TRABAJO DEL CURSO
Cinética de reacciones enzimáticas.
Introducción
La base de la actividad vital de cualquier organismo son los procesos químicos. Casi todas las reacciones en un organismo vivo ocurren con la participación de biocatalizadores naturales: las enzimas.
Berzelius en 1835 fue el primero en sugerir que las reacciones de un organismo vivo se llevan a cabo gracias a una nueva fuerza, a la que llamó "catalítica". Basó esta idea principalmente en la observación experimental de que la diastasa de las patatas hidroliza el almidón más rápido que el ácido sulfúrico. Ya en 1878, Kuhne llamó enzima a una sustancia que tiene poder catalítico en un organismo vivo.
La cinética de la acción enzimática es una rama de la enzimología que estudia la dependencia de la velocidad de reacción catalizada por enzimas de la naturaleza química y las condiciones de interacción del sustrato con la enzima, así como de factores ambientales. En otras palabras, la cinética enzimática nos permite comprender la naturaleza de los mecanismos moleculares de acción de los factores que afectan la tasa de catálisis enzimática. Esta sección se formó en la intersección de ciencias como la bioquímica, la física y las matemáticas. El primer intento de describir matemáticamente reacciones enzimáticas fue realizado por Duclos en 1898.
De hecho, esta sección sobre el estudio de las enzimas es muy importante en nuestro tiempo, concretamente para la medicina práctica. Proporciona a los farmacólogos una herramienta para realizar cambios específicos en el metabolismo celular, una gran cantidad de productos farmacéuticos y diversos venenos: estos son inhibidores de enzimas.
El propósito de este trabajo es considerar la dependencia de la velocidad de reacción de varios factores, cómo se puede controlar la velocidad de reacción y cómo se puede determinar.
1. Cinética de Michaelis-Menten
Experimentos preliminares que estudian la cinética de reacciones enzimáticas han demostrado que la velocidad de reacción, contrariamente a las expectativas teóricas, no depende de la concentración de la enzima (E) y el sustrato (S), como en el caso de una segunda reacción convencional. reacción de orden.
Brown y, independientemente de él, Henri fueron los primeros en plantear la hipótesis de la formación de un complejo enzima-sustrato durante la reacción. Esta suposición fue luego confirmada por tres hechos experimentales:
a) la papaína formó un compuesto insoluble con la fibrina (Wurtz, 1880);
b) el sustrato de la invertasa sacarosa podría proteger a la enzima de la desnaturalización térmica (O" Sullivan y Thompson, 1890);
c) Se demostró que las enzimas son catalizadores estereoquímicamente específicos (Fisher, 1898-1899).
Introdujeron el concepto de velocidad máxima y demostraron que curva de saturación(es decir, la dependencia de la velocidad de reacción de la concentración del sustrato) es una hipérbola equilátera. Demostraron que la velocidad máxima observada es una de las asíntotas de la curva, y el segmento cortado en el eje de abscisas (en la región de sus valores negativos) por la segunda asíntota, es decir constante en la ecuación de velocidad, igual en valor absoluto a la concentración de sustrato requerida para alcanzar la mitad de la velocidad máxima.
Michaelis y Menten sugirieron que la velocidad de reacción está determinada por la desintegración del complejo ES, es decir k constante 2 . Esto sólo es posible si k 2 - la más pequeña de las constantes de velocidad. En este caso, el equilibrio entre el complejo enzima-sustrato, la enzima libre y el sustrato se establece rápidamente en comparación con la velocidad de la reacción (equilibrio rápidamente establecido).
La velocidad de reacción inicial se puede expresar mediante la siguiente fórmula:
v = k 2
Dado que la constante de disociación del complejo enzima-sustrato es igual a
K S = [E] [S] / = k -1 /k 1
entonces la concentración de enzima libre se puede expresar como
[E] =KS / [S]
La concentración total de enzimas en la mezcla de reacción está determinada por la fórmula
[E] t = [E] + [ES] = K S [ES] / [S] + [ES]
La reacción alcanza la velocidad máxima cuando la concentración de sustrato es lo suficientemente alta como para que todas las moléculas de enzima estén presentes en forma de un complejo ES (exceso infinitamente grande de sustrato). La relación entre la velocidad inicial y la velocidad máxima teóricamente posible es igual a la relación entre [ES] y [E] t:
v / V máx = / [E] t = / (KS / [S] + ) = 1 / (KS + [S] +1)
Esta es la ecuación clásica. michaelis Y menten, que, desde su publicación en 1913, se convirtió en el principio fundamental de todos los estudios cinéticos enzimáticos durante décadas y, con algunas limitaciones, lo sigue siendo hasta el día de hoy.
Más tarde se demostró que la ecuación original de Michaelis-Menten tenía varias restricciones. Es justo, es decir describe correctamente la cinética de una reacción catalizada por una enzima determinada sólo si se cumplen todas las siguientes condiciones restrictivas:
) se forma un complejo enzima-sustrato cinéticamente estable;
) constante K S es la constante de disociación del complejo enzima-sustrato: esto es cierto sólo si ;
) la concentración del sustrato no cambia durante la reacción, es decir la concentración del sustrato libre es igual a su concentración inicial;
) el producto de la reacción se separa rápidamente de la enzima, es decir no se forma ninguna cantidad cinéticamente significativa de complejo ES;
) la segunda etapa de la reacción es irreversible; más precisamente, solo tenemos en cuenta la velocidad inicial, cuando la reacción inversa (debido a la ausencia real de producto) aún puede despreciarse;
) solo una molécula de sustrato se une a cada sitio activo de la enzima;
) para todas las sustancias reaccionantes, se pueden utilizar sus concentraciones en lugar de actividades.
La ecuación de Michaelis-Menten sirve como punto de partida para cualquier descripción cuantitativa de la acción enzimática. Cabe destacar que el comportamiento cinético de la mayoría de las enzimas es mucho más complejo que el que implica el esquema idealizado que subyace a la ecuación de Michaelis-Menten. La derivación de esta ecuación supone que sólo hay un complejo enzima-sustrato. Mientras tanto, en realidad, en la mayoría de las reacciones enzimáticas se forman al menos dos o tres de estos complejos, que ocurren en una secuencia determinada.
Aquí EZ denota el complejo correspondiente al verdadero estado de transición y EP denota el complejo entre la enzima y el producto de reacción. También se puede señalar que en la mayoría de las reacciones enzimáticas interviene más de un sustrato y, en consecuencia, se forman dos o más productos. En la reacción con dos sustratos, S 1 y S 2, se pueden formar tres complejos enzima-sustrato, a saber, ES 1, ES 2 y ES 1 S 2. Si la reacción produce dos productos, P1 y P2, entonces puede haber al menos tres complejos adicionales EP1, EP2 y EP1P2. En tales reacciones hay muchas etapas intermedias, cada una de las cuales se caracteriza por su propia constante de velocidad. El análisis cinético de reacciones enzimáticas que involucran dos o más reactivos suele ser extremadamente complejo y requiere el uso de computadoras electrónicas. Sin embargo, al analizar la cinética de todas las reacciones enzimáticas, el punto de partida es siempre la ecuación de Michaelis-Menten comentada anteriormente.
1.1 Naturaleza de la constanteken la ecuación
ecuación cinética de reacción enzimática
El segundo postulado establece que la constante K S en la ecuación está la constante de disociación del complejo enzima-sustrato.
Briggs y Haldane demostraron en 1925 que la ecuación original de Michaelis-Menten es válida sólo para , es decir, cuando el equilibrio de la etapa elemental E+S ES se establece muy rápidamente en comparación con la velocidad de la siguiente etapa. Por lo tanto, se dice que tales mecanismos cinéticos (sujetos a la condición inicial de Michaelis-Menten y que tienen una etapa elemental lenta, con respecto a la cual los equilibrios en todas las demás etapas elementales se establecen rápidamente) satisfacen el supuesto de “equilibrio rápido”. Sin embargo, si k 2 es comparable en orden de magnitud a k -1 ,
El cambio en la concentración del complejo enzima-sustrato a lo largo del tiempo se puede expresar mediante la siguiente ecuación diferencial:
d / dt = k 1 [E] [S] - k -1 - k 2
Dado que estamos considerando la velocidad de reacción inicial, es decir momento en el que la reacción inversa aún no ha ocurrido y la etapa preparatoria ya ha pasado, entonces, debido a un exceso de sustrato, la cantidad del complejo enzima-sustrato formado es igual a la cantidad de desintegrado ( principio de estacionariedad, o cinética de Briggs y Haldane, o principio de Bodenstein en cinética química) y es cierto que
d/dt=0
Sustituyendo esto en la ecuación diferencial, obtenemos una expresión para la concentración de enzima libre:
[E] = (k -1 + k 2) / k 1 [S]
[E] T = [E] + = [(k -1 + k 2) / k -1 [S] + 1] =
= (k -1 + k 2 + k -1 [S]) / k 1 [S]
Ecuación de estado estacionario:
K 1 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S])
Porque v = k 2 , entonces obtenemos que
v = k 1 k 2 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S]) = k 2 [S] [E] T / [(k -1 + k 2) / k 1 + [S]]
En este caso
V máx = k 2 [E] T
y es igual a la velocidad máxima obtenida de la ecuación de Michaelis-Menten. Sin embargo, la constante en el denominador de la ecuación de Michaelis-Menten no es K S ,
aquellos. no la constante de disociación del complejo enzima-sustrato, sino la llamada Constante de Michaelis:
K metro = (k -1 + k 2) / k 1
K m es igual a K S sólo si .
En el caso de una constante en el denominador de la ecuación de velocidad, se expresa mediante la fórmula
K k = k 2 / k 1
y se llama, según Van Slyke, constante cinética.
La ecuación de estado estacionario también se puede obtener a partir de la ecuación diferencial sin asumir que d / dt = 0. Si sustituimos el valor [E] = [E] T - en la ecuación diferencial, después de las transformaciones obtenemos
= (k 1 [S] [E] T - d / dt) / (k 1 [S] + k -1 + k 2)
Para obtener la ecuación de estado estacionario a partir de esta ecuación, no es necesario que d / dt = 0. Basta con que se cumpla la desigualdad d / dt<< k 1 [S] [E] T . Этим объясняется, почему можно достичь хорошего приближения в течение длительного времени при использовании принципа стационарности.
La ecuación de estado estacionario diferenciada es la siguiente:
d / dt = T / (k 1 [S] + k -1 + k 2) 2 ] (d [S] / dt)
Esta expresión obviamente no es igual a 0.
1.2 Transformación de la ecuación de Michaelis-Menten
La ecuación de Michaelis-Menten original es una ecuación de hipérbola, donde una de las constantes (V máx) es la asíntota de la curva. Otra constante (K m), cuyo valor negativo está determinado por la segunda asíntota, es igual a la concentración de sustrato necesaria para alcanzar V max / 2. Esto es fácil de verificar, ya que si
v=V máx / 2, entonces
V máx / 2 = V máx [S] / (K m + [S])
V máx / V máx = 1 = 2 [S] / (K m + [S]) m + [S] = 2 [S], es decir [S] = K m en v = V máx /2.
