Lors de la préparation des milieux nutritifs, il est nécessaire de prendre en compte les besoins des micro-organismes cultivés en divers nutriments. Il existe différentes classifications de milieux de culture.
Classification des milieux nutritifs par composition :
1. Environnements simples(MPB, MPA, gélatine, eau peptonée). Le bouillon de viande et de peptone (MPB) constitue la base protéique de tous les milieux.
Il existe plusieurs façons de préparer le MPB :
a) sur de l'eau de viande additionnée de peptone prête à l'emploi ;
b) sur la digestion des produits d'hydrolyse des matières premières à l'aide d'enzymes.
Gélose à la peptone de viande (MPA) - préparée en ajoutant de l'agar-agar (1,5 à 3 %) au MPB. Si le MPA est distribué en diagonale dans un tube ou une bouteille, il s’agit d’une gélose inclinée. Si le milieu est réparti verticalement dans un tube à essai d'une hauteur de 5 à 7 cm, il s'agit d'une colonne de gélose. MPA, congelé dans des boîtes de Pétri sous forme de pâte - gélose en plaque. Si le milieu présente une couche verticale de 2 à 3 cm de hauteur et une couche diagonale de même taille, il s'agit d'une gélose semi-inclinée.
2. Environnements complexes préparé sur une base simple avec certains additifs (glucides, sang, bile, œufs, lactosérum, lait, sels, facteurs de croissance, etc.)
Classification des milieux nutritifs selon les composants initiaux :
1. Milieux de culture naturels est un produit naturel d'origine animale ou végétale.
Peut être:
Légumes (produits initiaux - soja, pois, pommes de terre, carottes, etc.).
Animaux (produits initiaux - viande, poisson, œufs, lait, tissus animaux, bile, sérum sanguin, etc.).
Mixte (MPA, environnement Levenshtein-Jensen, etc.).
2. Environnements bâtis contiennent des produits naturels transformés (eau de viande, digestat), des substances dérivées de ces produits (peptone, extraits de levure et de maïs) et divers additifs. Il s’agit du groupe de médias le plus vaste et le plus diversifié en termes de composition. Ils sont préparés selon certaines recettes à partir de diverses infusions ou décoctions d'origine animale ou végétale additionnées de sels inorganiques, de glucides et de substances azotées.
3. Médias synthétiques(de composition chimique connue) sont constitués de composés chimiquement purs dans des concentrations précisément établies (avec ajout de glucides, de sels, d'acides aminés, de vitamines, etc.). A partir de ces supports, en y ajoutant des supports naturels ou artificiels, on obtient des supports semi-synthétiques.
Classification des milieux nutritifs par consistance : il y a des environnements liquide(milieux sans gélose), semi liquide(avec agar jusqu'à 1%), dense(gélose - 1,5-2,5%). Les milieux liquides sont plus souvent utilisés pour étudier les caractéristiques physiologiques et biochimiques des micro-organismes, pour l'accumulation de biomasse et de produits métaboliques. Les milieux semi-liquides sont généralement utilisés pour stocker des cultures, les milieux solides pour isoler des micro-organismes, étudier la morphologie des colonies, à des fins de diagnostic, d'enregistrement quantitatif, de détermination de propriétés antagonistes, etc.
Classification des milieux nutritifs selon leur destination : universel (couramment utilisé) et spécial.
Environnements universels (de base). Ces milieux sont utilisés pour la culture de la plupart des micro-organismes relativement sans prétention ou servent de base à la préparation de milieux spéciaux, en y ajoutant du sang, du sucre, du lait, du lactosérum et d'autres ingrédients nécessaires à la reproduction d'un type particulier de micro-organisme. Ce groupe comprend : MPB - bouillon viande-peptone, MPA - gélose viande-peptone, MPG - gélatine viande-peptone, etc.
Environnements spéciaux. Conçu pour l'isolement et la culture sélective de certains types de micro-organismes qui ne se développent pas sur des supports simples.
On distingue les types de milieux spéciaux suivants : milieux d'enrichissement, milieux sélectifs, milieux de diagnostic différentiel, milieux de conservation et milieux d'accumulation.
Médias d'enrichissement. De nombreux micro-organismes ne se développent pas sur des milieux ordinaires, c'est pourquoi des glucides (bouillon de sucre ou gélose) ou des protéines (gélose et bouillon de lactosérum, gélose au sang et bouillon) sont ajoutés pour augmenter la valeur nutritionnelle du milieu. La gélose au sang ou le bouillon de sang est obtenu en ajoutant 5 à 10 % de sang défibriné stérile chauffé d'un mouton, d'un lapin, d'un cheval ou d'un humain au milieu nutritif. Le milieu est utilisé pour isoler les streptocoques, les pneumocoques et d'autres bactéries, ainsi que pour étudier l'activité hémolytique. Le bouillon de lactosérum ou la gélose au lactosérum est préparé en ajoutant 15 à 20 % de sérum de cheval ou de bovin à un milieu ordinaire.
