Kas nuostabaus dėl naujosios Nobelio chemijos premijos, kodėl vanduo užšąla aplink biomolekules ir kaip kompiuteriai 2D vaizdus paverčia 3D, skaitykite svetainėje apie 2017 m. Nobelio premijos laureatų Jacques'o Dubocheto, Joachimo Franko ir Richardo Hendersono darbus.
Pastaraisiais metais gautos molekulinės struktūros yra įspūdingos. Štai ir visas salmonelių „švirkštas“, kuriuo ji puola ląsteles, ir baltymai, suteikiantys bakterijoms atsparumą antibiotikams, ir gražiausios žiuželių pagrindo struktūros, ir nuostabiai gražūs fermentai. Nuo pagrindinių biologinių žinių apie biomolekulių darbą ląstelėje iki supratimo apie tai, kaip veikia vaistų molekulės, mes visi galime tai įgyti krioelektroninės mikroskopijos metodo dėka, už kurio sukūrimą buvome apdovanoti Nobelio chemijos premija m. 2017 m.
Bet kas yra šis metodas ir kodėl be jo negalima pasiekti tų pačių rezultatų? Juk tuo metu buvo ir rentgeno kristalografija, ir tiesiog elektroninė mikroskopija.
Šie metodai tyrėjams nustatė keletą svarbių apribojimų, kurių įveikimą, o tiksliau, „kuriant krioelektroninės mikroskopijos metodus, skirtus biomolekulių struktūrai nustatyti didelės skiriamosios gebos tirpaluose“, šiandien buvo įteiktas prestižinis apdovanojimas.
Šiais metais ją gaus trys mokslininkai, kurie buvo šios technologijos ištakos: prancūzas Jacques'as Dubochet, dirbantis Lozanos universitete, Vokietijoje gimęs Joachimas Frankas iš Kolumbijos universiteto Niujorke ir škotas Richardas Hendersonas iš Molekulinės laboratorijos. Biologija Kembridže (beje, atrodo, kad tai penkioliktas šios laboratorijos laureatas).
Iš kairės į dešinę: Jacques'as Dubochetas, Joachimas Frankas ir Richardas Hendersonas
Denis Balibouse / Reuters, Kolumbijos universitetas, MRC molekulinės biologijos laboratorija
Kai Ernstas Ruska išrado ir pademonstravo elektroninį mikroskopą, kuriuo galima matyti atskirų atomų padėtis (už kurį Ruska gavo Nobelio premiją 1986 m.), kitas mokslininkas Ladislavas Martonas parašė straipsnį apie tai, kaip sunku tirti biologinę medžiagą naujas metodas, nes biomolekulės ir ląstelės sunaikinamos veikiant elektronų srautui. Šis srautas turėjo būti labai silpnas, kad nebūtų pažeisti mėginiai, tačiau toks silpnas srautas davė prastą skiriamąją gebą. Elektroninei mikroskopijai mėginys turėjo būti plonas ir plokščias, o tai taip pat apsunkino užduotį – reikėjo iš dvimatės projekcijos užbaigti tiriamų molekulių (pavyzdžiui, baltymų) 3D modelius.
Natūralu, kad nebuvo nė kalbos apie gyvų ląstelių tyrimą, tačiau sunaikintos jos atrodo visiškai kitaip nei darbo metu. Be to, elektroniniam mikroskopui reikėjo vakuumo, o jame išgaravo visas vanduo, kuris padėjo biomolekulėms išlaikyti natūralią formą. Visa tai buvo sunku ir nepatogu. Kol pasirodė krioelektroninė mikroskopija.
Biomolekulių vaizdavimo pokyčiai, susiję su 2017 m. Nobelio premijos laureatų darbais
Richardas Hendersonas Kembridže dirbo su baltymais, naudodamas rentgeno kristalografiją – techniką, kuria Rosalind Franklin sukūrė garsiuosius vaizdus, iš kurių Watsonas ir Crickas sukūrė savo dvigubos DNR spiralės modelį. Viskas buvo gerai, kol Hendersonas pradėjo dirbti su membraniniais baltymais, esančiais ląstelės membranoje. Ištraukti iš natūralios aplinkos jie tapo nenaudinga, susivėlusia atomų krūva. Hendersonui nepavyko vieno iš jų išskirti pakankamais kiekiais, kito nepavyko kristalizuoti.
