 – neigiama kontrolė. Kairėje yra X174 / HincII molekulinės masės žymenys.

Įrodyta, kad nepagrindinių porūšių Y. pseudotuberculosis ir Y. pestis padermės, priešingai nei pagrindinio porūšio padermės, nepajėgios konstitucinės šio fermento sintezės. Tačiau genetinės šio požymio raiškos skirtumų pagrindinio ir nepagrindinio porūšio padermėse priežastys šiuo metu nežinomos.

Atlikus NCBI GenBank duomenų bazėje pateiktų padermių maro ir pseudotuberkuliozės sukėlėjo genomų analizę, nustatyta, kad acetato operono struktūra visose maro sukėlėjo padermėse yra identiška ir apima tris struktūrinius genus. - aceA, aceB, aceK, kurie yra neigiamai reguliuojami geno iclR (6 pav.).

6 pav. Acetato operono struktūra Y. pestis padermuose Lyginamoji kompiuterinė acetato operono genų analizė parodė, kad reguliuojančio geno iclR (843 bp) mutacija yra reikšminga tiriamos savybės fenotipiniam pasireiškimui. . Nustatyta, kad Y. pestis padermėse CO92, KIM, Antiqua, Nepal516 (pagrindinis porūšis) iclR genas buvo inaktyvuotas įterpus du nukleotidus (+CC) 269-270 padėtyse nuo geno pradžios, ir jos dydis šiose padermėse buvo 845 bp. Įterpimas (+CC), kurį nustatėme 269–270 iclR geno padėtyse, lemia priešlaikinį IclR represoriaus baltymo polipeptidinės grandinės transliacijos nutraukimą, o tai reiškia konstitucinę acetato operono genų ekspresiją ir dėl to aukštas izocitrato liazės sintezės lygis.

iclR geno kintamajai sričiai buvo sukurta pradmenų pora, kurios pagalba buvo ištirta šio geno struktūra 95 natūraliose Y padermėse.

pestis pagrindinio ir šalutinio porūšio bei 10 pseudotuberkuliozės sukėlėjo padermių. Nustatyta, kad iclR geno fragmentų nukleotidų sekos visuose kaukazo, Altajaus, Gissar ir Ulega porūšių Y. pestis padermėse yra identiškos, siekia 370 bp. ir visiškai atitinka panašią pseudotuberkuliozės mikrobų padermių seką, taip pat Pestoides F padermę (NCBI GenBank), kuri rodo iclR geno sekvenuotos srities nepažeistumą ir koreliuoja su mažu juose esančio izocitrato liazės fermento aktyvumu. Skirtingas vaizdas buvo rastas pagrindinių maro sukėlėjo porūšių padermių. iclR gene buvo nustatytas intarpas – dviejų nukleotidų (+CC) įterpimas 269–270 padėtyse, dėl kurio pasikeičia iclR reguliavimo geno skaitymo rėmas ir dėl to vyksta konstitucinė izocitrato liazės fermentas pagrindinio porūšio Y. pestis padermėse.

4. Kaukazo porūšio Y. pestis padermių auksotrofijos genetinio pagrindo nustatymas Kaip jau minėjome aukščiau, visoms Kaukazo porūšio padermėms augti reikia aminorūgščių: arginino, tirozino, fenilalanio ir vitamino B1 – tiamino. Tačiau Y. pestis ssp.caucasica padermių auksotrofijos genetinės priežastys dar nėra ištirtos.

Pirmajame etape atlikome KEGG Metabolic Pathways duomenų bazėje pateiktų Y. pestis ir Y. pseudotuberculosis padermių arginino, tirozino, fenilalano ir vitamino B1 (tiamino) biosintezės kelio kompiuterinę analizę ir nustatėme pagrindinius fermentus. šių augimo faktorių biosintezę ir juos koduojančius genus. Naudojant BLAST algoritmą, atlikta arginino, tirozino, fenilalano ir vitamino B1 (tiamino) biosintezės genų nukleotidų sekų lyginamoji analizė Y. pestis ir Y. pseudotuberculosis padermėse (NCBI GenBank). Remiantis kompiuterinės analizės rezultatais, mutacija, kurią aptikome Pestoides F kamiene N acetilglutamato sintazės struktūriniame gene - argA, kuris buvo įterpimo sekos IS100 intarpas po 196-ojo nukleotido nuo geno pradžios, pasisuko. būti reikšmingas priklausomybės nuo arginino pasireiškimui.