2. Environnements électifs (sélectifs). Ces milieux sont conçus pour isoler et accumuler sélectivement des micro-organismes d'un type spécifique à partir d'un matériau contenant plusieurs types de microbes. Lors du semis de matériel contenant un mélange de divers micro-organismes, la croissance des espèces pour lesquelles ce milieu sera sélectif apparaîtra en premier. La sélectivité du milieu est obtenue en créant des conditions optimales pour la culture de certains microbes (pH, Eh, concentration en sel, composition nutritionnelle), c'est-à-dire sélection positive. Ou en ajoutant à l'environnement des substances qui inhibent d'autres micro-organismes (bile, concentrations élevées de NaCl, antibiotiques, etc.), c'est-à-dire sélection négative. Ce groupe comprend :
Environnement sélénite- est le meilleur milieu d'enrichissement pour les microbes de salmonelle et de dysenterie Sonne. Le sélénite de sodium contenu dans le milieu stimule la croissance de ces bactéries et inhibe la croissance de la flore associée.
Gélose au sulfite de bismuth - contient des sels de bismuth, vert brillant. Les salmonelles se développent sur ce milieu sous forme de colonies noires. D'autres types de bactéries ne se développent pas sur ce milieu.
Gélose jaune-sel (YSA) - le milieu d'isolement des staphylocoques contient jusqu'à 10 % de chlorure de sodium, ce qui supprime la plupart des bactéries contenues dans le matériau. De plus, ce milieu est également diagnostique différentiel, puisque la présence de jaune d'œuf permet de détecter l'enzyme lécithinase (lécitovitellase), formée par les staphylocoques pathogènes. La lécithinase décompose la lécithine en phosphocholines et en acides gras insolubles dans l'eau, de sorte que l'environnement autour des colonies lécithinase-positives devient trouble et qu'une zone opalescente apparaît sous la forme d'une « corolle arc-en-ciel ».
Bouillon biliaire sélectif pour les salmonelles, dont la reproduction est stimulée par l'ajout de 10 % de bile, tout en inhibant simultanément la croissance des micro-organismes qui l'accompagnent.
Gélose alcaline ou eau peptonée alcaline sont sélectifs pour Vibrio cholerae, la réaction alcaline de l'environnement (pH 9,0) n'empêche pas la croissance de Vibrio cholerae, mais inhibe la croissance d'autres micro-organismes. 3 à 5 jours. ET
3. Environnements de diagnostic différentiel. Les milieux de diagnostic différentiel sont utilisés pour différencier un type de micro-organisme d’un autre en fonction de la nature de leur activité enzymatique. La composition de ces milieux est choisie de manière à identifier clairement les propriétés les plus caractéristiques d'un certain type de micro-organisme, en fonction des caractéristiques de son métabolisme.
Milieux d'identification de la capacité protéolytique et hémolytique des microbes contenant des substances protéiques : sang, lait, gélatine, etc. Les milieux les plus courants sont la gélatine peptonée de viande (MPG), le sérum de cheval coagulé, le lait et la gélose au sang (BA).
Les milieux d'étude des propriétés glycolytiques comprennent trois composants principaux : une base nutritive (bouillon, gélose), un substrat (mono- et disaccharides, alcools polyhydriques) et un indicateur pour identifier les enzymes correspondantes. La dégradation enzymatique des substrats entraîne un changement de pH et un changement de couleur du milieu. Les plus courants sont les milieux colorés contenant divers glucides (par exemple, le bleu de bromothymol, un indicateur de pression artérielle). Les milieux Hiss sont également largement utilisés, qui prennent en compte les différences dans la capacité à fermenter divers glucides avec formation d'acide, ou d'acide et de gaz.
Pour différencier les entérobactéries, de l'eau peptonée est utilisée avec un ensemble de divers glucides, un indicateur d'Andrede et des flotteurs, qui facilitent la détection de la formation de gaz et aident à déterminer visuellement le changement de pH caractéristique de divers micro-organismes. En particulier, un passage du côté acide fait virer le milieu contenant le réactif d'Andréde au rouge ou au jaune lors de l'utilisation d'un milieu contenant du bleu de bromothymol, alors qu'une fois alcalinisés, l'indicateur d'Andréde et le bleu de bromothymol ne changent pas la couleur du milieu. Par exemple, pour isoler les bactéries pathogènes de l'intestin, on utilise des milieux qui permettent de différencier les micro-organismes pathogènes des habitants permanents de l'intestin - les micro-organismes qui décomposent le lactose.