Viskas pasikeitė, kai Hendersonas paėmė šviesai jautrų baltymą bakteriorodopsiną. Mokslininkas nusprendė jo neištraukti iš membranos, bet kartu su ja po elektroniniu mikroskopu padėjo visą membranos gabalėlį. Kad konstrukcija nesugriūtų, ji buvo padengta gliukozės tirpalu. Kad nepažeistų mėginio galingu elektronų srautu, mokslininkai iššovė silpnesnį spindulį. Vaizdas, kaip ir tikėtasi, nebuvo labai aiškus ir kontrastingas, tačiau čia buvo naudojamas tas pats matematinis metodas, kaip ir rentgeno kristalografijoje ta pati kryptis. Iš skirtingų kampų padarytos nuotraukos parodė, kad baltymas susisuko, praeidamas pro membraną septynis kartus (dabar tokie baltymai žinomi kaip septynių spiralių receptoriai). Tai buvo geriausios kokybės vaizdas, gautas naudojant elektroninį mikroskopą.
Septynių angstremų skiriamoji geba daugelį sužavėjo, tačiau Hendersonas nenorėjo sustoti: jis norėjo pasiekti tokią pat skiriamąją gebą kaip rentgeno kristalografija – tris angstremus. Laikui bėgant lęšiai tapo geresni, atsirado užšaldymo technologijos, leidžiančios mėginį išsaugoti skystame azote. Kad susidarytų aiškesnį bakteriorodopsino vaizdą, Hendersonas keliavo į skirtingas laboratorijas naudodamas geriausius pasaulyje elektroninius mikroskopus. Jie visi turėjo tų pačių trūkumų, bet papildė vienas kitą. Ir tik 1990 m., praėjus 15 metų nuo pirmosios, šiuolaikinės akiai negražios nuotraukos, Hendersonas pasiekė savo tikslą. Jis parodė, kad krioelektroninė mikroskopija gali būti naudinga tiriant biomolekules, tačiau jo bakteriorodopsinas buvo užsakytas ir praktiškai užfiksuotas ląstelės membranoje. Labai nedaugelis kitų baltymų gali padaryti tą patį, todėl biologai manė, kad tai vis dar labai ribotas metodas.
Tuo pačiu metu, kitoje Atlanto pusėje, Niujorke, Joachimas Frankas ilgą laiką ieškojo šios problemos sprendimo. Jau 1975 metais jis sugalvojo teorinį požiūrį, tačiau jį įgyvendinti prireikė daug metų. Jo idėja buvo sukurti kompiuterį, kuris galėtų atskirti atsitiktinai išdėstytus baltymus nuo chaotiško fono. Jis sugalvojo matematinį metodą, leidžiantį kompiuteriui vaizde rasti skirtingus pasikartojančius raštus. Kompiuteris surūšiavo raštus, derindamas panašius, kad gautų vidutinį, bet ryškesnį vaizdą. Frankas paskelbė keletą straipsnių su didelės raiškos 2D baltymų modeliais iš skirtingų kampų. Algoritmai buvo paruošti iki 1981 m.
Kitas žingsnis buvo sukurti algoritmą, kuris suranda panašias 2D nuotraukas ir sujungia jas į 3D struktūras. Devintojo dešimtmečio viduryje Frankas paskelbė šią metodo dalį ir ėmėsi didžiulės užduoties – sukurti ribosomos – milžiniškos molekulinės mašinos baltymams surinkti ląstelėje – paviršiaus modelį.
Joachimo Franko sukurtas 3D struktūrų analizės metodas: 1. Elektronų pluoštas atsitrenkia į atsitiktinai orientuotus baltymus, todėl vaizde lieka jų įspaudas. 2. Dėka neaiškios informacijos apdorojimo metodų, gautus vaizdus, kurie yra panašūs vienas į kitą, kompiuteris sugrupuoja į grupes. 3. Naudojant gautus tūkstančius vaizdų, kompiuteris sukuria didelės raiškos 2D vaizdą. 4. Kompiuteris analizuoja, kaip 2D vaizdai yra susiję vienas su kitu erdvėje ir sukuria didelės raiškos 3D vaizdą.
Johanas Jarnestadas / Karališkoji Švedijos mokslų akademija
Kiek anksčiau, 1978 m., kitas mokslininkas Jacques'as Dubochet pradėjo spręsti trečiąją šios elektroninio mikroskopo problemos dalį. Kaip prisimename, labai nukentėjo biomolekulės, kurios virsdavo beforme mase, jei aplink jas išgaruodavo vanduo, o elektroninio mikroskopo vakuuminėje kameroje būtinai išgaruodavo. Paprastas užšaldymas nedavė rezultatų: ledo kristalai, besiplečiantys, palyginti su vandeniu, gali suardyti tiriamą baltymą ir sunaikinti jo struktūrą. Nors Hendersonui pasisekė su bakteriorodopsinu, kiti mokslininkai kovojo su ne membraniniais baltymais, kurie tirpsta vandenyje.
Duboche sugalvojo itin greitą užšaldymo skystuoju azotu metodą: vanduo tarsi „stiklėjo“, o elektronų srautas puikiai atsispindėjo nuo jo ir davė gerą vaizdą. Tai leido puikiai paruošti darbui biologinę medžiagą, ką Dubochetas įrodė publikuodamas keletą šiuo metodu gautų virusų struktūrų 1984 m.