La ecuación de Michaelis-Menten se puede transformar algebraicamente en otras formas que sean más convenientes para la representación gráfica de datos experimentales. Una de las transformaciones más comunes simplemente se reduce a igualar los recíprocos de los lados izquierdo y derecho de la ecuación entre sí.
Como resultado de la transformación obtenemos la expresión
Lo que es llamado Ecuaciones de Lineweaver-Burk. Según esta ecuación, la gráfica trazada en las coordenadas 1/[S] y 1/v es una línea recta cuya pendiente es igual a K m /V max, y el segmento cortado en el eje de ordenadas es igual a 1 /V máx. Un gráfico de este tipo, construido mediante el método del doble recíproco, tiene la ventaja de que permite determinar con mayor precisión Vmax; en una curva trazada en las coordenadas [S] y v, Vmax es un valor asintótico y se determina con mucha menos precisión. El segmento cortado en el eje x del gráfico de Lineweaver-Burk es igual a -1/K m. De este gráfico también se puede obtener información valiosa sobre la inhibición de enzimas.
Otra transformación de la ecuación de Michaelis-Menten es que ambos lados de la ecuación de Lineweaver-Burk se multiplican por V max *v y después de algunas transformaciones adicionales obtenemos
La gráfica correspondiente en las coordenadas v y v/[S] representa con mi 4, fig. 1]. Tal horario ( Gráfico de Edie-Hofstee) no sólo permite determinar de forma muy sencilla los valores de V max y K m , sino que también permite identificar posibles desviaciones de la linealidad que no se detectan en el gráfico de Lineweaver-Burk.
La ecuación también se puede linealizar de otra forma.
[S] / v = K m / V máx + [S] / V máx
En este caso, se debe representar gráficamente la dependencia de [S] / v de [S]. La pendiente de la recta resultante es 1/V máx; los segmentos cortados en los ejes de ordenadas y abscisas son iguales a (K m / V max) y (- K m), respectivamente. Este gráfico lleva el nombre del autor. gráfico de haynes.
El análisis estadístico mostró que los métodos de Edie-Hofstee y Haynes proporcionan resultados más precisos que el método de Lineweaver-Burk. La razón de esto es que en los gráficos de Edie-Hofstee y Haynes, tanto las variables dependientes como las independientes se incluyen en las cantidades representadas en ambos ejes de coordenadas.
1.3 Efecto de la concentración del sustrato sobre la cinética de la reacción.
En muchos casos, no se cumple la condición de concentración constante del sustrato. Por un lado, el exceso de sustrato no se utiliza en reacciones in vitro con algunas enzimas debido a la frecuente inhibición de la actividad enzimática del sustrato. En este caso, sólo se puede utilizar su concentración óptima, y ésta no siempre proporciona el exceso de sustrato necesario para cumplir las ecuaciones cinéticas de los mecanismos discutidos anteriormente. Además, en una célula in vivo, normalmente no se consigue el exceso de sustrato necesario para alcanzar esta condición.
En reacciones enzimáticas, donde el sustrato no está en exceso y, por tanto, su concentración cambia durante la reacción, la constante de disociación del complejo enzima-sustrato es igual a
K S = ([S] 0 - - [P]) [E] T - )/
([S] 0 - concentración de sustrato en t = 0). En este caso, la velocidad de reacción inicial (en estado estacionario) está determinada por la fórmula
v= V máx / (K m + )
¿Dónde está la concentración del sustrato a la vez?
Sin embargo, es posible escribir una solución aproximada para dos casos cuando [S] o = :
) si esta desigualdad se cumple debido a valores grandes de t, es decir cuando durante la reacción se consume más del 5% de la concentración inicial del sustrato;
) si no se puede despreciar la concentración de enzima en comparación con la concentración de sustrato y, por lo tanto, se debe tener en cuenta la concentración del complejo enzima-sustrato.
Si t es grande y la concentración es insignificante en comparación con [S]0, entonces la ecuación para la constante de disociación del complejo enzima-sustrato se convierte en la siguiente:
K S = ([S] 0 - [P]) ([E] T - ) /
Para el valor de concentración que cambia durante la reacción, una aproximación satisfactoria es el valor ([S] 0 + )/2. Puesto que = [S] 0 - [P], velocidad promedio; se puede expresar como
Sustituyendo esta expresión y el valor aproximado en
v= V máx / (K m + ),
obtenemos:
Al comparar los valores calculados a partir de esta aproximación con los valores obtenidos de la ecuación exacta e integrada de Michaelis-Menten, resulta que el error en la determinación de K m es de 1 y 4% al consumir el 30 y 50% del sustrato, respectivamente. En consecuencia, el error en esta aproximación es insignificante en comparación con el error de medición.
Cuando el consumo de sustrato no supera el 5% de la concentración inicial, pero la concentración de enzima es tan alta que en comparación con [S] 0 no se puede ignorar, la constante de disociación del complejo enzima-sustrato es igual a:
K s = ([S] 0 - ) ([E] T - ) /
Su solución da relativamente
De las dos soluciones posibles sólo se puede elegir la negativa, ya que sólo ésta satisface las condiciones iniciales: = 0 con [S] 0 = 0 o [E] T = 0. Por analogía con la ecuación de la relación v/V max, obtuvimos la ecuación para la velocidad inicial. La ecuación cuadrática obtenida de la ecuación de la constante de disociación del complejo enzima-sustrato, que se encuentra justo arriba, usando las fórmulas v = k 2 y V max = k 2 [E] T, se puede reducir a la siguiente forma:
[S] 0 V máx / v = K s V máx / (V máx - v) + [E] T
Hay dos casos límite a considerar. En el primer caso [S]<
v = (V máx / K m) [S] = k[S]
Por tanto, hemos obtenido una reacción aparente de primer orden y k=V max /K m - una constante cinética aparente de primer orden. Su dimensión real es el tiempo -1, pero es una combinación de las constantes de velocidad de primer y segundo orden de varias etapas elementales, es decir k 1 k 2 [E] T /(k -1 + k 2) . En condiciones aparentes de primer orden k es una medida del progreso de la reacción.
Otro caso extremo: [S] >>
Km.
Aquí la constante K m
es insignificante en comparación con [S], por lo que obtenemos v = V max.
1.4 Formación de un complejo enzima-producto cinéticamente estable
Si durante una reacción se forma un complejo enzima-producto cinéticamente estable, el mecanismo de reacción es el siguiente:
Usando el supuesto de estado estacionario, podemos escribir las ecuaciones diferenciales:
d /dt = k 1 [E] [S] + k -2 - (k -1 + k 2) = 0 /dt = k 2 - (k -2 + k 3) = 0
De estas ecuaciones se deduce que
= [(k -2 + k 3) / k 2 ]
[E] = [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S]]
Dado que v = k 3
y [E] T = [E] + + =
= [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S] + (k -2 + k 3) / k 2 + 1] =
= ( (k -2 + k 3) + k 1 k 2 [S]] / k 1 k 2 [S])
obtenemos
K 1 k 2 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2)]= k 1 k 2 k 3 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2) ] =
= [E] T [S] / [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2) + [S]]
Eso es
V máx = [E] Tm = (k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2)
En este caso, ya resulta muy difícil calcular los valores específicos de las constantes de velocidad individuales, ya que sólo se puede medir directamente su relación. La situación se vuelve aún más complicada cuando el mecanismo de una reacción enzimática se vuelve más complejo, cuando en la reacción intervienen más de dos complejos, porque el número de constantes de velocidad en la ecuación es naturalmente mucho mayor y sus relaciones también son más complejas.
Sin embargo, la situación se simplifica si, después de la reacción reversible de formación del primer complejo, las etapas elementales posteriores son irreversibles. Representantes importantes de las enzimas que obedecen a este mecanismo son las enzimas proteolíticas y las esterasas. El mecanismo de su reacción se puede escribir de la siguiente manera:
donde ES` es un intermedio acil-enzima que se descompone cuando se expone al agua. Podemos escribir
V max = k 2 k 3 [E] 0 / (k 2 + k 3) = k gato [E] 0m = k 3 (k -1 + k 2) / (k 2 + k 3) k 1 gato / K m = k 2 k 1 / (k -1 + k 2) = k 2 / K m '
La constante de Michaelis de la etapa de acilación es K m " K s. Cuanto mayor sea la relación k cat /K m, mayor será la especificidad del sustrato.
La determinación de las constantes se simplifica enormemente si el experimento se realiza en presencia de un agente nucleofílico (N) que pueda competir con el agua. Entonces
k 3 = k 3 ’ y P i (i = 1, 2, 3) son productos.
v i = k gato, i [S] / (K m + [S]) gato, 1 = k 2 (k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) gato, 2 = k 2 k 3 / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) gato, 3 = k 2 k 4 [N] / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) m = K s ( k 3 + k 4 [norte]) / (k 2 + k 3 + k 4 [norte])
/v N = K s (k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3 [S] + (k 2 + k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3
Como se sabe que K s / k 2 = K m / k gato, y si no hay nucleófilo, entonces
1/v = K s / k 2 [S] + (k 2 + k 3) / k 2 k 3
y para determinar las constantes, puedes utilizar el punto de intersección de las rectas en las coordenadas 1/v N (y 1/v) - 1/[S]. Dos rectas en coordenadas dobles inversas se cruzan en el segundo cuadrante. En ausencia de un nucleófilo, el punto de intersección de la línea recta con el eje vertical se define como 1/V max y 1/k cat, y con el eje horizontal, como -1/K m. Coordenadas del punto de intersección de dos rectas: -1/K s y 1/k 3. La distancia entre 1/V max y 1/k 3 es 1/k 2.
1.5 Análisis de la curva cinética de reacción completa
La ecuación de Michaelis-Menten en su forma original se aplica sólo a reacciones irreversibles, es decir a reacciones donde solo se considera la velocidad inicial, y la reacción inversa no ocurre debido a una cantidad insuficiente de producto y no afecta la velocidad de reacción. En el caso de una reacción irreversible, la curva cinética completa se puede analizar fácilmente (para un intervalo de tiempo arbitrario t ),
integrando la ecuación original de Michaelis-Menten. Por lo tanto, en este caso se mantiene la suposición de que durante la reacción sólo se forma un complejo intermedio enzima-sustrato. Dado que para el intervalo de tiempo t
no se imponen restricciones; la concentración del sustrato en el momento del análisis no puede ser igual a su concentración introducida inicialmente. Por tanto, también se debe tener en cuenta el cambio de [S] durante la reacción. Sea S 0 la concentración inicial del sustrato, (S 0 - y )
- concentración en el tiempo t .