Un tel milieu est le milieu Endo. Les principaux composants du milieu Endo sont le MPA, le lactose et la fuchsine basique, décolorés au sulfite de sodium. Le milieu nutritif initial est de couleur rose clair. Lorsque le lactose est fermenté, il se forme de l'acétaldéhyde qui réagit avec le sulfite et, lorsqu'elle est libérée, la fuchsine colore les colonies en rouge vif. Ainsi, E. coli, qui fermente le lactose, lorsqu'elle pousse sur ce milieu, forme des colonies rouges avec des reflets métalliques, tandis que Salmonella et Shigella sont incolores, car elles ne fermentent pas le lactose.
4. Supports de stockage, sur lequel se produit la croissance rapide de certains types de micro-organismes.
5. Médias de conservation (de transport). Conçu pour préserver les micro-organismes pendant le transport vers le site de recherche. Ces milieux contiennent des additifs qui empêchent la prolifération et la mort des microbes, ce qui contribue à maintenir leur viabilité. Les plus utilisés sont le mélange glycérol (milieu de Teague), le mélange phosphate-tampon et les milieux de Kari-Blair, Amies (avec charbon actif et sans charbon actif), Stewart et autres.
Stérilisation des milieux de culture.
Tous les milieux nutritifs, quelle que soit leur destination, sont versés dans des récipients propres et stérilisés. La plupart des milieux sont stérilisés par autoclavage, mais dans des conditions différentes selon leur composition.
1. Les milieux synthétiques et tous les milieux gélosés qui ne contiennent pas de protéines et de glucides natifs sont stérilisés pendant 15 à 20 minutes dans un autoclave à une température de 115 à 120°C et une pression de 1 à 1,5 atmosphères.
2. Les milieux contenant des glucides et du lait (qui comprend du lactose), de la gélatine nutritive sont stérilisés à la vapeur à une température de 100°C de manière fractionnée ou dans un autoclave à 112°C et à une pression allant jusqu'à 1 atmosphère.
3. Les milieux contenant des substances protéiques (sérum sanguin, liquide d'ascite) sont décontaminés par tindalisation ou filtration.
4. Pour stériliser les milieux de culture contenant des protéines natives, une filtration sur filtres à membrane Seitz est utilisée.
Pour contrôler la stérilité du milieu après stérilisation, placez-le dans un thermostat à 37°C pendant 3 à 5 jours. Les milieux liquides doivent rester clairs et aucun signe de croissance ne doit apparaître à la surface ou dans l’épaisseur des milieux de culture solides. En plus du contrôle de stérilité, un contrôle chimique des milieux préparés est effectué, qui consiste à déterminer le pH, la quantité d'azote total et aminé et de chlorures dans plusieurs échantillons de chaque série.
Il existe également un contrôle biologique des médias. Dans ce cas, plusieurs échantillons du milieu sont inoculés avec une culture de laboratoire du microbe pour lequel le milieu est préparé, et la nature de sa croissance est étudiée. Ce n’est qu’une fois que les médias ont passé le contrôle qu’ils peuvent être utilisés aux fins prévues.
Classification des milieux de culture :
Naturel– sont constitués de produits d’origine animale ou végétale et ont une composition chimique incertaine. Par exemple : jus de légumes et de fruits, tissus animaux, sang, lait, œufs, etc. (IPA, MPB).
Semi-synthétique– la composition comprend des composés de nature chimique connue et des substances de composition inconnue. Par exemple : MPB avec glucose, milieu Endo, milieu Sabouraud.
Synthétique– ne contiennent que des composés chimiquement purs dans des concentrations précises. Utilisé dans les expériences en laboratoire. Par exemple : environnement de Chapek, Omelyansky, Ushinsky, etc.
Objectif des milieux de culture
Universel(usage général) - adapté à la culture de nombreux types de micro-organismes et utilisé comme base pour des milieux nutritifs spéciaux. Exemples : MPB, MPA, milieu de Hottinger, GRM, milieu thioglycolate.
Spécial utilisé dans les cas où les micro-organismes ne se développent pas sur des supports simples. Ceux-ci comprennent le sang, la gélose au sérum, le bouillon de lactosérum, le bouillon d'ascite, la gélose à l'ascite et autres.
1. Environnements électifs- certains micro-organismes s'y développent plus rapidement et plus intensément que d'autres types de bactéries. Par exemple, l'eau peptonée alcaline à 1 % est un milieu électif pour les vibrions cholériques, le milieu de Roux et Leffler pour les agents pathogènes de la diphtérie.