Dubochet metodas: 1. Ant mėginio uždedamas metalinis sietelis ir išsijojamas medžiagos perteklius. 2. Sietas dedamas į etaną, kurio temperatūra yra apie -196 °C, todėl mėginys per sieto skylutes sudaro ploną plėvelę. 3. Vanduo virsta į stiklą panašia medžiaga ir supa mėginį, po to stebint elektroniniu mikroskopu atšaldomas skystu azotu.
Johanas Jarnestadas / Karališkoji Švedijos mokslų akademija
Nuo šio momento mokslininkai pradėjo kreiptis į Dubochet, norėdami sužinoti jo metodą. Frankas taip pat susitiko su juo, kad gautų ribosomos paviršiaus struktūras. Dubochet, Frank ir Henderson metodų derinys sudarė krioelektroninės mikroskopijos pagrindą.
Tiesą sakant, būtent poreikis gauti „gyvos“ ribosomos struktūrą „paskatino“ norą greitai įsisavinti metodą: ribosoma yra vienas iš pagrindinių antibiotikų veikimo taikinių, kurių erdvinis suderinimas su Ribosomų ertmės yra labai svarbios. Ir dabar dauguma potencialių antimikrobinių vaistų kompleksų su ribosomomis yra „žiūrimi“ krioelektroninės mikroskopijos metodais.
Metodas tapo toks svarbus, kad visame pasaulyje vyksta daug didelių konferencijų, skirtų būtent CryoEM metodui, kaip jis trumpinamas anglų kalbos literatūroje. 2017 metais pirmoji tokia konferencija surengta Maskvos valstybiniame universitete.
Nobelio komiteto sprendimą specialiai šiai vietai pakomentavo fizinių ir matematikos mokslų kandidatas, Sankt Peterburgo Branduolinės fizikos instituto molekulinės ir radiacinės biofizikos katedros vedėjas B.P. Konstantinovas Andrejus Konevega, kurio tyrimų grupė savo darbe dažnai naudoja CryoEM metodus:
„Kryoelektroninė mikroskopija padarė revoliuciją struktūrinėje biologijoje, nes leidžia didelės raiškos makromolekulių vaizdavimą, dabar tokia pat skiriamąja geba kaip rentgeno kristalografija, nereikia kristalizuoti baltymų. Tai yra, visos biomolekulės tyrimo metu yra natūralios būsenos. Per pastarąjį dešimtmetį šis metodas patyrė kokybinį šuolį dėl gaunamų struktūrų kokybės ir skiriamosios gebos. Tai tapo įmanoma technologinės pažangos dėka: nauji mikroskopai, nauji fotoaparatai, nauji apdorojimo metodai. Svarbu tai, kad dabar biologai turi pakankamai galingas skaičiavimo sistemas, kad apdorojimas užtruktų kelias dienas, o ne mėnesius ar metus. Mes patys Rusijoje tokius duomenų apdorojimo centrus turime Maskvoje esančiame „Maskvos tyrimų centre“ ir „Kurchatovo instituto“-PNPI tyrimų centre Gatčinoje, todėl juos aktyviai naudojame savo duomenims apdoroti.
Apie apdovanojimą:
Per 117 metų chemijos srityje buvo įteiktos 109 premijos (kaip ir kitose disciplinose, buvo metų, kai premija nebuvo įteikta dėl karo arba kai Nobelio komitetas nesusitarė). Pačią pirmąją premiją 1901 m. gavo Jacobas Hendrikas van't Hoffas. Per visą laikotarpį Stokholme buvo paskelbtos 178 laureatų pavardės. Tiesa, apdovanojimą gavo tik 177 žmonės: Frederickas Sangeris tapo vieninteliu istorijoje žmogumi, kuris apdovanojimą gavo du kartus.
Vidutinis prizininkų amžius (neįskaitant 2017 m. prizo) – 58 metai. Jauniausias buvo Frédéricas Joliot-Curie, kuris premiją gavo 1935 m., būdamas 35 metų, vyriausias buvo Johnas Fennas: 2002 m. Nobelio premijos laureatui buvo 85 metai. Beje, moterims prizas nėra labai lengvas: per 117 metų laureatės buvo tik keturios, o pusė jų – iš tos pačios šeimos. Marie Curie premiją gavo 1911 m., o jos dukra Irene 1935 m. Kita pusė skirta tai pačiai rentgeno kristalografijai, su kuria konkuruoja krioelektroninė mikroskopija. 1964 metais prizas buvo įteiktas Dorothy Crowfoot Hodgkin už biomolekulių rentgeno difrakcinę analizę, o 2009 metais nugalėtoja tapo Ada Yonath, šią techniką panaudojusi ribosomos struktūrai nustatyti.