Atliekant PGR analizę, naudojant IS100 įvedimo greta pradmenų porą, nustatyta, kad sugeneruoto argA geno fragmento dydis visose pagrindinio, Altajaus ir Ulega porūšių maro sukėlėjo padermėse, taip pat pseudotuberkuliozės atveju, buvo 215 bp, o tai atitiko nepažeistą geno struktūrą. Kaukazo porūšio Y. pestis padermių argA geno fragmentai turėjo didelę molekulinę masę (2143 bp), nes buvo įterptas IS100, dėl kurio genas buvo inaktyvuotas.

Aromatinių aminorūgščių biosintezėje dalyvaujančių genų analizė parodė, kad aroG genas (1053 bp), koduojantis DAGPS izofermentą (3-deoksi-darabinoheptulozonato-7-fosfato sintazę), Pestoides F padermėje yra inaktyvuojamas įterpus 10 nukleotidų (820 – 829 pozicijose), dėl ko pasikeičia skaitymo rėmas ir sutrinka fenilalanino sintezė.

Sekvenuojant aroG fragmentą 95 natūraliuose pagrindinio ir šalutinio porūšio kamienuose, nustatyta, kad pagrindinio, Altajaus, Gissaro ir Ulegey porūšio maro mikrobo padermėse šis genas turi nepažeistą struktūrą ir koduoja funkciškai aktyvų baltymą DAGPS. -. Priešingai, kaukazietiško Y. pestis porūšio padermėse rastas 10 bp intarpas aroG gene. 820–829 padėtyse, dėl ko pasikeičia skaitymo rėmas ir sutrinka fermento struktūra.

Šios mutacijos buvimas visose Kaukazo porūšių padermėse koreliavo su jų nesugebėjimu sintetinti fenilalanino.

Kitas struktūrinis genas aroF (1071 bp), koduojantis DAGPSTyr izofermentą, Pestoides F padermėje yra inaktyvuojamas po 888 nukleotidų nuo geno pradžios įvedus įterpimo seką IS100, dėl to prarandamas gebėjimas sintetinti tiroziną. Atliekant PGR analizę, pagrindinių, Altajaus, Gissaro ir Ulegei porūšių padermės pagamino 563 bp dydžio aroF geno stiprintuvus, kurie atitiko nepažeistą geno struktūrą. Kaukazo porūšio padermėse specifinė aroF geno amplifikacija nebuvo suformuota atliekant PGR, o tai rodė jo fragmento praradimą įvedus įterpimo seką IS100 ir koreliavo su tirozino auksotrofija vitamino B (tiamino) biosintezė parodė, kad yra reikšmingų mutacijų genuose, koduojančiuose fermentą tiazolo sintazę – thiG ir thiH, kurie Pestoides F padermėje inaktyvuojami 13 bp delecija.

384 – 396 padėtyse ir timino nukleotido (+T) įterpimas 552 padėtyje.

Mūsų atliktas thiG ir thiH fragmentų sekvenavimas natūraliose Y. pestis padermėse atskleidė nepažeistą šių genų struktūrą pagrindinių, Altajaus, Gissar ir Ulegei porūšių padermėse, kurios koreliavo su jų gebėjimu sintetinti vitaminą B1. Skirtingai nuo kitų porūšių, Kaukazo porūšių padermėse buvo įterptas timino nukleotidas 552 thiH geno padėtyje ir 13 bp delecija. thiG geno 384–396 padėtyse, o tai sutapo su jų nesugebėjimu sintetinti tiamino.