2. Sélectif - grâce à des additifs sélectifs (bile, peintures, antibiotiques, etc.), ils sont capables de supprimer le développement de certains types de micro-organismes, mais n'affectent pas d'autres types. Exemples : Le milieu de Müller est sélectif pour les bactéries typhoïdes-paratyphoïdes, la gélose furazolidone-tween est sélective pour les corynébactéries et les microcoques. L'ajout d'antibiotiques aux milieux les rend sélectifs vis-à-vis des champignons (ex : milieu de Sabouraud...).
3. Diagnostic différentiel- un ensemble de milieux permettant de déterminer les propriétés biochimiques des micro-organismes et de les différencier. Ils sont divisés en milieux permettant de déterminer les propriétés protéolytiques, peptolytiques, saccharolytiques, hémolytiques, lipolytiques et réductrices (milieux Endo, Levin, Ploskirev, Gissa).
4. Conservateur (transport) -
conçu pour préserver la viabilité des micro-organismes dès le moment de la collecte
biomatériau avant culture pour diagnostic
Liquide(bouillons) – étude des caractéristiques physiologiques et biochimiques et de l’accumulation de la biomasse des micro-organismes
Semi liquide(1% agar) – conservation des cultures et culture des anaérobies
Dense(3-5% agar) – isolement de cultures pures, accumulation, enregistrement quantitatif, étude des propriétés culturelles, relations antagonistes
En gros– stockage de graines en industrie (mil, son)
Sec– produit par l’industrie pour la préparation de milieux nutritifs
Système de transport avec environnement Stuart
Le milieu de Stewart est un substrat semi-solide pauvre en nutriments destiné à la conservation et au transport d'un large éventail de micro-organismes pathogènes, tels que Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Corynebacterium diphteriae, Trichomonas vaginalis, Streptococcus sp., Salmonella sp., Shigella sp. etc. Les micro-organismes les plus exigeants survivent dans cet environnement pendant plus d'une journée, d'autres jusqu'à plusieurs jours.
La présence de thioglycolate dans le milieu supprime l'activité enzymatique des bactéries et l'absence d'azote empêche leur reproduction.
Système de transport avec environnement Keri Blair
Le milieu de transport de Keri Blair est une modification du milieu de transport de base de Stewart conçu spécifiquement pour les échantillons fécaux.
Glycérophosphate, qui est un métabolite de certaines entérobactéries ( Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, etc.), remplacé par du phosphate inorganique,
Le bleu de méthylène a été éliminé et le pH du milieu a été augmenté à 8,4.
Le milieu de Keri Blair permet la préservation de la plupart des pathogènes, y compris les micro-organismes fastidieux tels que Neisseria sp., Haemophilus sp., Streptococcus sp..
Ce milieu est standard pour le transport des anaérobies.
Système de transport avec environnement Ames
Le milieu de transport d'Ames est une autre modification du milieu de transport de base de Stewart, dans lequel le glycérophosphate est remplacé par du phosphate inorganique, puisque le glycérophosphate est un métabolite de certaines entérobactéries ( Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, etc..) et peut favoriser la croissance de certains micro-organismes à Gram négatif.
Le bleu de méthylène a été remplacé par du charbon actif de qualité pharmaceutique.
Du calcium et du magnésium ont été ajoutés au milieu pour maintenir la perméabilité des cellules bactériennes.
Cet environnement est capable de supporter des micro-organismes tels que Neisseria sp., Haemophilus sp., Corynebactéries, Streptocoques, Enterobacteriaceae etc., cependant, les meilleurs résultats sont obtenus en cultivant dans les premières 24 heures.
Milieux d'enrichissement universels : Gélose peptonée à la viande (MPA) et Bouillon peptoné à la viande (MPB)
Ce sont les principaux milieux d’inoculation des micro-organismes pour vérifier la pureté des cultures avant biochimique et sérotypage.
Ils sont utilisés pour cultiver et compter des micro-organismes sans prétention. Sous forme semi-liquide, le milieu peut être utilisé pour stocker des micro-organismes témoins (de référence).
Environnements de stockage universels Environnement Hottinger
Conçu pour la culture de divers micro-organismes, tels que les entérobactéries, Pseudomonas aeruginosa, les staphylocoques et certains types de streptocoques. Si nécessaire, il peut être enrichi en glucides et en sels.
Contient de l'hydrolysat de Hottinger, obtenu par hydrolyse enzymatique de viande hachée (bœuf) avec de la pancréatine, suivie d'une filtration et de l'ajout de chloroforme comme conservateur.
Environnements de stockage universels :Environnement Mueller-Hinton
Ce milieu est utilisé pour la culture Neisseria sp. et pour déterminer la sensibilité des micro-organismes aux agents antimicrobiens.
Mercredi McConkey
Les milieux MacConkey sont recommandés comme milieux différentiels pour l’isolement sélectif des entérobactéries et des bacilles Gram négatifs associés.