Luego, basándose en la ecuación original de Michaelis-Menten (si y
- cantidad de sustrato convertido), podemos escribir
dy / dt = V máx (S 0 - y) / (K m +S 0 - y)
Tomando los recíprocos y dividiendo las variables, integramos sobre y
que van de 0 a y
(V máx se designa como V):
(2,303/t) log = V/Km - (1/Km) (y/t)
Por lo tanto, habiendo trazado la dependencia del lado izquierdo de la ecuación con y/t (coordenadas de Foster-Niemann) ,
obtenemos una recta con pendiente (-1/K m) ,
cortando el segmento en el eje de ordenadas (V/K m) ,
y en el eje x está el segmento V. La ecuación integral también se puede linealizar de otra manera:
t / 2,3031 lg = y / 2,303 V lg + K m / V
o t/y = 2,3031 K m lg / V y +1/V
Si estamos estudiando una reacción reversible, debemos prestar atención al intervalo de tiempo con el que estamos tratando. En el momento de mezclar la enzima con el sustrato comienza la denominada fase preestacionaria, que dura varios micro o milisegundos, durante la cual se forman complejos enzima-sustrato correspondientes al estado estacionario. Al estudiar reacciones reversibles durante períodos de tiempo bastante largos, esta fase no juega un papel importante, ya que en esta fase la reacción no avanza a toda velocidad en ninguna dirección.
En una reacción que se desarrolla de izquierda a derecha, los complejos enzima-sustrato que participan en la reacción alcanzan la concentración límite de velocidad sólo al final de la fase preestacionaria. Estado cuasi estacionario, en el que las concentraciones de complejos enzima-sustrato que determinan la velocidad se acercan a los valores de concentración máxima en estado estacionario, dura varias décimas de segundo o un segundo. Durante esta fase, la tasa de formación de producto (o consumo de sustrato) es casi lineal en el tiempo. Teóricamente, la formación del producto aún no ha ocurrido, pero en la práctica su concentración es tan baja que la velocidad de la reacción inversa no afecta la velocidad de la reacción directa. Esta fase lineal se llama velocidad de reacción inicial y hasta ahora solo la hemos tenido en cuenta.
La reacción de derecha a izquierda en la siguiente fase también se acelera debido al aumento gradual de la concentración del producto. (estado de transición; la linealidad observada hasta ahora en el tiempo desaparece). Esta fase continúa hasta que la velocidad de reacción de izquierda a derecha se vuelve igual a la velocidad de reacción de derecha a izquierda. Este es un estado balance dinámico, ya que la reacción continúa continuamente en ambas direcciones a la misma velocidad.
2. Factores de los que depende la velocidad de la reacción enzimática.
.1 Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática de la temperatura.
A medida que aumenta la temperatura del ambiente, la velocidad de la reacción enzimática aumenta, alcanza un máximo a una temperatura óptima y luego cae a cero. Para las reacciones químicas, existe la regla de que cuando la temperatura aumenta 10°C, la velocidad de reacción aumenta de dos a tres veces. Para las reacciones enzimáticas, este coeficiente de temperatura es menor: por cada 10°C, la velocidad de reacción aumenta 2 veces o incluso menos. La posterior disminución de la velocidad de reacción a cero indica la desnaturalización del bloque enzimático. Los valores de temperatura óptimos para la mayoría de las enzimas están en el rango de 20 a 40 0 °C. La termolabilidad de las enzimas está asociada con su estructura proteica. Algunas enzimas ya se desnaturalizan a una temperatura de aproximadamente 40 0 ° C, pero la mayor parte de ellas se inactiva a temperaturas superiores a 40 - 50 0 C. Algunas enzimas se inactivan con el frío, es decir, a temperaturas cercanas a 0°C se produce la desnaturalización.
Un aumento de la temperatura corporal (fiebre) acelera las reacciones bioquímicas catalizadas por enzimas. Es fácil calcular que cada grado de aumento en la temperatura corporal aumenta la velocidad de reacción en aproximadamente un 20%. A temperaturas elevadas, de unos 39-40°C, el desperdicio de sustratos endógenos en las células de un organismo enfermo debe reponerse con alimentos. Además, a una temperatura de unos 40°C, algunas enzimas muy termolábiles pueden desnaturalizarse, lo que altera el curso natural de los procesos bioquímicos.
La baja temperatura provoca la inactivación reversible de las enzimas debido a un ligero cambio en su estructura espacial, pero suficiente para alterar la configuración adecuada del centro activo y las moléculas del sustrato.
2.2 Dependencia de la velocidad de reacción del pH del medio
La mayoría de las enzimas tienen un valor de pH específico en el que su actividad es mayor; Por encima y por debajo de este valor de pH, la actividad de estas enzimas disminuye. Sin embargo, no en todos los casos las curvas que describen la dependencia de la actividad enzimática del pH tienen forma de campana; a veces esta dependencia también puede expresarse directamente. La dependencia de la velocidad de una reacción enzimática del pH indica principalmente el estado de los grupos funcionales del centro activo de la enzima. Un cambio en el pH del medio afecta la ionización de grupos ácidos y básicos de residuos de aminoácidos del centro activo, que participan en la unión del sustrato (en el sitio de contacto) o en su transformación (en el sitio catalítico). ). Por lo tanto, el efecto específico del pH puede ser causado por un cambio en la afinidad del sustrato por la enzima, o por un cambio en la actividad catalítica de la enzima, o ambas razones juntas.
La mayoría de los sustratos tienen grupos ácidos o básicos, por lo que el pH afecta el grado de ionización del sustrato. La enzima se une preferentemente a la forma ionizada o no ionizada del sustrato. Obviamente, a un pH óptimo, los grupos funcionales del sitio activo están en el estado más reactivo y el sustrato está en una forma preferida para la unión de estos grupos enzimáticos.
Al construir curvas que describen la dependencia de la actividad enzimática del pH, las mediciones en todos los valores de pH generalmente se llevan a cabo en condiciones de saturación de la enzima con el sustrato, ya que el valor de K m para muchas enzimas cambia con los cambios de pH.
La curva que caracteriza la dependencia de la actividad enzimática del pH puede tener una forma particularmente simple en los casos en que la enzima actúa sobre sustratos electrostáticamente neutros o sustratos en los que los grupos cargados no desempeñan un papel significativo en el acto catalítico. Un ejemplo de tales enzimas es la papaína, así como la invertasa, que cataliza la hidrólisis de moléculas neutras de sacarosa y mantiene una actividad constante en el rango de pH de 3,0 a 7,5.
El valor de pH correspondiente a la actividad enzimática máxima no coincide necesariamente con el valor de pH característico del ambiente intracelular normal de esta enzima; este último puede estar tanto por encima como por debajo del pH óptimo. Esto sugiere que el efecto del pH sobre la actividad enzimática puede ser uno de los factores responsables de regular la actividad enzimática dentro de la célula. Dado que la célula contiene cientos de enzimas y cada una de ellas reacciona de manera diferente a los cambios de pH, el valor del pH dentro de la célula es quizás uno de los elementos importantes en el complejo sistema de regulación del metabolismo celular.
2.3 Determinación de la cantidad de enzima por su actividad.
) la estequiometría general de la reacción catalizada;
) posible necesidad de cofactores: iones metálicos o coenzimas;
) dependencia de la actividad enzimática de las concentraciones de sustrato y cofactor, es decir Valores de K m tanto para sustrato como para cofactor;
) valor de pH correspondiente a la actividad enzimática máxima;
) rango de temperatura en el que la enzima es estable y conserva una alta actividad.
Además, es necesario tener a disposición alguna técnica analítica bastante sencilla que permita determinar la velocidad de desaparición del sustrato o la velocidad de aparición de los productos de reacción.
Siempre que sea posible, los ensayos enzimáticos se realizan en condiciones estándar que mantienen el pH óptimo y las concentraciones de sustrato por encima de la concentración de saturación; en este caso, la velocidad inicial corresponde a una reacción de orden cero con respecto al sustrato y es proporcional únicamente a la concentración de la enzima. Para las enzimas que requieren cofactores (iones metálicos o coenzimas), la concentración de estos cofactores también debe exceder la concentración de saturación, de modo que la concentración de la enzima sea el factor limitante de la velocidad de la reacción. Normalmente, medir la velocidad de formación de producto se puede realizar con mayor precisión que medir la velocidad de desaparición del sustrato, ya que el sustrato normalmente debe estar presente en concentraciones relativamente altas para mantener la cinética de orden cero. La velocidad de formación del producto (o productos) de reacción se puede medir mediante métodos químicos o fotométricos. El segundo método es más conveniente porque le permite registrar continuamente el progreso de la reacción en la grabadora.
Según el acuerdo internacional, se considera unidad de actividad enzimática la cantidad de enzima capaz de provocar la conversión de un micromol de sustrato por minuto a 25°C en condiciones óptimas. Actividad específica enzima es el número de unidades de actividad enzimática por 1 mg de proteína. Este valor se utiliza como criterio para la pureza de la preparación enzimática; aumenta a medida que la enzima se purifica y alcanza su valor máximo para una preparación idealmente pura. Bajo número de revoluciones comprender el número de moléculas de sustrato que se convierten por unidad de tiempo por molécula de enzima (o por centro activo) en condiciones en las que la velocidad de reacción está limitada por la concentración de enzima.
2.4 Activación enzimática
La regulación de las enzimas se puede llevar a cabo mediante la interacción con ellas de varios componentes biológicos o compuestos extraños (por ejemplo, drogas y venenos), que comúnmente se denominan modificadores o reguladores enzimas. Bajo la influencia de modificadores de la enzima, la reacción puede acelerarse (activadores) o ralentizarse. ( inhibidores).
La activación enzimática está determinada por la aceleración de reacciones bioquímicas que se produce tras la acción del modificador. Un grupo de activadores está formado por sustancias que afectan la región del centro activo de la enzima. Estos incluyen cofactores y sustratos enzimáticos. Los cofactores (iones metálicos y coenzimas) no sólo son elementos estructurales obligatorios de enzimas complejas, sino también esencialmente sus activadores.
Los iones metálicos son activadores bastante específicos. A menudo, algunas enzimas requieren iones no de uno, sino de varios metales. Por ejemplo, para Na + , K + -ATPasa, que transporta cationes monovalentes a través de la membrana celular, se necesitan iones de magnesio, sodio y potasio como activadores.
La activación con iones metálicos se produce a través de diferentes mecanismos. En algunas enzimas forman parte del sitio catalítico. En algunos casos, los iones metálicos facilitan la unión del sustrato al centro activo de la enzima, formando una especie de puente. A menudo, el metal no se combina con la enzima, sino con el sustrato, formando un complejo metal-sustrato, que es preferible para la acción de la enzima.
La especificidad de la participación de las coenzimas en la unión y catálisis del sustrato explica su activación de reacciones enzimáticas. El efecto activador de los cofactores es especialmente notable cuando actúan sobre una enzima que no está saturada de cofactores.
