Hyrje në vepër
Rëndësia e problemit. Murtaja është një sëmundje infektive bakteriale në karantinë fokale natyrore zoonotike, veçanërisht e rrezikshme me një mekanizëm të transmetueshëm të transmetimit të patogjenit [Cherkassky, 1996]. Murtaja përbën një kërcënim real për popullatën për shkak të ekzistencës së vatrave të shumta natyrore të murtajës, disa prej të cilave ndodhen në Federatën Ruse dhe vendet fqinje [Onshtsenko et al., 2004]. Ekziston një probabilitet i lartë që patogjeni i murtajës të futet në Rusi nga vendet fqinje që janë të paprekura nga kjo sëmundje, si dhe si rezultat i akteve bioterroriste. Sipas OBSH-së, më shumë se 2000 raste të murtajës regjistrohen çdo vit në mbarë botën, shumë prej të cilave janë fatale. Një shpërthim i madh i murtajës pneumonike në vitin 2009 ndodhi në Rajonin Autonom të Tibetit Hainan të Kinës, i cili gjithashtu raportoi një numër vdekjesh. Të gjitha këto fakte kërkojnë urgjentisht zhvillimin e metodave të reja, shumë efektive për diagnostikimin e patogjenit të murtajës, të bazuara në teknologjitë moderne, si dhe mjete për parandalimin dhe trajtimin e sëmundjes veçanërisht të rrezikshme që ajo shkakton.
Klasifikimet e përdorura deri më tani Yersinia pestis vetëm morfologjike, kulturore, biokimike dhe karakteristika të tjera fenotipike janë marrë parasysh [Bezsonova, 1928; Borzenkov, 1938; Tumansky, 1957; Timofeeva, 1968; Kutyrev, Protsenko, 1998; Devignat, 1951] dhe nuk ishin pa disavantazhe të lidhura me ndryshueshmërinë e këtyre vetive. Sidoqoftë, përparimet e fundit në gjenetikën themelore dhe mikrobiologjinë molekulare bëjnë të mundur zhvendosjen e zgjidhjes së problemeve të sistematizimit të agjentit shkaktar të murtajës në një nivel cilësor të ri, bazuar në përdorimin e veçorive të tij gjenetike molekulare.
Në përputhje me klasifikimin vendas të pranuar aktualisht, shtamet e patogjenit të murtajës ndahen në nëngrupet kryesore dhe 4 të vogla (Kaukaziane, Altai, Gissar dhe Ulegey) [Timofeeva, 1985; Kutyrev, Protsenko, 1998]. Sipas klasifikimit të huaj të përbashkët, shtamet Y. pestis Bazuar në dallimet në një sërë vetive biokimike (aftësia për të fermentuar glicerinën, për të reduktuar nitratet, për të oksiduar amoniakun) dhe në bazë historike dhe gjeografike, ato ndahen në tre biovarë: antiqua (antike), medievalis (mesjetare) dhe orientalis (lindore. ). Sipas karakteristikave fenotipike, shtamet e nëngrupeve kryesore korrespondojnë me tre biovarë (të lashtë, mesjetar dhe oriental) të pranuar në klasifikimin e huaj. Megjithatë, sforcimet Y. pes-
4 tis që qarkullojnë në vatra natyrore të murtajës në Federatën Ruse dhe vendet fqinje mbeten të pa sistemuara sipas përkatësisë së tyre në biovarë të caktuar.
Sipas shprehjes së karakteristikave diferenciale të rëndësishme biokimike, më aktivët janë shtamet e biovarit të lashtë ". pestis nuk janë në gjendje të reduktojnë nitratet, por fermentojnë glicerinë dhe arabinozën; Llojet e biovarit lindor nuk fermentojnë glicerinë, por reduktojnë në mënyrë aktive nitratet dhe përdorin arabinozën.