Les souches lactose-positives se développent avec des colonies roses ou rouges qui peuvent être entourées d'une zone de précipitation de sels biliaires.
La couleur rouge apparaît suite à l'acidification du milieu par les produits de décomposition du lactose (lorsque le pH descend en dessous de 6,8) et à l'adsorption du rouge neutre.
Les souches qui ne fermentent pas le lactose (Shigella, Salmonella) forment généralement des colonies transparentes et incolores et ne modifient pas l'environnement.
Environnements de diagnostic différentiel :Environnement endo
Ce milieu a été développé par Endo comme milieu de culture pour la différenciation des micro-organismes fermentant et non fermentant le lactose. Il est utilisé pour l'examen microbiologique de l'eau, des eaux usées, des produits laitiers et d'autres produits alimentaires.
Le sulfite de sodium et la fuchsine basique ont un effet inhibiteur sur les micro-organismes à Gram positif. Le lactose est décomposé par les micro-organismes en aldéhyde et en acide. L'aldéhyde, à son tour, libère la fuchsine du complexe fuchsine-sulfite, rehaussant la couleur rouge des colonies. Chez E. coli, cette réaction est très prononcée et s'accompagne d'une cristallisation de la fuchsine, qui se manifeste par un éclat métallique verdâtre (muchsin gloss) des colonies.
Environnements de diagnostic différentiel :Gélose au jaune et au sel
Ce milieu est utilisé comme milieu sélectif pour isoler des cultures de staphylocoques cliniquement significatives.
Le mannitol est un substrat fermentescible et différenciant ainsi qu'une source de carbone.
L'ajout (jusqu'à 5% v/v) d'émulsion de jaune d'oeuf permet de déterminer l'activité lipase des micro-organismes. L'émulsion en milieu salin devient transparente, donc, en présence d'activité lipase, une zone jaune opaque se forme autour des colonies.
Environnements de diagnostic différentiel :Gélose Wilson-Blair ou Sulfite de Bismuth
Milieu sélectif pour l'isolement des Salmonelles.
La digestion peptique de tissus animaux et d'extraits de viande constitue une source de nutriments azotés, de carbone, de soufre, de vitamines B et d'oligo-éléments nécessaires à la croissance de ces bactéries.
Le vert brillant inhibe la croissance de toutes les bactéries à Gram positif. Le glucose est un glucide fermentescible. Le sulfate ferreux peut détecter la production de sulfure d'hydrogène.
Le bismuth est un métal lourd qui inhibe la croissance de la plupart des bactéries intestinales à Gram négatif, à l'exception de Salmonella.
Les salmonelles réduisent le sulfate ferreux en présence de glucose et de sulfite de bismuth en sulfure ferreux, ce qui noircit leurs colonies.
Environnements optionnels spéciaux :L'environnement de Loeffler
Ce milieu additionné de sérum de cheval est utilisé pour la culture Corynebacterium diphtheriaeà partir de matériel clinique et de sous-cultures de cultures pures de ces micro-organismes.
Une concentration sérique élevée aide à déterminer l'activité protéolytique des micro-organismes, ainsi que la formation de pigments. La peptone et l'extrait de viande fournissent aux micro-organismes des nutriments essentiels. Le glucose est un substrat fermentescible et une source d'énergie.
Médias sélectifs spéciaux :Kampilobakagar
Milieu sélectif pour Campylobacter composé d’une base de gélose au sang avec du sang de mouton ou de cheval et des antibiotiques.
Les composants antimicrobiens inhibent considérablement la croissance de la microflore normale, favorisant ainsi la croissance et l'excrétion des matières fécales Campylobacter foetus ssp. jéjuni.
La présence d'amphotéricine B dans le supplément supprime de manière significative ou complète la croissance des champignons ; la céphalothine introduite ultérieurement améliore la suppression de la microflore intestinale normale.
Colonies Campylobacter foetus ssp. jéjuni avoir un caractère muqueux, gris plat aux contours irréguliers ou surélevés, ronds, sans hémolyse.
Certaines souches peuvent produire des colonies jaune-brun ou rosâtres.
Une croissance fusionnée ou un essaimage peuvent se produire sur une surface humide du milieu.
Les milieux nutritifs sont des substrats utilisés en laboratoire pour la culture de micro-organismes et d'autres objets biologiques. La croissance des micro-organismes dépend de la présence dans le milieu nutritif d'une quantité suffisante de substances organiques et inorganiques sous forme de sels divers, de vitamines, etc. Les milieux nutritifs doivent également avoir des propriétés physiques et chimiques optimales : pH, viscosité, humidité, osmotique propriétés.