Taigi pirmą kartą nustatėme Kaukazo porūšio Y. pestis padermių auksotrofijos genetinį pagrindą. Nustatyta, kad auksotrofiją argininui sukelia IS100 patekimas į argA geną, fenilalaninui - nukleotidų įterpimas į aroG, tirozinui - IS100 įterpimas į aroF, vitamino B1 - 13 bp delecija. thiG ir įterpus timino nukleotidą į thiH. Tokios mutacijos nevyksta kitų porūšių Y. pestis padermėse (pagrindiniame, Altajaus, Gissaro ir Ulegei), todėl gali būti naudojamos kaip būdingi kaukazietiškų padermių genetiniai ženklai.

5. Perspektyvų panaudoti gautus duomenis kuriant maro sukėlėjo intraspecifinės klasifikacijos schemą įvertinimas Atlikdami savo tyrimus, nustatėme genetinį pagrindą skirtingam Y. pestis dalijimosi biocheminių charakteristikų raiškai. padermes į porūšius ir biovarus. Šio darbo metu nustatytas napA, ssuA, araC, melB, iclR, argA, aroH, aroF, thiH ir thiG genų kintamumas, taip pat anksčiau nustatytas glpD geno kintamumas, taip pat rhaS reguliuojančio geno kintamumas. ramnozės operono [Kukleva ir kt., 2008] gali būti naudojamas kaip genetinės schemos, skirtos klasifikuoti maro patogenų padermes į biovarus ir porūšius, pagrindu. Remiantis lyginamąja šių genų sekų analize, nustatėme būdingus Y. pestis porūšių (senovės, viduramžių, rytietiškų biovarų) ir smulkiųjų porūšių genetinius ypatumus (lentelė). Skirtingus biocheminius požymius koduojančių genų nukleotidų sekų kintamumą, taip pat įvairių augimo faktorių biosintezę panaudojome Y. pestis padermių evoliuciniams ryšiams nustatyti ir filogenetinių medžių konstravimui naudojant kompiuterines programas Mega 4.0, PHYLIP, SplitsTree 4. metodai: UPGMA , FitchMargulis svertiniai vidutiniai kvadratai, Kitch, Neighbor-Joining.

Lentelė. Pagrindinio ir smulkaus porūšio Y. pestis padermių genetinės charakteristikos iš Rusijos Federacijos ir kaimyninių šalių gamtinių židinių.

Pagrindinis p/v Kaip matyti iš 7 paveikslo, pasirinktų DNR taikinių naudojimas leidžia visiškai diferencijuoti maro ir pseudotuberkuliozės sukėlėjų padermes, taip pat Y. pestis padermių intraspecifinį padalijimą ne tik į biovarus ir į pagrindinius bei smulkius porūšius, bet ir į atskirus šio patogeno porūšius.

Filogenetinių duomenų analizė patvirtina anksčiau išsakytą prielaidą, kad seniausia maro mikrobo evoliucijos atšaka yra Kaukazo porūšio padermės, turinčios didžiausią genetinį panašumą į savo pirmtaką pseudotuberkuliozės mikrobą (8 pav.).

Kiti smulkūs porūšiai – Altajus, Gissaras ir Ulega yra filogenetiškai arti vienas kito ir sudaro dar vieną senovės Y. pestis evoliucijos atšaką.

Mūsų duomenys rodo, kad microtus padermės, kurias Kinijos mokslininkai neseniai pasiūlė identifikuoti kaip atskirą biovarą, priklauso Altajaus ir Gissaro porūšių štamų grupei ir yra jų įvairovė.

7 pav. Pagrindinių (senovės, viduramžių, rytų biovarų) ir mažųjų (Kaukazo, Altajaus, Gissaro, Ulegey) porūšių Y. pestis padermių dendrogramos (Mega 4.0 programa, metodai: A - UPGMA ir B -Neighbor Joining), kaip taip pat Y. pseudotuberculosis padermių.

8 pav. Y. pestis intraspecifinės evoliucijos schema Šiame darbe atlikti tyrimai sudaro pagrindą sukurti maro sukėlėjo molekulinę taksonomiją, kurios tikslas – sukurti pilną tarprūšinę Y. pestis taksonomiją, pagrįstą genų kintamumas skirtingai reikšmingoms mikrobiologinėms ir biocheminėms maro mikrobo savybėms.