2017 m. Nobelio chemijos premija buvo skirta Jacques'ui Dubochetui, Joachimui Frankui ir Richardui Hendersonui už krioelektroninės mikroskopijos sukūrimą, kuri leido labai detaliai ir labai didele raiška apžiūrėti gyvų organizmų molekules.
Jacques'as Dubouche'as yra šveicaras, dirba Lozanos universitete, Šveicarijoje, Joachimas Frankas yra amerikietis iš Kolumbijos universiteto Niujorke, JAV, Richardas Hendersonas yra britų mokslininkas iš Kembridžo (MRC Laboratory of Molecular Biology, Kembridžas, JK).
Pabrėžiama, kad praėjusio amžiaus aštuntajame – devintajame dešimtmetyje tęsiami laureatų tyrimai davė revoliucinį proveržį biologijoje, nes leido pirmą kartą pažvelgti į tai, kas anksčiau buvo visiškai nematoma – į atskiras biologines molekules ir net juos sudarantys atomai.
Iš esmės mokslininkai modernizavo elektroninę mikroskopiją. Anksčiau negyva medžiaga buvo stebima naudojant elektroninį mikroskopą. Laureatai jį pritaikė laukinės gamtos objektams stebėti. Išmokome užšaldyti jas vandeniniame tirpale, kad biomolekulės išlaikytų formą, savybes ir tuo pačiu būtų „fiksuotos“ jas stebėti patogia forma.
Dėl to elektroninio mikroskopo pagalba tapo įmanoma gauti trimačius nagrinėjamų gyvų objektų vaizdus. Iki 2013 m. metodo raiška tapo fenomenali. Atsirado įvairiausių molekulinių baltymų vaizdų, pavyzdžiui, tų, kurie daro bakterijas atsparias antibiotikams. Netgi buvo galima „nufotografuoti“ virusus - pavyzdžiui, Zikos virusą. Tai žada kitą pergalę prieš jį.
Į mikropasaulį prasiskverbę tyrinėtojai pastebi: detalus tam tikro objekto vaizdas – trumpiausias kelias į jo esmės supratimą. Tai yra, į žinias. Akivaizdu, kad tokiai nuomonei pritaria Švedijos karališkoji mokslų akademija, skirianti Nobelio premijas.
PAGALBA KP
Dabartinė Nobelio chemijos premija yra 109-oji. Tarp laureatų, apdovanotų šiuo, garbingiausiu mokslo apdovanojimu pasaulyje nuo 1901 m., yra 4 moterys.
Britų mokslininkas Frederickas Sandgeris, įtrauktas į „100 mūsų laikų genijų“ sąrašą, Nobelio chemijos premiją gavo du kartus – 1958 m. ir 1980 m. Pirmasis kartas buvo skirtas tiksliai aminorūgščių sekai insulino molekulėje nustatyti. Antrasis – už pirminės DNR struktūros iššifravimo metodo sukūrimą.
Pernai premija atiteko mokslininkams iš Prancūzijos, JAV ir Olandijos. Prancūzas Jeanas-Pierre'as Sauvage'as, amerikietis seras Jamesas Fraseris Stoddartas ir olandas Bernardas L. Feringa buvo apdovanoti „už molekulinių mašinų kūrimą ir sintezę“. Lureatai iš tikrųjų padėjo nanotechnologijų materialinį pagrindą.
2017 metų Nobelio chemijos premija skirta už didelės raiškos krioelektroninės mikroskopijos, skirtos biomolekulių struktūroms tirpaluose nustatyti, sukūrimą. Laureatai buvo iš Lozanos universiteto, Joachimas Frankas iš Kolumbijos universiteto ir iš Kembridžo universiteto.
Krioelektroninė mikroskopija yra perdavimo elektronų mikroskopijos forma, kurios metu mėginys tiriamas kriogeninėje temperatūroje.
Ši technika yra populiari struktūrinėje biologijoje, nes leidžia stebėti nedažus ar kitaip fiksuotus egzempliorius, rodančius juos gimtojoje aplinkoje.
Elektroninė kriomikroskopija sulėtina į molekulę patenkančių atomų judėjimą, o tai leidžia gauti labai aiškius jos struktūros vaizdus. Gauta informacija apie molekulių struktūrą yra nepaprastai svarbi, įskaitant gilesnį chemijos supratimą ir vaistų kūrimą.
Daugelis mokslo proveržių yra susiję su sėkmingu žmogaus akiai nematomų objektų vizualizavimu. Optinė mikroskopija leido įrodyti mikroorganizmų egzistavimą, pažvelgti į spermą ir kiaušinėlius, iš dalies ištirti ląstelių struktūrą ir net pamatyti chromosomas. Elektronų mikroskopija, kurioje vietoj šviesos srauto buvo naudojamas elektronų pluoštas, leido įveikti fizinius optinių teleskopų apribojimus.