Le plus souvent, les produits de dégradation partielle des protéines - peptones ou diverses infusions et extraits de viande - sont utilisés comme composant organique des milieux nutritifs. Ces composants sont utilisés dans la fabrication de nombreux milieux nutritifs dits conventionnels, le plus souvent utilisés pour la culture de cultures microbiennes, et constituent également la base de milieux nutritifs plus complexes. Les milieux de culture courants comprennent le bouillon de peptone de viande et le bouillon Hottinger. Selon le type de micro-organisme cultivé, les milieux de culture généraux contiennent des suppléments de divers facteurs de croissance bactérienne. Dans certains cas, il peut s'agir de vitamines et d'acides aminés purs, dans d'autres, d'extraits de divers substrats naturels. Par exemple, des additifs pour la digestion des tissus hépatiques sont utilisés pour cultiver des agents pathogènes, et l'agent pathogène de la coqueluche est cultivé sur des milieux contenant du sang.
Les milieux nutritifs spéciaux comprennent les milieux utilisés lorsqu'il est nécessaire d'identifier sélectivement tout type de micro-organisme ou ses propriétés biochimiques ou physiologiques individuelles dans le matériau étudié. Les milieux nutritifs spéciaux comprennent les éléments suivants.
1.Environnements électifs ou sélectifs et d'enrichissement. Dans de tels environnements, des conditions favorables sont créées pour le développement de tout type de micro-organisme, tandis que tous les autres types de microbes sont inhibés. Pour ce faire, on ajoute au milieu soit des nutriments que seul le microbe étudié peut utiliser, soit divers facteurs inhibiteurs auxquels ce microbe est insensible. Ce type de milieu de culture permet d'isoler et de déterminer la nature des micro-organismes présents dans le matériel étudié en très petites quantités par rapport à d'autres formes. Des exemples de milieux sélectifs sont les milieux contenant de la bile ou des sels biliaires et du vert brillant, ainsi que les milieux contenant du sélénite, qui sont utilisés pour isoler des bactéries intestinales pathogènes. Ces milieux suppriment E. coli. Pour les cultures primaires d'agents pathogènes de la diphtérie, on utilise du sérum de cheval coagulé, sur lequel tous les autres types de microbes se développent beaucoup plus lentement.
2. Environnements de diagnostic différentiel. Ces milieux de culture sont utilisés pour identifier les cultures bactériennes. L'utilisation de milieux nutritifs de diagnostic différentiel repose sur le fait que lorsque des bactéries s'y développent, des modifications chimiques se produisent dans les composants du milieu, qui peuvent être facilement observées. En tant que composant variable des milieux nutritifs de diagnostic différentiel, diverses substances protéiques, sucres et substances polyatomiques sont le plus souvent utilisées, à la suite de leur dégradation par les microbes, la réaction du milieu change, ce qui est pris en compte par le changement de couleur. d'indicateurs ajoutés au milieu, l'apparition de bulles de gaz, etc. Des exemples de milieux nutritifs de diagnostic différentiel largement utilisés peuvent servir de milieux de la série dite panachée, utilisés pour déterminer la capacité des microbes à fermenter divers sucres (milieux Hiss, etc.). Voir également Environnements de diagnostic différentiel.
Les milieux nutritifs constituent la base de la recherche bactériologique. Ils servent à isoler des cultures pures de microbes du matériau étudié et à étudier leurs propriétés. Les milieux nutritifs créent des conditions optimales pour la prolifération des micro-organismes. Les milieux doivent contenir les substances nécessaires à la construction de tous les composants du cytoplasme, c'est-à-dire toutes les sources de croissance d’un organisme vivant. Il s’agit principalement de sources d’azote, de carbone, d’hydrogène et d’oxygène.
La source d’hydrogène et d’oxygène dans les milieux nutritifs est l’eau. La source d'azote est constituée de composés organiques obtenus à partir de la viande, du poisson, du placenta, du lait, des œufs et du sang. À la suite de l'hydrolyse avec la pancréatine ou la trypsine, ces produits produisent ce qu'on appelle. des hydrolysats contenant une grande quantité d'acides aminés et de peptones, bien absorbés par la plupart des micro-organismes. La protéine native n'est digérée que par certains micro-organismes dotés d'exoprotéases. Les hydrolysats constituent la base de la préparation de milieux pour de nombreux micro-organismes.
La source de carbone pour les microbes pathogènes est principalement constituée de divers glucides : mono- et disaccharides, alcools polyhydriques, acides organiques et leurs sels.
En plus des organogènes, les bactéries ont besoin de composés inorganiques contenant du phosphore, du potassium, du soufre, du sodium, du magnésium, du fer, ainsi que des microéléments : cobalt, iode, manganèse, bore, zinc, molybdène, cuivre, etc.