IŠVADOS

2. Diferencinio biocheminio požymio - nitratų mažinimo pagrindinių porūšių Y. pestis padermių, išskirtų natūraliuose maro židiniuose Rusijoje ir kaimyninėse šalyse, išraiškos priežastis yra mutacijos buvimas - vieno nukleotido pakeitimas. periplazminės nitratų reduktazės napA gene, o Altajaus ir Gissaro porūšių padermėse – vieno nukleotido intarpai į periplazminio transportinio baltymo ssuA geną.

3. Pirmą kartą nustatytas skirtingos melibiozės fermentacijos požymių raiškos ir izocitrato liazės gamybos genetinis pagrindas maro mikrobo pagrindinio ir šalutinio porūšio padermėse. Buvo įrodyta, kad pagrindinių porūšių padermių nesugebėjimas fermentuoti disacharido melibiozės atsiranda dėl IS285 įterpimo į melB struktūrinio geno seką, koduojančią galaktozido permeazę. Nustatyta, kad pagrindiniam maro mikrobo porūšiui būdingą izocitrato liazės konstitucinę sintezę sukelia dviejų nukleotidų (+CC) įterpimas į iclR represoriaus geno 269 – 270 pozicijas.

4. Altajaus ir Gissaro porūšių Y. pestis padermių arabinoneigiamumo priežastis yra arabinozės operono - araC reguliuojančio geno mutacija, kurią sukelia vieno guanino nukleotido įterpimas šio geno 773 padėtyje. .

5. Pirmą kartą nustatytas Kaukazo porūšio Y. pestis padermių auksotrofijos genetinis pagrindas. Nustatyta, kad auksotrofiją argininui sukelia IS100 patekimas į argA geną, o fenilalaninui – įterpus 10 r.n. aroG, tirozinui – į aro F įterpiant IS100, vitaminui B1 – 13 bp delecija thiG ir timino įterpimu į thiH.

6. Nustatyti maro sukėlėjo pagrindinio (senovės, viduramžių, rytietiškų biovarų) ir smulkiųjų porūšių būdingi genotipai, kurių panaudojimas leidžia Y. pestis intraspecifiškai diferencijuoti. Pateikiamos perspektyvos panaudoti gautus rezultatus kuriant genetinę Y. pestis padermių intraspecifinio klasifikavimo schemą.

SĄRAŠAS DISERTACIJOS MEDŽIAGOS PAGRINDAS SKELBTI DARBAI

2. Odinokovas G.N., Eroshenko G.A., Vidyayeva N.A., Krasnov Ya.M., Guseva N.P., Kutyrevas V.V. Skirtingų porūšių Yersinia pestis nap operono genų struktūrinė ir funkcinė analizė // Ypač pavojingų inf. – 2008. – Laida. 4 (98). – P. 12 – 16.

3. Eroshenko G.A., Kukleva L.M., Vidyayeva N.A., Odinokov G.N., Shavina N.Yu., Kutyrev V.V. Mažųjų maro patogeno porūšių genetinės charakteristikos // Šiuolaikinės technologijos įgyvendinant pasaulinę kovos su infekcinėmis ligomis strategiją Nepriklausomų Valstybių Sandraugos valstybių narių teritorijoje. IX tarpvalstybinės NVS valstybių narių mokslinės ir praktinės konferencijos medžiaga. – Volgogradas, 2008. – P. 71 – 73.

4. Eroshenko G.A., Vidyayeva N.A., Odinokov G.N., Kukleva L.M., Krasnov Ya.M., Guseva N.M., Kutyrev V.V. Įvairios kilmės Yersinia pestis padermių araC geno struktūrinė ir funkcinė analizė // Molekul. genetika, mikrobiolas. ir virusolis. – 2009. – Nr.3. – P. 36 – 40.

5. Kukleva L.M., Odinokov G.N., Eroshenko G.A., Kutyrev V.V. Pagrindinio ir šalutinio porūšio Yersinia pestis padermių diferenciacija pagal rhaS ir araC genų kintamumą // VI tarptautinės konferencijos „Molecular Diagnostics and Biosafety“ medžiagų rinkinys. M., 2009. – P. 124.