Tačiau ji turėjo ir savo trūkumų. Pirma, galingas elektronų spindulys sunaikino biologinę medžiagą. Antra, kad elektronai įsibėgėtų, jiems reikia vakuumo – atitinkamai vaistas turėjo būti vakuume.
Todėl su jo pagalba buvo neįmanoma ištirti „gyvų“ pavyzdžių.
Joachimo Franko indėlis prisidėjo prie plačios metodo sklaidos. Dar 1975-1986 metais jis sukūrė vaizdų apdorojimo metodą, kurį sudarė dvimačių vaizdų, gautų naudojant elektroninį mikroskopą, analizė ir jų pagrindu kuriamos tiriamų objektų trimatės struktūros.
Jacques'as Dubochet pasiūlė mėginiams išsaugoti naudoti greitai atšaldytą vandenį. Mėginių aušinimas kaip būdas juos išsaugoti mokslininkų buvo svarstomas gana ilgą laiką. Tačiau užšalus vandeniui ir susidarius kristalinei gardelei, mėginių struktūra buvo sunaikinta. O skystu pavidalu jis išgaravo elektroninio mikroskopo vakuuminėje kameroje, vėlgi sukeldamas tiriamų molekulių sunaikinimą.
Galiausiai buvo rastas būdas apeiti kristalizacijos fazę ir užtikrinti, kad vanduo virstų stikline būsena. Metodas buvo vadinamas stiklinimu.
Stiklinimo metu vanduo sugebėjo apsaugoti molekules nuo sunaikinimo net vakuume.
Šie atradimai davė galingą impulsą elektroninės mikroskopijos plėtrai. 2013 metais mokslininkams pavyko ištirti net atskirus medžiagos atomus. Tokia didelė skiriamoji geba leidžia ištirti ląstelių ribosomas ir mitochondrijas, jonų kanalus ir fermentų kompleksus.
2015 metais žurnalas „Nature Methods“ vienos dalelės krioelektroninę mikroskopiją paskelbė metų proveržio metodu.
Naujausi techniniai pasiekimai šioje srityje leido mokslininkams atsisakyti rentgeno kristalografijos metodo, kurio pagrindinis trūkumas yra būtinybė kristalizuoti baltymą, o tai gali būti sunku sudėtingos struktūros baltymams. Pastaraisiais metais moksliniuose žurnaluose gausu detalių Zikos viruso paviršiaus ir atsparumą antibiotikams sukeliančių baltymų vaizdų. Visų pirma buvo galima pamatyti, kaip Staphylococcus aureus bakterijos priešinasi antibiotikų poveikiui, ir pamatyti struktūros, kuria koronavirusai prasiskverbia į ląsteles, vaizdą.
Nepaisant sparčios pažangos šioje srityje, įrangos kaina ir standartizuoti metodai šiek tiek sulėtino platų krioelektroninės mikroskopijos technologijos pritaikymą.
Tarp pretendentų į Nobelio chemijos premiją buvo rusas – vadovaujantis Cheminės fizikos instituto (ICP) vardo mokslininkas. N. N. Semenovas kartu su kolegomis iš JAV reikšmingai prisidėjo prie anglies-vandenilio funkcionalizacijos – šakos, kuriančios naujus organinių junginių sintezės metodus. Į galimų laimėtojų sąrašą taip pat pateko danas Jensas Norskovas už esminius pasiekimus heterogeninės katalizės ant kietų paviršių srityje ir chemikų komanda Tsutomu Miyasaki, Nam-Kyu Park ir Henry Snaith už perovskito mineralo atradimą ir juo pagrįstą plėtrą. .
2016 metais prizas atiteko Jean-Pierre Sauvage, Stoddart ir Bernard Feringa už molekulinių mašinų išradimą.
Praėjusią savaitę buvo paskelbta, kad 2017 m. Nobelio chemijos premija atiteks šveicarui Jacques'ui Dubochetui, vokiečiui-amerikiečiui Joachimui Frankui ir škotui Richardui Hendersonui už „didelės skiriamosios gebos krioelektroninės mikroskopijos metodų, skirtų trimatėms biomolekulių struktūroms nustatyti, sukūrimą. tirpale“. Jų darbas leido, pradedant nuo devintojo dešimtmečio, išbandyti ir palaipsniui tobulinti tokio tipo mikroskopiją tiek, kad pastaraisiais metais mokslininkai gali labai išsamiai ištirti sudėtingas biologines molekules. Nobelio komitetas pažymėjo, kad krioelektroninė mikroskopija atnešė biochemiją į naują erą, užpildydama daugybę žinių apie gyvybės molekules ir gyvas sistemas spragų.