Llojet e nëngrupeve kryesore që qarkullojnë në Federatën Ruse dhe vendet fqinje janë, si rregull, shumë virulente dhe kanë një rëndësi të lartë epidemike. Ata nuk fermentojnë ramnozën dhe melibiozën, nuk janë të ndjeshëm ndaj PESTICE I dhe kanë një nivel të lartë të prodhimit të isocitralazës. Llojet e nëngrupeve të vogla fermentojnë ramnozën dhe melibiozën, janë të ndjeshme ndaj pesticinës I, nuk shfaqin aktivitet izocitrate-liazë, janë virulente selektive për kafshët laboratorike dhe kanë pak rëndësi epidemike.
Arsyet gjenetike për shprehje të ndryshme të karakteristikave biokimike dhe shtameve të përdorura në ndarje Y. pestis në biovarët dhe nëngrupet mbeten ende mjaft të studiuara deri më sot. E vetmja gjë që është vërtetuar me besueshmëri është se arsyeja e mungesës së fermentimit të glicerinës në shtamet e biovarit lindor është një mutacion në gjenin e glicerol-3-fosfat dehidrogjenazës. (glpD). U tregua se në këtë gjen të gjitha shtamet e biovarit lindor kanë një fshirje prej 93 bp. . Në literaturë ka vetëm disa punime për përcaktimin e dallimeve në strukturën e gjeneve Y. pestis nënspecie kryesore dhe të vogla, përgjegjëse për reduktimin e nitrateve dhe fermentimin e ramnozës [Kukleva et al., 200 2009; Anisimov et al., 2004; Zhou et al., 2004].
Arsyet për heterogjenitetin e shtameve të murtajës për sa i përket nevojave ushqyese mbeten të panjohura. Llojet nga vatra të ndryshme natyrore të murtajës ndryshojnë në nevojat ushqyese, të përcaktuara nga shqetësimet në gjenet ndërmjetëse të metabolizmit, të cilat mund të përdoren në një skemë gjenetike për diferencimin e shtameve Y. pestis nga vatra të ndryshme natyrore të murtajës.
Identifikimi i ndryshimeve në strukturën e gjeneve që qëndrojnë në themel të shprehjeve të ndryshme të tipareve mikrobiologjike dhe biokimike do të shërbejë si informacion i besueshëm për krijimin e një skeme gjenetike për klasifikimin e shtameve të patogjenit të murtajës, si dhe për përcaktimin e drejtimeve kryesore të evolucionit intraspecifik. Y. pestis.
5 Qëllimi i punës. Përcaktimi i bazës gjenetike për shprehjen e ndryshme të karakteristikave biokimike të përdorura për të ndarë shtamet e patogjenit të murtajës në nënspecie dhe biovarë.
Objektivat e kërkimit:
Karakterizoni sforcimet e përdorura në punë Y. pestis, izoluar në vatra natyrore të murtajës në Federatën Ruse dhe vendet fqinje, sipas vetive biokimike (reduktimi i nitrateve, prodhimi i liazës izosocitrate, fermentimi i arabinozës dhe melibiozës), të cilat qëndrojnë në bazë të ndarjes në nëngrupe dhe biovare. Për të përcaktuar nëse shtamet që qarkullojnë në Rusi dhe vendet fqinje i përkasin biovarëve të caktuar.
Për të studiuar organizimin strukturor dhe funksional të gjeneve që kodojnë karakteristikat diferenciale të përdorura në ndarjen në biovarë - reduktimi i nitrateve dhe fermentimi i arabinozës.
Identifikoni ndryshimet në gjene Y. pestis, përcaktimi i fermentimit të melibiozës dhe prodhimit të liazës izocitrate, të cilat qëndrojnë në themel të diferencimit të nënspecieve kryesore dhe të vogla të patogjenit të murtajës.
Përcaktoni nevojat ushqyese të shtameve Y. pestis Nëngrupet kaukaziane dhe vendosin bazën gjenetike të auksotrofisë së tyre.
Vlerësoni perspektivat e përdorimit të rezultateve të marra për të krijuar një skemë gjenetike për klasifikimin intraspecifik të shtameve Y. pestis dhe përcaktimi i drejtimeve kryesore të evolucionit intraspecifik të këtij patogjeni.