6. Eroshenko G.A., Odinokov G.N., Kukleva L.M., Shavina N.Yu., Krasnov Ya.M., Guseva N.P., Kutyrev V.V. Kintamieji napA, aspA, rhaS, zwf ir tcaB genų lokusai kaip veiksmingi DNR taikiniai Yersinia pestis padermių genotipams nustatyti // Ypač pavojingų inf. – 2010. – Laida. 2 (104). – P. 57 – 59.

7. Odinokovas G.N., Eroshenko G.A. Pagrindinio ir smulkaus porūšio Yersinia pestis padermių biocheminės diferenciacijos genetinės ypatybės // Mat.

mokslinis – praktinis mokykla – konf. jaunieji mokslininkai ir specialistai Fed. vartotojų teisių apsaugos ir žmogaus gerovės srities priežiūros tarnyba „Šiuolaikinės biologinės saugos užtikrinimo technologijos“, 2010 m. gegužės 25 – 27 d., 289 – 291 p.

Formatas 60 x 84 1/16 Lazerinis spausdinimas Biuro popierius Spausdintas ant federalinės valstybinės institucijos RosNIPCHI "Mikrobas" fizinių ir matematikos mokslų spausdinimo įrangos Saratovas 2012 1 Darbas atliktas federalinėje valstybės biudžetinėje aukštojo profesinio mokymo įstaigoje Orenburgo valstija Universitetas Nanosistemų biocheminės fizikos mokslo ir mokymo centre. Mokslinis vadovas: Berdinskis Vitalijus Lvovičius...“

« KULIKOVSKY MAXIM SERGEVICH KAI KURIŲ RUSIJOS EUROPOS DALIES SPAGNUMŲ PELKŲ DIATOMINIAI DUMBLIAI 03.00.05 – Botanika Konkurso disertacijos santrauka biologijos mokslų kandidato mokslinis laipsnis Sankt Peterburgas 2007 2 Darbas atliktas Vidaus vandenų biologijos institute. I.D. Papanin RAS Mokslinis vadovas, biologijos mokslų daktaras Genkal Sergejus Ivanovičius Oficialūs oponentai: biologijos mokslų daktarė, profesorė, Trifonova Irina Sergeevna biologijos mokslų daktarė...“

« SILAČEVAS DENIS NIKOLAJVICH NAUJŲ NEUROPOTEKTORIŲ TYRIMAS ŽIDININĖS SMEGENŲ IZEMIJOS MODELIU 03.00.13 – fiziologija Konkurso disertacijos santrauka biologijos mokslų kandidato mokslinis laipsnis Maskva - 2009 Darbas atliktas A. N. vardo Fizinės ir cheminės biologijos tyrimų instituto mitochondrijų sandaros ir funkcijos laboratorijoje. Belozersky Maskvos valstybinis universitetas. M.V. Lomonosovas (vadovas – biologijos mokslų daktaras, profesorius D.B. Zorovas), Maskvos valstybinio universiteto Bioinžinerijos ir bioinformatikos fakultete. M.V. Lomonosovas (dekanas -..."

„Biologijos mokslų daktaro disertacijos santrauka Sankt Peterburgas – 2012 m. 2 Darbas atliktas Rusijos mokslų akademijos federalinėje valstybės biudžetinėje mokslo įstaigoje Zoologijos institutas Oficialūs oponentai: biologijos mokslų daktaras, profesorius Medvedevas Sergejus Glebovičius gydytojas...“

« KHALIEVA Anna Sergeevna NUOLATINIO MAGNETINIO LAUKO IR UV SPINDULIAVIMO ĮTAKA AUKŠČIŲJŲ AUGALŲ AUGIMO PROCESOMS IR JŲ FITOREMEDIACIJAI DIRVOJE NUO SUNKIŲ SĄLYGŲ METALAI IR NAFTOS PRODUKTAI Specialybė 03.02.08 - ekologija (biologija) Biologijos mokslų kandidato disertacijos santrauka Penza - 2013 Darbas atliktas Federalinės valstybinės biudžetinės aukštosios mokyklos Engelso technologijos institute (filialas) Profesinis išsilavinimas Saratovo valstybinis technikos universitetas, pavadintas Gagarino Yu.A. ant...“

« Kalmykova Olga Gennadievna BURTINSKAJOS STEPĖS STEPĖS AUGALIJAS (ORENBURGO VALSTYBĖS REZERVAS) PASKIRSTYMO RAŠTAI 03.00.16 – Ekologijos santrauka disertacija biologijos mokslų kandidato moksliniam laipsniui gauti Sankt Peterburgas - 2008 Darbas atliktas Rusijos mokslų akademijos Uralo filialo Stepių instituto biogeografijos ir biologinės įvairovės stebėsenos laboratorijoje Mokslinis vadovas: Biologijos mokslų daktaras Safronova Irina Nikolaevna Oficiali..."