Iš karto atkreipkime dėmesį, kad kriogeninę elektroninę mikroskopiją vargu ar galima pavadinti iš esmės nauju ir savarankišku fizinio materijos tyrimo metodu. Greičiau tai yra transmisinės elektroninės mikroskopijos rūšis (vienas šio metodo autorių Ernstas Ruska 1986 m. gavo Nobelio premiją), kuri buvo specialiai pritaikyta mikrobiologiniams objektams tirti.
Perdavimo elektronų mikroskopu elektronų pluoštas praleidžiamas per mėginį pakankamai plonu, kad būtų skaidrus elektronams (dažniausiai dešimtosioms ir šimtosioms mikronų dalims), kurie, eidami per mėginį, absorbuojami ir išsisklaido, keičiant mėginio kryptį. judėjimas. Šiuos pokyčius galima registruoti (šiais laikais kaip detektorius dažniausiai naudojama CCD matrica, kurios kūrėjai Willardas Boyle'as ir George'as Smithas tapo laureatais) ir atlikus analizę gauti tiriamo objekto vaizdą plokštumoje. statmenai sijai. Kadangi vidinis elektronų bangos ilgis (dešimtys pikometrų, kai energija būdinga elektroniniams mikroskopams) yra daug trumpesnis nei šviesos bangos ilgis matomoje srityje (šimtai nanometrų), elektroninė mikroskopija gali „matyti“ daug smulkesnes detales nei optinė mikroskopija, įskaitant didelės skiriamosios gebos fluorescencinė mikroskopija (HRFM), kurią sukūrė laureatai Ericas Betzigas, Stefanas Hellas ir Williamas Moerneris.
Beveik pasiekta maksimali elektroninių mikroskopų skiriamoji geba – keli angstremai (dešimtosios nanometro dalys). Tai leidžia gauti vaizdus, kuriuose, pavyzdžiui, galima atskirti atskirus atomus. Palyginimui: HRFM galimybių riba yra 10–20 nm. Tačiau tiesiog lyginti skirtingus metodus pagal maksimalią skiriamąją gebą yra visiškai beprasmiška. Elektroniniai mikroskopai turi didelę skiriamąją gebą, tačiau ne visada įmanoma ja naudotis. Faktas yra tai, kad mėginys, be šlifavimo ruošiant, pats tyrimo metu yra gana stipriai apšvitinamas elektronų pluoštu (grubiai tariant, kuo spindulys intensyvesnis, tuo mažiau klaidų ir tuo geresnis rezultatas). vakuume (vakuumas reikalingas, kad terpė neišsklaidytų elektronų už mėginio ribų, taip sukeldama nereikalingus iškraipymus). Tokios sąlygos visiškai netinkamos, jei reikia tirti sudėtingas biologines molekules ir objektus – jie yra pažeisti išretėjusioje aplinkoje ir juose yra daug gana silpnų ryšių, kurie tyrimo metu bus tiesiog sunaikinami.
Supratimas, kad be papildomų patobulinimų elektroninis mikroskopas negali būti pritaikytas biomolekulių ir gyvųjų sistemų tyrimams, atsirado beveik iškart po jo išradimo. Pavyzdžiui, apie tai rašė vengrų fizikas Ladislavas Martonas, praėjus trejiems metams po to, kai 1931 metais Ernstas Ruska pademonstravo elektroninio mikroskopo veikimo principą (L. Martonas, 1934. Biologinių objektų elektroninė mikroskopija). Tame pačiame straipsnyje Martonas taip pat pasiūlė šios problemos sprendimo būdus. Visų pirma jis taip pat atkreipė dėmesį į tai, kad mėginių užšaldymas gali sumažinti žalą, kurią sukelia švitinimas elektronų pluoštu. Svarbu pažymėti, kad nors Martono darbe nenurodyta, mėginio užšaldymas taip pat padeda sumažinti molekulių šiluminę vibraciją, o tai taip pat pagerina gaunamą vaizdą.
Aštuntajame ir devintajame dešimtmečiuose mokslas ir technologijos pasiekė pakankamą išsivystymo lygį, kad galėtų įveikti visus sunkumus. Ir tai įvyko daugiausia šių metų apdovanojimų laureatų pastangų dėka.
Richardas Hendersonas pirmasis atvaizdavo asimetrinį baltymą atomine raiška, naudodamas perdavimo elektronų mikroskopiją (atšaldžius mėginį). Savo tyrimus jis pradėjo aštuntojo dešimtmečio viduryje. Be to, iš pradžių Hendersonas bandė gauti kelių baltymų struktūrą iš ląstelės membranos, naudodamas rentgeno spindulių difrakcijos analizės metodą, kuris net tada galėjo suteikti kelių angstremų skiriamąją gebą. Tačiau greitai paaiškėjo, kad šiuo metodu gero rezultato pasiekti nepavyks: tiriama medžiaga turi būti kristalinės formos, o iš jų aplinkos išgauti membraniniai baltymai arba prastai kristalizuojasi, arba net praranda formą. Tada jis perėjo prie elektroninės mikroskopijos.