Le besoin des micro-organismes en composés inorganiques est satisfait en ajoutant des sels KH2PO4 K2HPO4 et d'autres au milieu nutritif. Les microéléments qui agissent comme catalyseurs pour les processus chimiques sont nécessaires en quantités négligeables et pénètrent dans le milieu nutritif avec de la peptone, des sels inorganiques et de l'eau. Outre les éléments organiques répertoriés, de nombreux micro-organismes ont besoin de facteurs de croissance, c'est-à-dire dans des substances qu’ils ne peuvent pas synthétiser eux-mêmes. Les facteurs de croissance doivent être ajoutés aux milieux nutritifs sous une forme prête à l'emploi. Les facteurs de croissance comprennent diverses vitamines dont la source dans les milieux nutritifs sont des produits d'origine végétale et animale ajoutés au milieu nutritif, contenant des acides nicotinique, pantothénique, parabenzoïque, des vitamines A, B, C, etc.
Les nutriments ne peuvent être absorbés par les microbes que sous une certaine réaction environnementale, car la perméabilité des membranes cellulaires microbiennes change en fonction du pH de l'environnement.
Exigences relatives aux milieux nutritifs.
1. Les milieux de culture doivent contenir les nutriments nécessaires à l’alimentation des microbes.
2. Avoir une réaction de pH optimale pour le type de microbe cultivé. -
3. Les milieux nutritifs doivent avoir une humidité et une viscosité suffisantes, car les microbes se nourrissent selon les lois de la diffusion et de l’osmose.
4. Être isotonique et avoir un certain potentiel redox (rH2).
5. Les milieux de culture doivent être stériles, garantissant ainsi la possibilité de cultiver des cultures pures.
Les besoins en nutriments et en conditions physiques pour différents types de microbes ne sont pas les mêmes, ce qui exclut la possibilité de créer un milieu nutritif universel.
En fonction de la consistance, il existe des milieux nutritifs solides et liquides. Les denses sont préparés à base de liquides en y ajoutant des substances adhésives : agar-agar ou gélatine ! L'agar-agar (gelée en malais) est un produit d'origine végétale, extrait d'algues. L'agar-agar se dissout dans l'eau à une température de 80 à 86°C, durcit à 36-40°C et est donc utilisé pour compacter les milieux nutritifs permettant de cultiver différents groupes de micro-organismes à leur température optimale.
Les milieux nutritifs sont classés selon leur composition et leur fonction.
1.En fonction de la composition, les milieux nutritifs sont divisés en simples et complexes
Il existe un groupe d'environnements à usage général - simples. Ce groupe comprend le bouillon de viande-peptone (bouillon nutritif simple), la gélose viande-peptone (gélose simple nutritive) et la gélatine nutritive. Ces milieux sont utilisés pour cultiver de nombreux microbes pathogènes. Les milieux à usage général, ou milieux nutritifs simples, sont généralement préparés à partir d'hydrolysats additionnés de peptone et de chlorure de sodium. Ils servent également de base à la préparation de supports complexes.
2. Le deuxième groupe comprend les environnements de diagnostic électif, spécial et différentiel.
Environnements électifs (sélectif, sélectif, accumulation, enrichissement). Le principe de création de milieux nutritifs sélectifs repose sur la satisfaction des besoins biochimiques et énergétiques fondamentaux du type de microbe pour lequel ils sont destinés à la culture, ou sur l'ajout d'inhibiteurs qui suppriment la croissance de la microflore qui l'accompagne. Une certaine composition et concentration de nutriments, de microéléments, de facteurs de croissance à une valeur de pH strictement définie ou l'ajout d'inhibiteurs offrent des conditions optimales pour la culture d'un ou plusieurs types de micro-organismes. Lors du semis de matériel contenant un mélange de divers microbes, la croissance des espèces pour lesquelles l'environnement sera sélectif sera la première à se flétrir. Des exemples de milieux électifs sont le bouillon de jaune d'œuf, le bouillon de sélénite, le milieu de Ploskirev - pour la culture des microbes de la famille intestinale, l'eau peptonée alcaline - pour Vibrio cholerae.
Bouillon de jaune. 10 à 20 % de bile de bœuf sont ajoutés au MPB. La bile supprime la croissance des coques et de la flore aérienne, mais est favorable à la prolifération des salmonelles.
Bouillon de sélénite. Il se compose d'un bouillon de phosphate additionné de sel de sodium de sélénite, qui est un inhibiteur de la croissance de la flore coccique et d'Escherichia coli, mais n'inhibe pas la croissance des salmonelles.
Mercredi Ploskireva. Milieu dense contenant des inhibiteurs d'E. coli, coli, mais favorable à la croissance de Shigella et Salmonella, dont la reproduction n'est pas inhibée par le vert brillant et les sels biliaires.