Risi shkencore e veprës. Bazuar në të dhënat nga analizat komplekse mikrobiologjike, biokimike dhe gjenetike, u vërtetua se shtamet e patogjenit të murtajës që qarkullojnë në vatra natyrore të Federatës Ruse dhe vendeve fqinje i përkasin biovarëve antikë dhe mesjetarë.
Për herë të parë u tregua se arsyeja e mungesës së aktivitetit reduktues të nitratit në disa shtame të nëngrupeve kryesore që qarkullojnë në Federatën Ruse dhe vendet fqinje është prania e një zëvendësimi të vetëm nukleotid G-»T në pozicionin 613 të gjeni periplazmik i nitrat reduktazës - çift, gjë që vërteton se këto shtame i përkasin një biovari mesjetar. Mungesa e shprehjes së këtij tipari në shtamet e nëngrupeve Altai dhe Gissar shkaktohet nga futja e një nukleotidi të timusit (+T) në pozicionin 302 të një gjeni tjetër - ssuA, gjë që çon në një zhvendosje të kornizës së leximit dhe prishje të strukturës së proteinës së transportit të koduar - SsuA, e përfshirë gjithashtu në reduktimin e nitrateve.
Për herë të parë u konstatua se mungesa e fermentimit të arabinozës në shtame] pestis Nëngrupet Altai dhe Hissar shoqërohen me praninë e një mutacioni në gjenin rregullator të operonit arabinoz - po, i cili përmban një futje të një nukleotidi guanine (+G) në pozicionin 773 nga fillimi i gjenit, duke çuar në një zhvendosje të kornizës dhe prishje të strukturës së proteinës rregulluese AgaC, e cila është e nevojshme për të filluar transkriptimin e gjeneve të operonit arabinoz. .
Për herë të parë, është vendosur baza gjenetike e prodhimit të ndryshëm të izocitr-liazës në shtamet e patogjenit të murtajës të nënspecieve kryesore dhe të vogla, e shoqëruar me praninë e një futjeje të dy nukleotideve (+CC) në gjenin rregullator. iclR në pozicionin 26! 270, e cila çon në inaktivizimin e proteinës acetate operon shtypëse IclR të koduar prej saj dhe është shkaku i sintezës konstituive të enzimës izocitr liazë në shtamet e nëngrupit kryesor. Llojet e nënspecieve të vogla përmbajnë një gjen shtact iclR dhe nuk janë të afta për sintezën konstituive të izocitrat liazës.
Është treguar se mungesa e fermentimit të melibiozës në shtame Y. pestis nëntipi kryesor është për shkak të futjes së një sekuence futjeje IS285 gjen melB, kodifikon enzimën galaktoside permeazë. Në shtamet e nënspecieve jo të mëdha, futja IS2&5 në gjen melB mungon.
Për herë të parë, baza gjenetike e auxotrofisë së shtameve të nënspecieve Kaukaziane, të cilat janë të lidhura Me zbatimi i sekuencave të futjes IS100 gjenet argA Dhe aroF, fut 10 bp. në gjen aroG, futja e gjenit të nukleotideve të timinës thiHv. 13 bp fshirje në gjen thiG.
Karakteristikat molekulare të marra të shtameve Y. pestis Nënspeci kryesor dhe neo-ri i bazuar në gjenet që kodojnë karakteristikat biokimike që qëndrojnë në themel të ndarjes në nënspecie dhe biovarë, krijon bazën për zhvillimin e një skeme gjenetike për klasifikimin intraspecifik të patogjenit të murtajës.
Bazuar në rezultatet e punës, u depozituan aplikime për shpikjen "Metodë për përcaktimin e nëngrupeve të shtameve patogjene të murtajës me metodën e sekuencës" (Nr. 2009116913. Prioriteti i datës 14 maj 2009. U mor vendim për lëshimin e një patente dhe " Metoda për diferencimin e nënspecieve të shtameve Yersinia pestis me metodën e shtypjes së sekuencës shumështresore (Nr. 2009146094. Prioriteti nga 11.12.2009).