Buvo pasirinktas specifinis baltymas – bakteriorodopsinas – ir nuspręsta jo ne išskirti iš membranos, o tirti tiesiogiai joje. Mokslininkai mėginius papildomai padengė gliukozės tirpalu, kad apsaugotų juos nuo išdžiūvimo vakuume. Tai padėjo išspręsti konstrukcijos išlaikymo problemą. Tada Hendersonas ir jo kolegos susidūrė su jau aprašyta mėginių sunaikinimo elektronų pluošto įtakoje problema. Jį išspręsti padėjo kelių veiksnių derinys.
Pirma, bakteriorodopsinas yra reguliariai membranoje, todėl kruopštus šio dėsningumo įvertinimas kartu su fotografavimu iš skirtingų kampų labai padeda kurti nuotrauką. Tai padėjo sumažinti spindulio intensyvumą ir sutrumpinti ekspozicijos laiką, tačiau pagerino kokybę. Jau 1975 metais pavyko gauti šio baltymo vaizdą su 7 angstremų skiriamąja geba (3 pav., žr. R. Henderson, P. N. T. Unwin, 1975. Violetinės membranos trimatis modelis, gautas elektroniniu mikroskopu).
Antra, Hendersonas turėjo galimybę keliauti į skirtingus tyrimų centrus ir išbandyti skirtingus elektroninius mikroskopus. Kadangi tais metais nebuvo suvienodinimo, skirtingi mikroskopai turėjo savų privalumų ir trūkumų: skirtingas kameros evakavimo laipsnis, skirtingas mėginio aušinimo laipsnis (tai sumažina elektronų apšvitinimo žalą), skirtinga elektronų pluošto energija ir skirtingas detektorių jautrumas. Todėl galimybė tirti tą patį objektą skirtingais mikroskopais leido iš pradžių pasirinkti „mažiausiai nepalankias“ sąlygas vaizdui gauti, o vėliau jas palaipsniui tobulinti. Taigi Hendersonas kaupė duomenis ir gavo vis tikslesnę bakteriorodopsino struktūrą. 1990 metais buvo paskelbtas jo straipsnis, kuriame pateiktas šio baltymo su atomine skiriamąja geba modelis (R. Henderson et al., 1990. Model for the structure of bacteriorodopsin based on high-resolution elektron cryo-mikroskopija).
Šiame novatoriškame tyrime Hendersonas parodė, kad krioelektroninė mikroskopija gali sukurti vaizdus, kurių skiriamoji geba yra tokia pat gera kaip rentgeno spindulių difrakcija, o tai tuo metu buvo proveržis. Tiesa, šis rezultatas gerokai išnaudojo faktą, kad bakteriorodopsinas reguliariai yra ląstelės membranoje, ir nebuvo aišku, ar tokią skiriamąją gebą galima pasiekti kitoms, „netaisyklingoms“ molekulėms.
Atsitiktinai esančių biologiškai aktyvių molekulių silpnų signalų apdorojimo problemą išsprendė kitas 2017 metų Nobelio premijos laureatas Joachimas Frankas. Jo pagrindinis indėlis į krioelektroninę mikroskopiją yra dvimačių vaizdų, gautų naudojant krioelektroninę mikroskopiją, analizės algoritmų sukūrimas, leidžiantis sukurti aukštos kokybės trimatį modelį. Panašūs algoritmai jau buvo sukurti kitiems mikroskopijos metodams. Frankas optimizavo ir labai patobulino matematinės analizės metodus, kurie leidžia atskirti naudingą informaciją, gautą iš elektroninės mikroskopijos, nuo signalų dėl triukšmo. Tiksliuosiuose elektroniniuose įrenginiuose triukšmas atsiranda dėl įvairių priežasčių: atsitiktiniai srovės ir įtampos svyravimai gali atsirasti dėl netolygaus elektronų emisijos vakuuminiuose blokuose, netolygių krūvininkų (laidumo elektronų ir skylių) susidarymo ir rekombinacijos procesų puslaidininkiniuose įrenginiuose, terminio judėjimo srovės nešikliai laiduose (šiluminis triukšmas) arba išorinis triukšmas (nepaisant to, kad paprastai viskas yra gerai izoliuota).