El sustrato también es un activador dentro de ciertos límites de concentración. Después de alcanzar concentraciones saturadas del sustrato, la actividad enzimática no aumenta. El sustrato aumenta la estabilidad de la enzima y facilita la formación de la conformación deseada del centro activo de la enzima.
Iones metálicos, coenzimas y sus precursores y análogos activos,
Los sustratos se pueden utilizar en la práctica como fármacos activadores de enzimas.
La activación de algunas enzimas se puede realizar mediante modificaciones que no afectan el centro activo de sus moléculas. Hay varias opciones para esta modificación:
1) activación de un predecesor inactivo - proenzima, o zimógeno. Por ejemplo, la conversión de pepsinógeno en pepsina. ;
2) activación uniendo cualquier grupo modificador específico a la molécula de enzima;
3) activación por disociación del complejo proteína inactiva-enzima activa.
2.5 Inhibición enzimática
Hay reactivos que pueden interactuar de forma más o menos específica con una u otra cadena lateral de proteínas, lo que conduce a la inhibición de la actividad enzimática. Este fenómeno permite estudiar la naturaleza de los residuos secundarios de aminoácidos implicados en esta reacción enzimática. Sin embargo, en la práctica hay que tener en cuenta numerosas sutilezas, lo que hace que una interpretación inequívoca de los resultados obtenidos con inhibidores específicos sea bastante difícil y, a menudo, cuestionable. En primer lugar, para que una reacción con un inhibidor sea adecuada para estudiar la naturaleza de las cadenas laterales implicadas en la reacción, debe cumplir los siguientes criterios:
) ser específico, es decir el inhibidor debe bloquear sólo los grupos deseados;
) inhiben la actividad enzimática, y esta inhibición debería completarse a medida que aumenta el número de grupos modificados;
) el reactivo no debe provocar una desnaturalización inespecífica de la proteína.
Hay 2 grupos de inhibidores: reversibles e irreversibles. La división se basa en el criterio de restauración de la actividad enzimática después de la diálisis o una fuerte dilución de una solución enzimática con un inhibidor.
Según el mecanismo de acción se distinguen la inhibición competitiva, no competitiva, no competitiva, de sustrato y alostérica.
Inhibición competitiva
La inhibición competitiva se descubrió estudiando la inhibición causada por análogos de sustrato. Se trata de la inhibición de una reacción enzimática causada por la unión al centro activo de la enzima de un inhibidor de estructura similar al sustrato y que previene la formación de un complejo enzima-sustrato. En la inhibición competitiva, el inhibidor y el sustrato, al ser similares en estructura, compiten por el sitio activo de la enzima. El compuesto de moléculas que es de mayor tamaño está asociado al centro activo.
Estas ideas sobre el mecanismo de inhibición fueron confirmadas por experimentos sobre la cinética de reacciones de inhibición competitiva. Así, se demostró que en el caso de inhibición competitiva, el análogo del sustrato no afecta la velocidad de descomposición del complejo enzima-sustrato ya formado, es decir, cuando se utiliza un exceso de sustrato "infinitamente grande", se obtiene la misma velocidad máxima tanto en presencia como en ausencia del inhibidor. Por el contrario, el inhibidor afecta el valor de la constante de disociación y la constante de Michaelis. De esto podemos concluir que el inhibidor reacciona con grupos de proteínas involucrados de una forma u otra en la unión del sustrato, por lo tanto, debido a su interacción con estos grupos, la fuerza de unión del sustrato disminuye (es decir, la cantidad de moléculas de enzima capaces de la unión del sustrato disminuye).
Posteriormente se demostró que la inhibición cinéticamente competitiva puede ser causada no solo por análogos del sustrato, sino también por otros reactivos cuya estructura química es completamente diferente de la estructura del sustrato. En estos casos, también se asumió que el reactivo interactúa con el grupo responsable de la unión del sustrato.
Para la inhibición competitiva, existen teóricamente dos posibilidades:
1) los centros de unión y catalíticos de la enzima se superponen; el inhibidor se une a ellos, pero afecta sólo a los grupos del centro de unión;
2) el centro de unión y el centro catalítico de la molécula de enzima están separados espacialmente; el inhibidor interactúa con el sitio de unión.
donde I es un inhibidor y KI es la constante de disociación del complejo enzima-inhibidor.
Tasa relativa (relación de la velocidad de una reacción enzimática medida en presencia de un inhibidor (v i) ,
a velocidad máxima) es igual a
v i / V = / [E] T
ya que para la concentración total de enzimas es cierto
[E] T = [E] + +
entonces 1 / v i = (K s / V[S]) (1 + [I] / K I) + 1 / V
Obviamente, si [I] = K I , entonces la pendiente de la línea recta se vuelve dos veces mayor que para la dependencia de 1/v 0 de [S] (v 0 es la velocidad de la reacción enzimática en ausencia de un inhibidor).
El tipo de inhibición suele determinarse gráficamente. La inhibición competitiva se reconoce más fácilmente al trazar diagramas de Lineweaver-Burk (es decir, diagramas en coordenadas 1/vi y 1/[S]) a diferentes concentraciones de inhibidor. Con una verdadera inhibición competitiva se obtiene un conjunto de rectas que se diferencian por la tangente del ángulo de inclinación y que cortan el eje de ordenadas (eje 1/v i) en un punto. A cualquier concentración de inhibidor, es posible utilizar una concentración de sustrato tan alta que la actividad enzimática sea máxima.
Un ejemplo de inhibición competitiva es el efecto de diversas sustancias sobre la actividad de la succinato deshidrogenasa. Esta enzima es parte del sistema enzimático cíclico: el ciclo de Krebs. Su sustrato natural es el succinato y un inhibidor competitivo similar es el oxalacetato, un producto intermedio del mismo ciclo de Krebs:
Un inhibidor competitivo similar de la succinato deshidrogenasa es el ácido malónico, que se utiliza a menudo en estudios bioquímicos.
El principio de inhibición competitiva es la base de la acción de muchos fármacos, pesticidas utilizados para destruir plagas agrícolas y agentes de guerra química.
Por ejemplo, un grupo de fármacos anticolinesterásicos, que incluyen derivados de bases de amonio cuaternario y compuestos organofosforados, son inhibidores competitivos de la enzima colinesterasa en relación con su sustrato acetilcolina. La colinesterasa cataliza la hidrólisis de la acetilcolina, mediador de los sistemas colinérgicos (sinapsis neuromusculares, sistema parasimpático, etc.). Las sustancias anticolinesterasa compiten con la acetilcolina por el sitio activo de la enzima, se unen a él y desactivan la actividad catalítica de la enzima. Fármacos como prozerin, fisostigmina, sevin inhiben la enzima de forma reversible y fármacos organofosforados como armin, nibufin, clorofos y soman actúan de forma irreversible, fosforilando el grupo catalítico de la enzima. Como resultado de su acción, la acetilcolina se acumula en aquellas sinapsis donde es mediador de la excitación nerviosa, es decir, el cuerpo está envenenado por la acetilcolina acumulada. El efecto de los inhibidores reversibles desaparece gradualmente, ya que cuanto más se acumula acetilcolina, más rápido desplaza al inhibidor del centro activo de la colinesterasa. La toxicidad de los inhibidores irreversibles es incomparablemente mayor, por lo que se utilizan para combatir plagas agrícolas, insectos domésticos y roedores (por ejemplo, clorofos) y como agentes de guerra química (por ejemplo, sarín, somán, etc.).
Inhibición no competitiva
En la inhibición no competitiva, el inhibidor específico no afecta la constante de disociación del complejo enzima-sustrato. Por otro lado, la velocidad máxima de reacción alcanzable es menor en presencia de un inhibidor que en su ausencia, incluso con un exceso infinitamente grande de sustrato. La presencia de inhibición demuestra que el inhibidor se une a la proteína. La invariancia de la constante de disociación tanto en presencia como en ausencia del inhibidor, a su vez, indica que, a diferencia del sustrato, el inhibidor se une a un grupo diferente. Desde un punto de vista teórico, el mecanismo de tal inhibición puede interpretarse de varias maneras.
a) El centro de unión y el centro catalítico de la enzima son diferentes. En este caso, el inhibidor asociado al centro catalítico reduce la actividad de la enzima y el máximo alcanzado.
velocidad sin afectar la formación del complejo enzima-sustrato.
b) El centro de unión y el centro catalítico se superponen por
superficie de la enzima y el inhibidor se une a otros grupos de la proteína. Debido a la unión del inhibidor a la superficie de la enzima, la información de la proteína cambia y se vuelve desfavorable para la catálisis.
c) El inhibidor no se une ni al sitio catalítico ni al sitio de unión, y no afecta la conformación de la proteína. Sin embargo, puede cambiar localmente la distribución de carga en una región de la superficie de la proteína. La inhibición de la actividad también puede ocurrir en este caso si, por ejemplo, la ionización de grupos esenciales para la manifestación de la actividad se vuelve imposible o si, por el contrario, se produce la ionización de grupos activos sólo en forma no ionizada. Este fenómeno se observa principalmente cuando se utilizan reactivos fuertemente ácidos o fuertemente alcalinos.
El inhibidor y el sustrato no afectan la unión de cada uno a la enzima, pero los complejos enzimáticos que contienen el inhibidor están completamente inactivos. En este caso, podemos asumir las siguientes etapas elementales:
v i / V = / [E] T
[E] T = [E] + + +
/ v i = (K s / V [S]) (1 + [I] / K I) + (1 / V) (1 + [I] / K I)
Si [I] = K I las pendientes de las rectas y la ordenada del punto de intersección con el eje vertical se duplican respecto a 1/v 0.
Los inhibidores no competitivos son, por ejemplo, los cianuros, que se unen fuertemente al hierro férrico, que forma parte del sitio catalítico de la enzima hemina, la citocromo oxidasa. El bloqueo de esta enzima apaga la cadena respiratoria y la célula muere. Los inhibidores de enzimas no competitivos incluyen iones de metales pesados y sus compuestos orgánicos. Por tanto, los iones de metales pesados de mercurio, plomo, cadmio, arsénico y otros son muy tóxicos. Bloquean, por ejemplo, los grupos SH incluidos en el sitio catalítico de la enzima.
Los inhibidores no competitivos son los cianuros, que se unen estrechamente al hierro férrico, que forma parte del sitio catalítico de la enzima hemina, la citocromo oxidasa. El bloqueo de esta enzima apaga la cadena respiratoria y la célula muere. Es imposible eliminar el efecto de un inhibidor no competitivo con un exceso de sustrato (como el efecto de uno competitivo), sino solo con sustancias que se unen al inhibidor: los reactivadores.