« Astafieva Oksana Vitalievna GLYCYRRHIZA GLABRA L., ACHILLEA MICRANTHA WILLD NAUDOJIMAS. IR HELICHRYSUM ARENARIUM L. BIOLOGINIŲ PRODUKTŲ SU KURIMU SU ANTIBAKTERINĖS SAVYBĖS 01/03/06 - biotechnologijos (įskaitant bionanotechnologijas) Biologijos mokslų kandidato mokslinio laipsnio disertacijos SANTRAUKA Stavropolis - 2013 Darbas atliktas Federalinėje valstybinėje biudžetinėje Astrachanės aukštojo profesinio mokymo įstaigoje...“

« HOANG THI MINH NGUET Baltymų ir angliavandenių produktų gavimo iš baltųjų sojų žiedlapių proceso tyrimas Specialybė 03.00.23 – biotechnologijos SANTRAUKA Disertacijos technikos mokslų kandidato laipsniui gauti Maskva 2009 Darbas atliktas Rusijos chemijos-technologijos universiteto Biotechnologijos katedroje. DI. Mendelejevas. Mokslinis vadovas: chemijos mokslų kandidatė, docentė Alla Albertovna Krasnoštanova Oficialūs oponentai: daktarė...“

« NOVOSELOVAS Sergejus Vladimirovičius Naujos tioredoksino ir glutaredoksino sistemų tiolio oksidoreduktazės. Jų vaidmuo reguliuojant redokso balansą ląstelės 03.00.04 – biochemija 03.00.03 – molekulinė biologija Biologijos mokslų daktaro disertacijos SANTRAUKA Pushchino, 2008 1 Darbas atliktas Rusijos mokslų akademijos Ląstelių biofizikos institute Puščino ir Nebraskos universitete Linkolne (UNL), Biochemijos katedroje, Linkolne, Nebraska, JAV pareigūnas...

« Vinogradova Galina Jurievna POLIEMBRIONIJA ALLIUM RAMOSUM L. IR ALLIUM SCHOENOPRASUM L. (ALLIACEAE ŠEIMA) 03.00.05 – Botanika Disertacijos santrauka apie konkursas biologijos mokslų kandidato moksliniam laipsniui gauti Sankt Peterburgas 2009 2 Darbas atliktas Rusijos mokslų akademijos Botanikos instituto Embriologijos ir reprodukcinės biologijos laboratorijoje. V.L. Komarova RAS Vadovas Biologijos mokslų daktaras, RAS narys korespondentas Batygina T.B. Oficialus...“

« Volkovičius Markas Gabrielevičius POLYCESTINAE (COLEOPTERA, BUPRESTIDAE) POŠEIMOS VABALIAI: MORFOLOGIJA, FILOGENIJA, KLASIFIKACIJA 02.03.05 – entomologija Biologijos mokslų daktaro disertacijos santrauka Sankt Peterburgas – 2012 m. 2 Darbas atliktas Rusijos mokslų akademijos federalinės valstybinės biudžetinės mokslo įstaigos zoologijos instituto vabzdžių taksonomijos laboratorijoje Oficialūs oponentai: dr. Biologijos mokslų profesorius,...“

« Torgašina Irina Gennadievna IMOBILIZUOTO FERMENTINIO REAGENTO JAUTRUMO TYRIMAS EKOLOGINIAMS BIOLUMIMINESCENCIJOS TYRIMAMS 03.00.16 – ekologija Biologijos mokslų kandidato mokslinio laipsnio disertacijos SANTRAUKA Krasnojarskas - 2007 Darbas atliktas Sibiro federalinio universiteto Mokslo federalinės valstybinės aukštojo mokslo institucijos Gamtos ir humanitarinių mokslų instituto Biofizikos skyriuje vadovas: biologijos mokslų daktarė, profesorė Kratasyuk Valentina Aleksandrovna...“