Užduotį tai dar labiau apsunkina. Jei objektai, net jei jie yra tokie patys arba maždaug vienodi, kaip turėtų būti tokiuose tyrimuose, yra netvarkingi, jie duoda šiek tiek skirtingos struktūros signalus, kurie gali sulieti vienas kitą. Be to, tokio susiliejimo priežastį – ar tai triukšmas, ar algoritmo klaidos – nustatyti nelengva. Duomenų apdorojimo principas schematiškai parodytas fig. 5: daugybė plokščių tiriamos molekulės vaizdų išvalomi nuo triukšmo ir įvedami į „kampus“, tada iš vaizdų su artimais kampais sukuriamas aukštesnės kokybės profilis ir galiausiai iš šių profilių sukuriamas trimatis modelis. .
1981 metais Frankas apibendrino matematinius modelius pirmoje kompiuterinės programos SPIDER versijoje (System for Processing Image Data from Electron microscopy and Related fields – System for processing data from electronic microscopy and related fields, pirmą kartą publikuota: J. Frank et al. , 1981. Spider – modulinė programinės įrangos sistema elektroniniam vaizdų apdorojimui). Šis programinės įrangos paketas vis dar egzistuoja ir yra atnaujinamas iki šiol, be to, šios programos yra platinamos nemokamai, o tai tikrai palengvina mokslininkų darbą visame pasaulyje. Frankas naudojo savo algoritmus, kad gautų ribosomos paviršiaus vaizdą - ląstelės organelės, susidedančios iš RNR grandinių ir susijusių baltymų, kurie naudojami baltymų biosintezei iš aminorūgščių, remiantis genetine informacija.
Priešdėlis "krio-" elektroninėje mikroskopijoje pasirodė trečiojo laureato Jacques'o Dubocheto dėka. Jis sukūrė greito vandeninių tirpalų aušinimo mėginiais metodą (J. Dubochet, A. W. McDowall, 1981. Gryno vandens stiklinimas elektronų mikroskopijai). Be to, vanduo turi užšalti taip greitai, kad molekulės nespėtų išsirikiuoti į kristalinę gardelę, atsitiktinai užšaldamos (žr. amorfinį ledą). Tai pasiekiama greitai panardinant ploną tirpalo plėvelę su mėginiu į indą su skystu etanu, atšaldytu iki –160°C (6 pav.). Teisingas užšaldymo metodas gali būti vadinamas viso metodo sėkmės raktu, nes tvarkingi ledo kristalai gali sukelti elektronų difrakciją, iškraipydami informaciją apie tiriamas molekules. Dėl didelės baltymų ir nukleorūgščių molekulinės masės šios molekulės yra gremėzdiškos, todėl greitai užšalusios nespėja pakeisti savo padėties ar pakeisti formos. Tai reiškia, kad šiuo metodu greitai užšaldant biologiškai aktyvių molekulių struktūra nekinta. Jį naudodamas Dubochetas pirmasis panaudojo krioelektroninę mikroskopiją virusų struktūrai tirti (7 pav., žr. M. Adrian ir kt., 1984. Virusų krioelektroninė mikroskopija).
1990-aisiais ir 2000-aisiais krioelektroninė mikroskopija palaipsniui vystėsi ir tobulėjo tobulėjant skaičiavimo galiai ir prietaisų tikslumui. Tačiau tikrasis krioelektroninės mikroskopijos klestėjimas prasideda 2012 m. Tai siejama su tiesioginių elektronų detektorių, pagrįstų CMOS (CMOS), atsiradimu, kurie gali tiesiogiai užfiksuoti elektronus, einančius per mėginį. Tai leido supaprastinti elektroninių mikroskopų dizainą pašalinant sudėtingas fokusavimo ir signalų konvertavimo sistemas ir sumažinant mazgų, galinčių sukelti atsitiktinį triukšmą, skaičių. Dėl to krioelektroninės mikroskopijos metodo skiriamoji geba padidėjo iki 2–3 angstremų (8 pav.).
Vienas praktinio krioelektroninės mikroskopijos taikymo pavyzdžių šioje srityje yra Zikos viruso tyrimas (10 pav.). Per Zikos epidemijos protrūkį Brazilijoje 2016 m., mokslininkai turėjo keletą mėnesių, kad gautų informaciją apie viruso struktūrą naudojant krioelektroninę mikroskopiją (D. Sirohi ir kt., 2016. The 3,8 Å raiškos krio-EM struktūra Zika virusas).
Kitas pavyzdys – šiais metais krioelektroninė mikroskopija leido gauti didžiausio herpeso virusų šeimos atstovo – žmogaus citomegaloviruso – kapsidės struktūrą (X. Yu et al., 2017. Žmogaus citomegalo viruso kapsido atominė struktūra su savo 150 psl. apsauginis apvalkalo sluoksnis). Tyrimo rezultatai tapo pagrindu ieškant galimų viruso kapsido regionų, kurie galėtų tapti antivirusinių vaistų molekuliniais taikiniais.
Arkadijus Kuramšinas