Los inhibidores no competitivos se utilizan como agentes farmacológicos, sustancias venenosas para controlar plagas agrícolas y con fines militares. En medicina se utilizan medicamentos que contienen mercurio, arsénico y bismuto, que inhiben de forma no competitiva las enzimas de las células del cuerpo o las bacterias patógenas, lo que determina uno u otro de sus efectos. Durante la intoxicación, la unión del veneno o su desplazamiento del complejo enzima-inhibidor es posible con la ayuda de reactivadores. Estos incluyen todas las complexonas que contienen SH (cisteína, dimercaptopropanol), ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético, etc.
Inhibición no competitiva
Este tipo de inhibición también se denomina anticompetitiva en la literatura. o inhibición asociada , sin embargo, el término inhibición no competitiva es el más utilizado. La característica de este tipo de inhibición es que el inhibidor no es capaz de unirse a la enzima, pero sí al complejo enzima-sustrato.
En el caso de inhibición no competitiva, el complejo que contiene el inhibidor está inactivo:
v i / V = / [E]
[E] T = [E] + +
/ v i = K s / V[S] + (1 / V) (1 + [I] / K I)
Inhibición del sustrato
La inhibición de sustrato es la inhibición de una reacción enzimática causada por un exceso de sustrato. Esta inhibición se produce debido a la formación de un complejo enzima-sustrato que no es capaz de sufrir transformaciones catalíticas. El complejo ES 2 es improductivo y inactiva la molécula de enzima. La inhibición del sustrato es causada por un exceso de sustrato y por lo tanto se alivia cuando su concentración disminuye.
inhibición alostérica
La regulación alostérica es característica únicamente de un grupo especial de enzimas con una estructura cuaternaria que tienen centros reguladores para unir efectores alostéricos. Los efectores negativos que inhiben la conversión del sustrato en el sitio activo de la enzima actúan como inhibidores alostéricos. Los efectores alostéricos positivos, por el contrario, aceleran la reacción enzimática y, por tanto, se clasifican como activadores alostéricos. Los efectores alostéricos de las enzimas suelen ser varios metabolitos, así como hormonas, iones metálicos y coenzimas. En casos raros, el papel de efector alostérico de las enzimas lo desempeñan moléculas de sustrato.
El mecanismo de acción de los inhibidores alostéricos sobre la enzima es cambiar la conformación del centro activo. Una disminución en la velocidad de una reacción enzimática es una consecuencia de un aumento en K m o un resultado de una disminución en la velocidad máxima V max a las mismas concentraciones saturantes del sustrato, es decir, la enzima está parcialmente inactiva.
Las enzimas alostéricas se diferencian de otras enzimas por tener una curva especial en forma de S de velocidad de reacción versus concentración de sustrato. Esta curva es similar a la curva de saturación de oxígeno de la hemoglobina; indica que los centros activos de las subunidades no funcionan de forma autónoma, sino cooperativa, es decir. la afinidad de cada centro activo posterior por el sustrato está determinada por el grado de saturación de los centros anteriores. El trabajo coordinado de los centros está determinado por efectores alostéricos.
La regulación alostérica se manifiesta en forma de inhibición por el producto final de la primera enzima de la cadena. La estructura del producto final después de una serie de transformaciones de la sustancia inicial (sustrato) no es similar a la del sustrato, por lo que el producto final puede actuar sobre la enzima inicial de la cadena solo como un inhibidor alostérico (efector). Externamente, dicha regulación es similar a la regulación mediante un mecanismo de retroalimentación y permite controlar el rendimiento del producto final, en caso de acumulación, se detiene el trabajo de la primera enzima de la cadena. Por ejemplo, la aspartato carbamoiltransferasa (ACTasa) cataliza la primera de seis reacciones en la síntesis de citidina trifosfato (CTP). CTP es un inhibidor alostérico de AKTase. Por lo tanto, cuando se acumula CTP, la AKTasa se inhibe y se detiene la síntesis de CTP. Se ha descubierto la regulación alostérica de las enzimas por parte de las hormonas. Por ejemplo, los estrógenos son un inhibidor alostérico de la enzima glutamato deshidrogenasa, que cataliza la desaminación del ácido glutámico.
Por tanto, incluso la ecuación cinética más simple de una reacción enzimática contiene varios parámetros cinéticos, cada uno de los cuales depende de la temperatura y el entorno en el que se produce la reacción.
Los inhibidores nos permiten comprender no solo la esencia de la catálisis enzimática, sino que también son una herramienta única para estudiar el papel de reacciones químicas individuales que pueden desactivarse específicamente utilizando un inhibidor de una enzima determinada.
3. Algunos dispositivos convenientes para determinar las velocidades de reacción iniciales.
Muchos problemas de cinética enzimática conducen a la determinación de las velocidades de reacción iniciales (v 0). La principal ventaja de este método es que los valores de v 0 determinados en el momento inicial darán la representación más precisa de la actividad de las enzimas en estudio, ya que los productos de reacción acumulados aún no tienen tiempo de ejercer un efecto inhibidor sobre la enzima y, además, el sistema reactivo se encuentra en un estado de equilibrio estacionario.
Sin embargo, en la práctica de laboratorio, cuando se utilizan técnicas espectrofotométricas, titrimétricas u otras técnicas convencionales para registrar el progreso de tales reacciones, en el mejor de los casos se pierden entre 15 y 20 minutos del tiempo inicial para agregar la enzima al sustrato, mezclar el sistema de reacción, instalar la celda,etc. Y esto es inaceptable, ya que la tangente en este caso se lleva al punto donde tan ά 2< tg ά 1 . Не компенсируется потеря начального времени и при математической обработке таких кривых при записи выхода v 0 на максимальный уровень (V). Кроме того, протекание реакций без La mezcla constante se complica aún más por las fluctuaciones en las concentraciones de los reactivos en volumen.
Los dispositivos simples propuestos a continuación para un espectrofotómetro, un medidor de pH y similares pueden reducir significativamente las fuentes de los errores indicados al determinar v 0.
3.1 Dispositivo para el espectrofotómetro
El dispositivo espectrofotómetro consta de un dispensador 1, un filamento de teflón giratorio 2 (agitador) y una tapa con cierre 3.
El dispensador es una micropipeta, uno de cuyos extremos está moldeado con una aguja 4 y el otro con un ensanchamiento 5 (para evitar que la enzima entre en la punta de goma 6).
En la cubierta de teflón 3, que cubre la celda espectral 7, hay dos orificios: uno (8) en el centro de la cubierta, el segundo (9) encima del medio del espacio entre la pared opaca de la celda 7 y la luz. viga 10. Tubo de teflón 11 (diámetro interior 1 -1,5 mm) un extremo se fija en el orificio 9, el otro, en una protuberancia fija 12 frente al rotor del motor 13. Se inserta hilo de teflón 2 en el tubo (espesor de hilo 0,5 -0,6 milímetros). Un extremo del hilo se fija al rotor giratorio del motor 13, el segundo, que se pasa a la cubeta 7, tiene forma de espiral (para mejorar la mezcla). La posición de la rosca está determinada por la tapa de bloqueo 3, independientemente de la extracción del motor, lo cual es conveniente para trabajos que requieren cambios frecuentes de cubetas.
Principio de funcionamiento. La cubeta de cuarzo del espectrofotómetro 7 se llena con el sustrato 14 (aproximadamente 1,5-2,0 ml), se inserta en el soporte termostático de la cubeta del espectrofotómetro, se cierra con una tapa 3 con un hilo de teflón giratorio 2, que se sumerge en el sustrato 14. y todas las operaciones posteriores se realizan en el haz de luz del espectrofotómetro y se registran en el registrador.
Al comienzo del trabajo, el sustrato se mezcla y el bolígrafo grabador escribe una línea uniforme horizontal (o "cero"). El dispensador (con enzima) se inserta en el orificio 8 (la aguja se sumerge en la solución de sustrato 14), apretando rápidamente la punta 6, la enzima (generalmente alrededor de 0,03-0,05 ml) se introduce en el sustrato y el dispensador se remoto. La mezcla de los componentes finaliza en 2,5-3 s y la pluma registradora registra el comienzo de la reacción mediante la desviación de la curva de densidad óptica (ΔA) en función del tiempo.
Este dispositivo también permite tomar muestras del sistema reactivo para su análisis; agregar inhibidores y activadores al sistema; cambiar las condiciones de la reacción (cambiar el pH, la fuerza iónica, etc.) sin alterar el registro del progreso de la reacción, lo que resulta muy conveniente, por ejemplo, al estudiar la división. norte-NPF por fosfatasas “ácidas”, donde la escisión norte-NFF se lleva a cabo a pH 5,0 (o pH 6-7), y la actividad enzimática está determinada por la acumulación norte-Iones nitrofenolato a pH 9,5-10,0.
Un dispositivo de este tipo también es conveniente para realizar valoraciones espectrofotométricas de enzimas, etc.
3.2 Dispositivo para medidor de pH
El dispositivo para el medidor de pH consta de una punta modificada del electrodo de flujo 1, una semimicrocelda 2, un dispensador 3 y un circuito electrónico para conectar el medidor de pH al registrador. Además, el dispositivo incluye un electrodo medidor de pH estándar (4), una cubierta portaceldas (5), una cámara de flujo termostática (6), una solución de sustrato (7), un imán pasivo (8) y un imán activo ( 9).
La punta estándar del electrodo de flujo del medidor de pH (LPU-01) se reemplaza por un tubo de teflón 1 (diámetro interno 1,3-1,5 mm) y se llena con hilo de amianto, previamente tratado con una solución saturada de KCl. La densidad de llenado del hilo se ajusta de modo que el caudal de la solución de KCl a través del tubo esté cerca del caudal del electrodo original no modificado. Este reemplazo de la punta permite reducir el tamaño de la celda de trabajo inicial de 20-25 a 2 ml, lo que permite utilizar volúmenes mínimos (1,5 ml) de soluciones de costosos fármacos bioquímicos.
El circuito electrónico para conectar el medidor de pH (LPU-01) al registrador consta de una fuente de alimentación (batería de 12 V CC), una resistencia de cable alterno R 1 (10 - 100 ohmios), que establece un voltaje de 9 V en el Diodo Zener D809 según la lectura del voltímetro, una resistencia de cable alterna R 2 (15-150 Ohm), que regula el ajuste del “cero” (punto de referencia) de las lecturas del medidor de pH en la escala del registrador, y una resistencia de cable variable R 3 (35-500 ohmios), que regula la escala de expansión (amplificación) de las lecturas de la escala de pH: medidores en el registrador. El circuito funciona de manera confiable hasta que el voltaje de la fuente cae por debajo de 9 V.
Principio de funcionamiento. Se añaden 1,5 ml de sustrato a la celda (cilindro de vidrio de 1,7x2,4 cm) y la celda se fija en la tapa de bloqueo 5. Se enciende la agitación 9 y el bolígrafo registrador escribe una línea de referencia uniforme (básica). Usando un dispensador, se añaden 0,03 ml de la solución enzimática al sustrato y la pluma registradora registra el comienzo de la reacción mediante la desviación de la curva de pH versus tiempo (t).