« MAYER NIKOLAY KONSTANTINOVICH MOLEKULINIŲ GENETINIŲ ŽYMEKLIŲ TAIKYMAS UŽTIKRINTI ATSPARUMĄ GRŪDŲ DAIGIMUI ŠAKNĖJE TRITIFIKĖJE Specialybė: 02/03/07 – genetika, 01/03/06 – biotechnologijos (įskaitant bionanotechnologijas) Biologijos mokslų kandidato mokslinio laipsnio disertacijos SANTRAUKA Maskva 2011 Darbas atliktas Genetikos ir biotechnologijų katedroje bei Molekulinės biotechnologijos mokslo ir mokymo centre Rusijos valstybinės agrarinės ...

« Mokslinis vadovas: biologijos mokslų daktaras, profesorius Borisas Ivanovičius Kolupajevas Oficialūs oponentai: biologijos mokslų daktarė ELENA PUZATKINA ALEKSANDROVNA Profesorė Sokolina Flyura Mukhametgaleevna; Biologijos mokslų daktarė, profesorė Roza Yakhievna Dyganova Vadovaujanti organizacija: Nižnij Novgorodo valstybinis universitetas pavadintas vardu. N.I. Lobačevskio ĮTAKA...

« Smirnova Liudmila Olegovna GENETINĖ AVIŽŲ ĮVAIROVĖ PAGAL FOTOPERIODINĮ JAUTRUMĄ IR ANKSTYVĄ Brendimą Specialybės: 01/06/05 – selekcija iržemės ūkio augalų sėklininkystė, 01/03/05 – augalų fiziologija ir biochemija Biologijos mokslų kandidato disertacijos SANTRAUKA Sankt Peterburgas 2011 Disertacijos darbas atliktas Avižų, rugių genetinių išteklių katedroje, miežiai ir visos Rusijos augalų fiziologijos katedra...“

« Bezžonova Oksana Vladimirovna Anopheles genties kraujasiurbių uodų (Diptera, Culicidae) rūšių kompleksai Rusijoje ir kaimyninėse šalyse Specialybės 05.02.03 – entomologija ir 02/03/07 - genetika Biologijos mokslų kandidato disertacijos SANTRAUKA MASKAVA - 2011 Darbas buvo atliktas Maskvos valstybinio universiteto Biologijos fakulteto Entomologijos katedroje, pavadintoje M.V. Lomonosovas ir įstaigos Lyginamosios gyvūnų genetikos laboratorijoje...“

« RAKHIMOVAS Ilgizaras Ilyasovičius VIDURIO VOLGOS REGIONO AVIFAUNA ANTROPOGENINĖS GAMTOS KRAŠTOKRAŠTO TRANSFORMACIJOS SĄLYGOMIS Specialybė 03.00.16 - ekologija Biologijos mokslų daktaro disertacijos SANTRAUKA Maskva - 2002 Darbas atliktas Maskvos valstybinio pedagoginio universiteto Biologijos ir chemijos fakulteto Zoologijos ir ekologijos katedroje Mokslinis konsultantas: Biologijos mokslų daktaras, profesorius V.M. Konstantinovas...

« SALACHOVA GULNARA MIRZALIFOVNA AUGALŲ IR RIZOSFERINIŲ MIKROBIOTŲ EKOLOGINIŲ IR FIZIOLOGIJŲ PARAMETRŲ POKYČIAI UŽTARŠIMO NAFTOS IR REKIERAVIMO SĄLYGOS DIRVOŽIAI Specialybė 03.00.16 - Ekologija 03.00.12 - Augalų fiziologija ir biochemija Biologijos mokslų kandidato disertacijos santrauka Ufa - 2007 Darbas atliktas Valstybinės aukštosios mokyklos Biochemijos ir biotechnologijų katedroje Baškirų profesinis išsilavinimas...“