Eau peptonée. Contient 1% de peptone et 0,5% de chlorure de sodium. L'environnement est sélectif pour les vibrions chlorés, car elles se multiplient mieux que les autres bactéries dans les « environnements affamés », notamment avec une réaction alcaline, car elles sécrètent elles-mêmes des déchets acides.
Environnements spéciaux. Nécessaire pour cultiver des bactéries qui ne se développent pas sur de simples milieux nutritifs. Pour certains organismes, il est nécessaire d’ajouter des glucides, du sang et d’autres nutriments supplémentaires à des milieux nutritifs simples. Des exemples de milieux nutritifs simples sont le bouillon de sucre et la gélose au sucre pour streptocoques (préparés respectivement à partir de MPB et de MPA, auxquels sont ajoutés 0,5 à 2 % de glucose).
Pour les pneumocoques et les méningocoques, le milieu spécial est le bouillon de lactosérum et la gélose de lactosérum (pour préparer le bouillon de lactosérum, 1 partie de MPB est mélangée avec 2 parties de sérum frais ; pour obtenir de la gélose de lactosérum, 10 à 25 % de sérum de cheval ou de bovin stérile est ajouté au mélange fondu. AMP).
Des milieux de diagnostic différentiel sont utilisés pour déterminer les espèces du microbe étudié, en fonction des caractéristiques de son métabolisme. Selon leur destination, les environnements de diagnostic différentiel sont répartis comme suit :
1. Milieux d'identification de la capacité protéolytique des microbes, contenant du lait, de la gélatine, du sang, etc.
2. Médias contenant des glucides et des alcools polyhydriques pour
détection de diverses enzymes saccharolytiques.
Des indicateurs sont ajoutés à la composition des milieux de diagnostic différentiel destinés à identifier les propriétés saccharolytiques et les enzymes rédox : rouge neutre, fuchsine acide, bleu de bromothymol, bleu aqueux avec acide rose (BP). En changeant de couleur selon différentes valeurs de pH, l'indicateur indique la présence d'une enzyme et la dégradation de l'ingrédient introduit dans le milieu.
Exemples d'environnements de diagnostic différentiel :
Environnement endo. Se compose de MPA additionné de 1% de lactose et de fuchsine basique (indicateur) décolorée au sulfite de sodium. Le milieu Endo a une couleur légèrement rose. Utilisé dans le diagnostic des infections intestinales pour différencier les bactéries qui décomposent le lactose pour former des produits acides des bactéries qui n'ont pas cette capacité. Les colonies de microbes lactose-positifs (Escherichia coli) sont rouges en raison de la réduction de la fuchsine. Les colonies de micro-organismes lactose-négatifs - salmonelles, shigelles, etc. - sont incolores.
Les environnements de diagnostic différentiel comprennent une série hétéroclite courte et étendue. Il se compose de milieux contenant des glucides (Hiss media), du MPB, du lait et de la gélatine viande-peptone.
Le milieu Hiss est préparé à base d'eau peptonée, à laquelle sont ajoutés des mono-, di- ou polysaccharides chimiquement purs (glucose, lactose, amidon, etc.).
Pour détecter les changements de pH résultant de la formation d'acides et de la décomposition des glucides, un indicateur est ajouté au milieu. Avec une dégradation plus profonde des glucides, des produits gazeux (CO2, CH4, etc.) se forment, qui sont capturés à l'aide de flotteurs - de petits tubes à essai descendus à l'envers dans le milieu. Les milieux contenant des glucides peuvent également être préparés sous forme dense - avec l'ajout de 0,5 à 1 % d'agar-agar. La formation de gaz est alors détectée par la formation de bulles (cassures) dans la colonne du milieu.
Sur le MPB, qui fait partie de la série hétéroclite, on retrouve des produits formés lors de la dégradation des acides aminés et des peptones (indole, sulfure d'hydrogène). Le sulfure d'hydrogène est détecté en plaçant une bande de papier filtre imbibée d'une solution d'acétate de plomb dans le MPB après avoir semé la culture. Lorsque les acides aminés contenant du soufre sont décomposés, du sulfure d'hydrogène est libéré et le papier devient noir en raison de la formation de sulfure de plomb. Un indicateur complexe peut être utilisé pour déterminer l'indole. L'indole est formé par la dégradation du tryptophane et peut être détecté lorsque cet indicateur est ajouté à une culture cultivée sur du MPB. En présence d'indole, le MPB devient vert ou bleu.
Environnements secs.
La gélose nutritive, ainsi que les principaux milieux de diagnostic différentiel, sont actuellement produits sous forme de préparations sèches contenant tous les composants nécessaires. Pour ces poudres, il suffit d'ajouter de l'eau et de les faire bouillir, puis, après les avoir versées, de les stériliser.