Un dispositivo de este tipo no reemplaza al medidor de pH, pero teniendo en cuenta la posibilidad de ampliar la escala del medidor de pH, le permite registrar de manera confiable cambios menores en el pH de 0,004-0,005.
3.3 Reglas de nomograma, convenientes para determinar la velocidad inicial
Una complejidad considerable para determinar la velocidad inicial en el método tangente es el cálculo de las relaciones de cambios en las concentraciones de reactivos (Δ[S]) por unidad de tiempo (Δt), es decir expresión v 0 en M/min a partir de las condiciones que
v 0 = lim Δ[S] / Δt, en t 0.
En la práctica, este procedimiento normalmente consta de tres o cuatro operaciones separadas: se traza una tangente a la sección inicial de la curva de progreso de la reacción, luego se calcula el número de unidades del valor registrado (densidad óptica, ángulo de rotación, etc.) por Se cuenta un cierto intervalo de tiempo, se lleva a la unidad de tiempo y, finalmente, se recalculan las lecturas del registrador para el cambio en las concentraciones de reactivo en 1 minuto (M/min). Los dos tipos de regla de nomograma propuestos nos permiten simplificar este procedimiento.
Regla rectangular. v 0 es la relación Δ[S]/Δt, es decir tg ά, donde ά es el ángulo de inclinación de la tangente al eje del tiempo t. La misma tangente es también la hipotenusa del correspondiente triángulo rectángulo con catetos [S] y it. Cuanto mayor sea v 0, más pronunciada será la pendiente de la tangente. En consecuencia, si nos limitamos a un determinado intervalo de tiempo, por ejemplo 1 minuto, obtendremos una serie de triángulos rectángulos con distintos valores del cateto [S] (en realidad, distintos valores de v 0). Si calibra ambas patas: horizontal - en unidades de tiempo (1 min) y vertical - en unidades de cambio en las concentraciones de reactivo, por ejemplo en milimoles (mM), y aplica los segmentos resultantes a un formato adecuado hecho de material transparente (plexiglás aproximadamente 2 mm de espesor), entonces podrá conseguir una regla conveniente para determinar las velocidades de reacción iniciales. Todos los números y líneas están aplicados en la parte posterior de la regla para eliminar errores de paralaje al determinar v 0.
El procedimiento para determinar v 0 se reduce en este caso a dos operaciones simples: se traza una tangente al tramo inicial de la curva cinética t 2 y combinamos el punto cero del cateto horizontal t de la regla con el inicio de la tangente, la continuación de la tangente ahora cortará la escala de concentración [S] en el punto que determina el valor v 0 en M/min (con el posición horizontal de la pierna t encendida. No se requieren operaciones adicionales.
Regla de arco. El procedimiento para determinar v 0 se puede simplificar a una sola operación si la escala de concentración se traza a lo largo de un arco de cierto radio.
Se aplica una línea recta (“básica”) 2 a una placa de material transparente (todos los números y líneas también se aplican en la parte posterior de la regla) y desde el punto cero (t=0, min) de esta línea con una radio igual a la longitud del cateto t=1 min [ , dibuje un arco [S], de arriba a abajo, a lo largo del cual se traza una escala de cambios en las concentraciones del reactivo (por ejemplo, sustrato en mM).
Los tipos descritos de reglas, un dispositivo para un espectrofotómetro y un medidor de pH se han utilizado durante varios años para determinar las velocidades iniciales de reacciones (v 0), al estudiar la especificidad del sustrato de las enzimas, para la titulación espectrofotométrica, etc.
Conclusión
Este trabajo examinó la rama de la enzimología que estudia la dependencia de la velocidad de las reacciones químicas catalizadas por enzimas de una serie de factores ambientales. Los fundadores de esta ciencia son considerados legítimamente Michaelis y Menten, quienes publicaron su teoría del mecanismo general. reacciones enzimáticas, derivaron una ecuación que se ha convertido en el principio fundamental de todos los estudios cinéticos de las enzimas; sirve como punto de partida para cualquier descripción cuantitativa de la acción de las enzimas; La ecuación original de Michaelis-Menten es una ecuación de hipérbola; Lineweaver y Burke hicieron su contribución a la cinética, quienes transformaron la ecuación de Michaelis-Menten y obtuvieron una gráfica de una línea recta a partir de la cual se puede determinar con mayor precisión el valor de V max.
Con el tiempo, el cambio en la velocidad de una reacción enzimática en condiciones experimentales disminuye. Una disminución de la velocidad puede ocurrir debido a una serie de factores: una disminución en la concentración del sustrato, un aumento en la concentración del producto, que puede tener un efecto inhibidor, cambios en el pH de la solución, cambios en la temperatura. del medio ambiente puede ocurrir. Entonces, con cada aumento de temperatura de 10°C, la velocidad de reacción aumenta 2 veces o incluso menos. La baja temperatura inactiva reversiblemente las enzimas. La dependencia de la velocidad de una reacción enzimática del pH indica el estado de los grupos funcionales del centro activo de la enzima. Cada enzima responde de manera diferente a los cambios de pH. Las reacciones químicas se pueden detener actuando sobre ellas con varios tipos de inhibición. La velocidad de reacción inicial se puede determinar de forma rápida y precisa utilizando dispositivos como reglas de nomograma, un dispositivo para un espectrofotómetro y un medidor de pH. Esto permite la representación más precisa de la actividad de las enzimas que se están estudiando.
Todo esto se utiliza activamente hoy en la práctica médica.
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Velocidad de reacción enzimática
La velocidad de una reacción enzimática se mide por la cantidad de sustrato convertido por unidad de tiempo o la cantidad de producto formado. La velocidad está determinada por el ángulo de inclinación de la tangente a la curva en la etapa inicial de la reacción.
Arroz. 2 Velocidad de reacción enzimática.
Cuanto más pronunciada sea la pendiente, mayor será la velocidad. Con el tiempo, la velocidad de reacción suele disminuir, en gran parte como resultado de la disminución de la concentración de sustrato.
Factores que afectan la actividad enzimática.
La acción de F. depende de varios factores: temperatura, reacción ambiental (pH), concentración de enzima, concentración de sustrato y la presencia de activadores específicos e inhibidores específicos o inespecíficos.
Concentración de enzimas
A altas concentraciones de sustrato y otros factores permanecen constantes, la velocidad de la reacción enzimática es proporcional a la concentración de enzima.
Arroz. 3 Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática de la concentración de la enzima.
La catálisis siempre ocurre en condiciones donde la concentración de la enzima es mucho menor que la concentración del sustrato. Por tanto, a medida que aumenta la concentración de la enzima, también aumenta la velocidad de la reacción enzimática.
Temperatura
El efecto de la temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática se puede expresar mediante el coeficiente de temperatura Q 10: Q 10 = (velocidad de reacción a (x + 10) °C) / (velocidad de reacción a x °C)
Entre 0-40°C, el Q10 de una reacción enzimática es 2. En otras palabras, por cada aumento de 10°C en la temperatura, la velocidad de la reacción enzimática se duplica.
Arroz. 4 La influencia de la temperatura en la actividad de una enzima como la amilasa salival.
A medida que aumenta la temperatura, el movimiento de las moléculas se acelera y es más probable que las moléculas de las sustancias que reaccionan choquen entre sí. En consecuencia, aumenta la probabilidad de que se produzca una reacción entre ellos. La temperatura que proporciona mayor actividad se llama óptima. Más allá de este nivel, la velocidad de la reacción enzimática disminuye, a pesar del aumento en la frecuencia de colisiones. Esto ocurre debido a la destrucción de las estructuras secundarias y terciarias de la enzima, es decir, debido a que la enzima sufre una desnaturalización.
Arroz. 5 El curso de la reacción enzimática a diferentes temperaturas.
Cuando la temperatura se acerca o cae por debajo del punto de congelación, las enzimas se inactivan, pero no se produce la desnaturalización. Al aumentar la temperatura, su actividad catalítica se restablece nuevamente.
Dado que las proteínas en estado seco se desnaturalizan mucho más lentamente que las proteínas hidratadas (en forma de gel o solución de proteínas), la inactivación del fósforo en estado seco ocurre mucho más lentamente que en presencia de humedad. Por lo tanto, las esporas bacterianas secas o las semillas secas pueden resistir el calentamiento a temperaturas mucho más altas que las mismas esporas o semillas en estado húmedo.
Concentración de sustrato
Para una concentración de enzima dada, la velocidad de la reacción enzimática aumenta al aumentar la concentración de sustrato.
Arroz. 6 Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática de la concentración del sustrato.
La velocidad de reacción máxima teórica Vmax nunca se alcanza, pero llega un momento en que un aumento adicional en la concentración de sustrato ya no implica ningún cambio perceptible en la velocidad de reacción. Esto debería explicarse por el hecho de que a altas concentraciones de sustrato, los centros activos de las moléculas de fósforo están prácticamente saturados en un momento dado. Por lo tanto, no importa cuánto exceso de sustrato esté disponible, puede combinarse con la enzima sólo después de que el complejo enzima-sustrato previamente formado se disocia en producto y enzima libre. Por lo tanto, a altas concentraciones de sustrato, la velocidad de la reacción enzimática está limitada por ambos. concentración del sustrato y el tiempo necesario para la disociación del complejo enzima-sustrato.
A una temperatura constante, cualquier fósforo funciona más eficazmente dentro de un rango de pH estrecho. El valor de pH óptimo es aquel en el que la reacción se desarrolla a máxima velocidad.
Arroz. 7 Dependencia de la actividad enzimática del pH.
A pH más alto y más bajo, la actividad de F. disminuye. El cambio de pH cambia la carga de los grupos ácidos y básicos ionizados, de los que depende la forma específica de las moléculas de fósforo. Como resultado, cambia la forma de las moléculas de fósforo y, principalmente, la forma de su centro activo. Si el pH cambia demasiado bruscamente, F. se desnaturaliza. La característica óptima del pH de un fósforo determinado no siempre coincide con el pH de su entorno intracelular inmediato. Esto sugiere que el entorno en el que se encuentra F. regula en cierta medida su actividad.
Cinética de reacciones enzimáticas. La cinética estudia las velocidades, los mecanismos de las reacciones y la influencia sobre ellas de factores como las concentraciones de enzimas y sustratos, la temperatura, el pH del medio ambiente, la presencia de inhibidores o activadores.
A una concentración de sustrato constante, la velocidad de reacción es directamente proporcional a la concentración de enzima. La gráfica de la dependencia de la velocidad de una reacción enzimática de la concentración del sustrato tiene la forma de una hipérbola equilátera.
Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática de la concentración de enzima (a) y sustrato (b)
Se describe la dependencia de la velocidad de una reacción enzimática de la concentración del sustrato. Ecuación de Michaelis-Menten:
donde V es la velocidad en estado estacionario de la reacción bioquímica; Vmax - velocidad máxima; Km - constante de Michaelis; [S] - concentración de sustrato.
Si la concentración de sustrato es baja, es decir, [S]<< Кm, то [S] в знаменателе можно пренебречь.
Entonces 
Por tanto, a bajas concentraciones de sustrato, la velocidad de reacción es directamente proporcional a la concentración de sustrato y se describe mediante una ecuación de primer orden. Esto corresponde al tramo recto inicial de la curva V = f[S] (Figura b).
A altas concentraciones de sustrato [S] >> Km, cuando Km puede despreciarse, la ecuación de Michaelis-Menten toma la forma, es decir V=Vmáx.
Por tanto, a altas concentraciones de sustrato, la velocidad de reacción se vuelve máxima y se describe mediante una ecuación de orden cero. Esto corresponde a la sección de la curva V =f [S] paralela al eje de abscisas.
A concentraciones de sustrato numéricamente comparables a la constante de Michaelis, la velocidad de reacción aumenta gradualmente. Esto concuerda bastante con las ideas sobre el mecanismo de reacción enzimática:
donde S es el sustrato; E - enzima; ES - complejo enzima-sustrato; P - producto; k1 es la constante de velocidad para la formación del complejo enzima-sustrato; k2 es la constante de velocidad de descomposición del complejo enzima-sustrato con la formación de reactivos iniciales; k3 es la constante de velocidad de descomposición del complejo enzima-sustrato con la formación de un producto.
Tasa de conversión del sustrato con la formación del producto (P) es proporcional a la concentración del complejo enzima-sustrato. A bajas concentraciones de sustrato en solución hay un cierto número de moléculas de enzima libres (E) que no están unidas a un complejo (ES). Por lo tanto, a medida que aumenta la concentración del sustrato, aumenta la concentración de los complejos y, por tanto, también aumenta la velocidad de formación del producto. A altas concentraciones de sustrato, todas las moléculas de enzima están unidas en un complejo ES (el fenómeno de saturación de enzimas), por lo tanto, un aumento adicional en la concentración de sustrato prácticamente no aumenta la concentración de complejos y la velocidad de formación del producto permanece constante.
Por tanto, queda claro el significado físico de la velocidad máxima de una reacción enzimática. Vmax es la velocidad a la que reacciona una enzima cuando existe enteramente como un complejo enzima-sustrato..
La constante de Michaelis corresponde numéricamente a la concentración de sustrato a la que la velocidad en estado estacionario es igual a la mitad del máximo. Esta constante caracteriza la constante de disociación del complejo enzima-sustrato:
Significado físico de la constante de Michaelis porque caracteriza la afinidad de la enzima por el sustrato. Km tiene valores pequeños cuando k1 > (k2 + k3), es decir el proceso de formación del complejo ES prevalece sobre los procesos de disociación de ES. En consecuencia, cuanto menor sea el valor de Km, mayor será la afinidad de la enzima por el sustrato. Y, a la inversa, si Km es de gran importancia, entonces (k2 + k3) > k1 y predominan los procesos de disociación ES. En este caso, la afinidad de la enzima por el sustrato es baja.
Inhibidores y activadores de enzimas. . Inhibidores de enzimas Se llaman sustancias que reducen la actividad enzimática. Cualquier agente desnaturalizante (por ejemplo, sales de metales pesados, ácidos) son inhibidores enzimáticos inespecíficos.
Inhibidores reversibles- Estos son compuestos que interactúan de forma no covalente con la enzima. Inhibidores irreversibles- Estos son compuestos que se unen específicamente a los grupos funcionales del centro activo y forman enlaces covalentes con la enzima.
La inhibición reversible se divide en competitiva y no competitiva. Inhibición competitiva sugiere similitud estructural entre el inhibidor y el sustrato. El inhibidor ocupa espacio en el sitio activo de la enzima y una cantidad significativa de moléculas de enzima quedan bloqueadas. La inhibición competitiva se puede eliminar aumentando la concentración del sustrato. En este caso, el sustrato desplaza al inhibidor competitivo del sitio activo.
La inhibición reversible puede ser no competitivo en relación al sustrato. En este caso, el inhibidor no compite por el sitio de unión a la enzima. El sustrato y el inhibidor se unen a diferentes centros, por lo que es posible formar un complejo IE, así como un complejo IES ternario, que puede descomponerse para liberar el producto, pero a un ritmo menor que el complejo ES.
Por la naturaleza de su acción Los inhibidores se dividen en:
- específico,
- inespecífico.
Inhibidores específicos ejercen su efecto sobre la enzima uniéndose con un enlace covalente en el centro activo de la enzima y apagándolo del ámbito de acción.
Inhibición inespecífica Implica el efecto de agentes desnaturalizantes sobre la enzima (sales de metales pesados, urea, etc.). En este caso, como resultado de la destrucción de la estructura cuaternaria y terciaria de la proteína, se pierde la actividad biológica de la enzima.
Activadores enzimáticos- Son sustancias que aumentan la velocidad de las reacciones enzimáticas. Muy a menudo, los iones metálicos (Fe2+, Fe3+, Cu2+, Co2+, Mn2+, Mg2+, etc.) actúan como activadores. Hay metales que se encuentran en las metaloenzimas, que son cofactores, y actuando como activadores de enzimas. Los cofactores pueden unirse estrechamente a la parte proteica de la enzima; en cuanto a los activadores, se separan fácilmente de la apoenzima. Estos metales son participantes obligatorios en el acto catalítico, que determina la actividad de la enzima. Activadores mejorar el efecto catalítico, pero su ausencia no impide que se produzca la reacción enzimática. Como regla general, el cofactor metálico interactúa con grupos del sustrato cargados negativamente. Un metal de valencia variable participa en el intercambio de electrones entre el sustrato y la enzima. Además, participan en la formación de una conformación de transición estable de la enzima, lo que contribuye a una formación más rápida del complejo ES.
Regulación de la actividad enzimática. . Uno de los principales mecanismos para regular el metabolismo es la regulación de la actividad enzimática. Un ejemplo es la regulación alostérica, regulación a través de activadores e inhibidores. A menudo sucede que el producto final de una vía metabólica es un inhibidor de una enzima reguladora. Este tipo de inhibición se llama retroinhibición o inhibición basada en el principio de retroalimentación negativa.
Muchas enzimas se producen como precursores de proenzimas inactivos y luego se activan en el momento adecuado mediante proteólisis parcial. Proteolisis parcial- escisión de parte de la molécula, lo que conduce a un cambio en la estructura terciaria de la proteína y la formación del centro activo de la enzima.
Algunas enzimas oligoméricas pueden cambiar su actividad debido a asociaciones - disociaciones de subunidades, incluidos en su composición.
Muchas enzimas se pueden encontrar en dos formas: como proteína simple y como fosfoproteína. La transición de una forma a otra va acompañada de un cambio en la actividad catalítica.
La velocidad de la reacción enzimática depende de cantidad de enzima, que en una célula está determinada por la relación entre las tasas de síntesis y descomposición. Este método de regular la velocidad de una reacción enzimática es un proceso más lento que regular la actividad enzimática.
§ 12. CINÉTICA DE LAS REACCIONES ENZIMATIVAS
La cinética de reacciones enzimáticas es la ciencia de las velocidades de las reacciones enzimáticas y su dependencia de diversos factores. La velocidad de una reacción enzimática está determinada por la cantidad química del sustrato reaccionado o el producto de reacción resultante por unidad de tiempo por unidad de volumen bajo ciertas condiciones:
donde v es la velocidad de la reacción enzimática, es el cambio en la concentración del sustrato o producto de la reacción, t es el tiempo.
La velocidad de una reacción enzimática depende de la naturaleza de la enzima, que determina su actividad. Cuanto mayor sea la actividad enzimática, más rápida será la velocidad de reacción. La actividad enzimática está determinada por la velocidad de reacción catalizada por la enzima. La medida de la actividad enzimática es una unidad estándar de actividad enzimática. Una unidad estándar de actividad enzimática es la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en 1 minuto.
Durante una reacción enzimática, la enzima (E) interactúa con el sustrato (S), lo que da como resultado la formación de un complejo enzima-sustrato, que luego se desintegra para liberar la enzima y el producto (P) de la reacción:
La velocidad de una reacción enzimática depende de muchos factores: la concentración del sustrato y la enzima, la temperatura, el pH del medio ambiente, la presencia de diversas sustancias reguladoras que pueden aumentar o disminuir la actividad de las enzimas.
¡Interesante saberlo! Las enzimas se utilizan en medicina para diagnosticar diversas enfermedades. Durante el infarto de miocardio, debido al daño y degradación del músculo cardíaco, el contenido de las enzimas aspartato transaminasa y alanina aminotransferasa en la sangre aumenta considerablemente. La detección de su actividad permite diagnosticar esta enfermedad.
Efecto de la concentración de sustrato y enzima sobre la velocidad de la reacción enzimática.
Consideremos el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción enzimática (Fig. 30). A bajas concentraciones del sustrato, la velocidad es directamente proporcional a su concentración, luego, a medida que aumenta la concentración, la velocidad de reacción aumenta más lentamente, y a concentraciones muy altas del sustrato, la velocidad es prácticamente independiente de su concentración y alcanza su valor; valor máximo (V máx). A tales concentraciones de sustrato, todas las moléculas de enzima forman parte del complejo enzima-sustrato y se logra la saturación completa de los centros activos de la enzima, por lo que la velocidad de reacción en este caso es prácticamente independiente de la concentración del sustrato.
Arroz. 30. Dependencia de la velocidad de una reacción enzimática de la concentración del sustrato.
La gráfica de la dependencia de la actividad enzimática de la concentración del sustrato se describe mediante la ecuación de Michaelis-Menten, que recibió su nombre en honor a los destacados científicos L. Michaelis y M. Menten, quienes hicieron una gran contribución al estudio de la cinética de reacciones enzimáticas,
donde v es la velocidad de la reacción enzimática; [S] – concentración de sustrato; KM – Constante de Michaelis.
Consideremos el significado físico de la constante de Michaelis. Siempre que v = ½ V max , obtenemos KM = [S]. Por tanto, la constante de Michaelis es igual a la concentración de sustrato a la que la velocidad de reacción es la mitad del máximo.
La velocidad de la reacción enzimática también depende de la concentración de la enzima (Fig. 31). Esta dependencia es sencilla.
Arroz. 31. Dependencia de la velocidad de una reacción enzimática de la concentración de la enzima.
Efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reacción enzimática.
La dependencia de la velocidad de reacción enzimática con la temperatura se muestra en la Fig. 32.
Arroz. 32. Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática de la temperatura.
A bajas temperaturas (hasta aproximadamente 40 - 50 o C), un aumento de temperatura por cada 10 o C de acuerdo con la regla de Van't Hoff va acompañado de un aumento en la velocidad de la reacción química de 2 a 4 veces. A altas temperaturas, más de 55 - 60 o C, la actividad de la enzima disminuye drásticamente debido a su desnaturalización térmica y, como consecuencia de esto, se observa una fuerte disminución en la velocidad de la reacción enzimática. La actividad enzimática máxima suele observarse dentro del rango de 40 a 60 o C. La temperatura a la que la actividad enzimática es máxima se denomina temperatura óptima. La temperatura óptima para las enzimas de los microorganismos termófilos se encuentra en la región de temperaturas más altas.
Efecto del pH sobre la velocidad de la reacción enzimática.
La dependencia de la actividad enzimática con el pH se muestra en la Fig. 33.
Arroz. 33. La influencia del pH en la velocidad de la reacción enzimática.
La gráfica del pH tiene forma de campana. El valor de pH en el que la actividad enzimática es máxima se llama pH óptimo enzima. Los valores óptimos de pH para diversas enzimas varían ampliamente.
La naturaleza de la dependencia de la reacción enzimática del pH está determinada por el hecho de que este indicador afecta:
a) ionización de residuos de aminoácidos implicados en la catálisis,
b) ionización del sustrato,
c) conformación de la enzima y su centro activo.
Inhibición enzimática
La velocidad de una reacción enzimática se puede reducir mediante una serie de sustancias químicas llamadas inhibidores. Algunos inhibidores son venenos para los humanos, por ejemplo el cianuro, otros se utilizan como medicamentos.
Los inhibidores se pueden dividir en dos tipos principales: irreversible Y reversible. Los inhibidores irreversibles (I) se unen a la enzima para formar un complejo, cuya disociación con la restauración de la actividad enzimática es imposible:
Un ejemplo de inhibidor irreversible es el fluorofosfato de diisopropilo (DFP). La DPP inhibe la enzima acetilcolinesterasa, que desempeña un papel importante en la transmisión de los impulsos nerviosos. Este inhibidor interactúa con la serina en el centro activo de la enzima, bloqueando así la actividad de esta última. Como resultado, se altera la capacidad de los procesos de las células nerviosas de las neuronas para conducir impulsos nerviosos. El DPP es uno de los primeros agentes nerviosos. Sobre esta base se han creado una serie de productos que son relativamente no tóxicos para humanos y animales. insecticidas - Sustancias venenosas para los insectos.
Los inhibidores reversibles, a diferencia de los irreversibles, se pueden separar fácilmente de la enzima bajo ciertas condiciones. Se restablece la actividad de este último:
Los inhibidores reversibles incluyen competitivo Y no competitivo inhibidores.
Un inhibidor competitivo, al ser un análogo estructural del sustrato, interactúa con el centro activo de la enzima y, por lo tanto, bloquea el acceso del sustrato a la enzima. En este caso, el inhibidor no sufre transformaciones químicas y se une a la enzima de forma reversible. Después de la disociación del complejo EI, la enzima puede contactar con el sustrato y convertirlo, o con un inhibidor (Fig. 34). Dado que tanto el sustrato como el inhibidor compiten por el espacio en el sitio activo, esta inhibición se denomina competitiva.
Arroz. 34. Mecanismo de acción de un inhibidor competitivo.
Los inhibidores competitivos se utilizan en medicina. Anteriormente, las sulfonamidas se utilizaban ampliamente para combatir enfermedades infecciosas. Tienen una estructura similar a ácido para-aminobenzoico(PABA), un factor de crecimiento esencial para muchas bacterias patógenas. PABA es un precursor del ácido fólico, que sirve como cofactor para varias enzimas. Las sulfonamidas actúan como un inhibidor competitivo de las enzimas para la síntesis de ácido fólico a partir de PABA y, por lo tanto, inhiben el crecimiento y la reproducción de bacterias patógenas.
Los inhibidores no competitivos no son estructuralmente similares al sustrato y, cuando se forma EI, no interactúan con el centro activo, sino con otro sitio de la enzima. La interacción del inhibidor con la enzima provoca un cambio en la estructura de esta última. La formación del complejo EI es reversible, por lo que después de su descomposición, la enzima vuelve a poder atacar el sustrato (Fig. 35).
Arroz. 35. Mecanismo de acción de un inhibidor no competitivo
Cianuro CN: puede actuar como un inhibidor no competitivo. Se une a iones metálicos que forman parte de grupos protésicos e inhibe la actividad de estas enzimas. El envenenamiento por cianuro es extremadamente peligroso. Pueden ser fatales.
enzimas alostéricas
El término "alostérico" proviene de las palabras griegas allo - otro, estéreo - sitio. Así, las enzimas alostéricas, junto con el centro activo, tienen otro centro llamado centro alostérico(Figura 36). Las sustancias que pueden cambiar la actividad de las enzimas se unen al centro alostérico; efectores alostéricos. Los efectores son positivos: activan la enzima y negativos: inhiben, es decir. reduciendo la actividad enzimática. Algunas enzimas alostéricas pueden verse afectadas por dos o más efectores.
Arroz. 36. Estructura de una enzima alostérica.
Regulación de sistemas multienzimáticos.
Algunas enzimas actúan en conjunto, combinándose en sistemas multienzimáticos en los que cada enzima cataliza una etapa específica de la vía metabólica:
En un sistema multienzimático, hay una enzima que determina la velocidad de toda la secuencia de reacciones. Esta enzima suele ser alostérica y se encuentra al inicio de la ruta del metabolito. Es capaz, al recibir diversas señales, de aumentar y disminuir la velocidad de la reacción catalizada, regulando así la velocidad de todo el proceso.
La cinética enzimática estudia la influencia de la naturaleza química de las sustancias que reaccionan (enzimas, sustratos) y las condiciones de su interacción (pH medio, temperatura, concentración, presencia de activadores o inhibidores) sobre la velocidad de una reacción enzimática. La velocidad de una reacción enzimática (u) se mide por la disminución de la cantidad de sustrato o el aumento del producto de reacción por unidad de tiempo.
A baja concentración de sustrato, la velocidad de reacción
es directamente proporcional a su concentración. A altas concentraciones de sustrato, cuando todos los sitios activos de la enzima están ocupados por el sustrato ( saturación de la enzima con sustrato.), la velocidad de reacción es máxima, se vuelve constante e independiente de la concentración del sustrato [S] y depende completamente de la concentración de enzima (Fig. 19).
K S – constante de disociación del complejo enzima-sustrato ES, recíproco de la constante de equilibrio:
.
Cuanto menor sea el valor de KS, mayor será la afinidad de la enzima por el sustrato.
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| Arroz. 19. Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática de la concentración del sustrato a una concentración de enzima constante |
La relación cuantitativa entre la concentración del sustrato y la velocidad de la reacción enzimática expresa Ecuación de Michaelis-Menten:
,
u es la velocidad de reacción, u max es la velocidad máxima de la reacción enzimática.
Briggs y Haldane mejoraron la ecuación introduciendo Constante de Michaelis K·m, determinado experimentalmente.
Ecuación de Briggs-Haldane:
,
.
La constante de Michaelis es numéricamente igual a la concentración del sustrato (mol/l), a la que la velocidad de la reacción enzimática es la mitad del máximo (Fig. 20). K m muestra la afinidad de la enzima por el sustrato: cuanto menor es su valor, mayor es la afinidad.
Los valores experimentales de K m para la mayoría de las reacciones enzimáticas que involucran un sustrato suelen ser 10 -2 -10 -5 M. Si la reacción es reversible, entonces la interacción de la enzima con el sustrato de la reacción directa se caracteriza por K m diferente de eso para el sustrato de la reacción inversa.
G. Lineweaver y D. Burke transformaron la ecuación de Briggs-Haldane y obtuvieron la ecuación de la línea recta: y = ax + b (Figura 21):
.
El método Lineweaver-Burk proporciona un resultado más preciso.
Arroz. 21. Definición gráfica de la constante de Michaelis.
según el método Lineweaver-Burk
PROPIEDADES DE LA ENZIMA
Las enzimas se diferencian de los catalizadores convencionales en varias propiedades.
labilidad térmica, o sensibilidad al aumento de temperatura (Fig. 22).
Arroz. 22. Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática de la temperatura.
A una temperatura que no supera los 45-50 °C, la velocidad de la mayoría de las reacciones bioquímicas aumenta 2 veces con un aumento de la temperatura de 10 °C según la regla de Van't Hoff. A temperaturas superiores a 50 °C, la velocidad de reacción se ve afectada por la desnaturalización térmica de la proteína enzimática, lo que lleva gradualmente a su desactivación completa.
La temperatura a la cual la actividad catalítica de una enzima es máxima se llama temperatura. temperatura óptima. La temperatura óptima para la mayoría de las enzimas de los mamíferos está en el rango de 37 a 40 °C. A bajas temperaturas (0 °C y menos), las enzimas generalmente no se destruyen, aunque su actividad disminuye casi a cero.
Dependencia de la actividad enzimática del valor de pH del medio.(Figura 23).
Para cada enzima existe un valor de pH óptimo en el que exhibe la máxima actividad. pH óptimo La acción de las enzimas en los tejidos animales se encuentra dentro de una zona estrecha de concentración de iones de hidrógeno correspondiente a los valores de pH fisiológico de 6,0 a 8,0 desarrollados en el proceso de evolución. Las excepciones son la pepsina: 1,5-2,5; arginasa – 9,5-10.
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| Arroz. 23. Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática del pH del medio. |
El efecto de los cambios en el pH del medio ambiente sobre la molécula de enzima es influir en el grado de ionización de sus grupos activos y, en consecuencia, en la estructura terciaria de la proteína y en el estado del centro activo. El pH también cambia la ionización de cofactores, sustratos, complejos enzima-sustrato y productos de reacción.
Especificidad. La alta especificidad de la acción de las enzimas se debe a la complementariedad conformacional y electrostática entre las moléculas del sustrato y la enzima y a la organización estructural única del centro activo, que asegura la selectividad de la reacción.
Especificidad absoluta – la capacidad de una enzima para catalizar una sola reacción. Por ejemplo, la ureasa cataliza la reacción de hidrólisis de la urea a NH 3 y CO 2, la arginasa, la hidrólisis de la arginina.
Especificidad relativa (de grupo) – la capacidad de una enzima para catalizar un grupo de reacciones de cierto tipo. Por ejemplo, las enzimas hidrolíticas peptidasas, que hidrolizan enlaces peptídicos en moléculas de proteínas y péptidos, y la lipasa, que hidroliza enlaces éster en moléculas de grasa, tienen una especificidad relativa.
Especificidad estereoquímica Poseen enzimas que catalizan la transformación de solo uno de los isómeros espaciales. La enzima fumarasa cataliza la conversión del isómero trans del ácido butenodioico, el ácido fumárico, en ácido málico, y no actúa sobre el isómero cis, el ácido maleico.
La alta especificidad de la acción de las enzimas garantiza que entre todas las transformaciones posibles solo se produzcan determinadas reacciones químicas.