Rëndësia praktike e punës. Bazuar në rezultatet e punës, u hartuan dhe miratuan rekomandimet metodologjike "Përcaktimi i nëngrupeve të shtameve patogjene të murtajës bazuar në sekuencën e gjeneve". rhaS Dhe po, kontrollin e fermentimit të ramnozës dhe arabinozës" (miratuar nga drejtori i RosNIHR "Microbe". Protokolli nr. 6 i datës 16 qershor 2009) dhe "Përcaktimi i nënspecieve;
7 karakteristikat e tendosjes Yersinia pestis me metodën e shtypjes së sekuencës multilocus (miratuar nga drejtori i RosNIPCI "Microbe". Protokolli nr. 1 i 23 shkurt 2010).
Tre shtame janë depozituar në Koleksionin Shtetëror të Baktereve Patogjene: Y. pestis KM 910 i Altai, KM 596 i Gissar dhe KM 1861 i nënspecieve Ulega si shtame referimi të këtyre nënspecieve.
Të dhënat mbi organizimin gjenetik të shtameve të marra gjatë studimit Y. pestis përdoren gjatë dhënies së leksioneve mbi temën "Genetika e Agjentit Shkaktar të Murtajës" në kurse specializimi dhe trajnimi të avancuara në RosNIPCI "Microbe".
Dispozitat për mbrojtjen:
Llojet e agjentit shkaktar të murtajës të nënspecieve kryesore, që qarkullojnë në vatra natyrore të Federatës Ruse dhe vendeve fqinje, i përkasin biovarëve antikë dhe mesjetarë, siç dëshmohet nga të dhënat nga një analizë gjithëpërfshirëse e vetive mikrobiologjike, biokimike dhe gjenetike të këtyre shtameve.
Baza për manifestimet e ndryshme të karakteristikave biokimike të përdorura gjatë ndarjes së shtameve Y. pestis nëngrupet dhe biovaret përmbajnë lloje të ndryshme mutacionesh në gjenet që kodojnë këto tipare. Mungesa e aftësisë për të reduktuar nitratet në shtamet e nëngrupeve kryesore të biovarit mesjetar shoqërohet me praninë e një mutacioni të pakuptimtë (G - T) në gjen. çift nitrat reduktaza periplazmike, dhe në shtamet e nëngrupeve Altai dhe Gissar - me futjen e një nukleotidi të vetëm në gjen ssuA proteina transportuese periplazmike SsuA. Mungesa e fermentimit të arabinozës në shtamet e nënspecieve Altai dhe Gissar është për shkak të futjes së një nukleotidi guanine në sekuencën e gjeneve. poS.
Aktiviteti i ndryshëm biokimik i shtameve të nënspecieve kryesore dhe të vogla të patogjenit të murtajës, sipas një numri karakteristikash diferenciale, shkaktohet nga zvogëlimi i gjeneve që i kodifikojnë ato në nënspeciet kryesore dhe paprekshmëria e tyre në nëngrupin e vogël. Mungesa e fermentimit të melibiozës nga shtamet e nënspecieve kryesore është për shkak të futjes në gjen melB galaktoside permeaza, dhe sinteza përbërëse e liazës izocitrate në shtamet e këtij nëngrupi është për shkak të futjes së dy nukleotideve (CC) në sekuencën e gjenit rregullator iclR. Llojet e nëngrupeve të vogla përmbajnë gjene të paprekura melB Dhe iclR.
Shkak i kërkesave të shumta ushqyese të shtameve Y. pestis Nënspecia kaukaziane është inaktivizimi i një numri gjenesh për biosintezën e aminoacideve dhe vitaminave. Varësia e shtameve të këtij nëngrupi nga arginina shkaktohet nga futja e IS70O në gjen. argA, për fenilalaninë - insert 10 bp. në gjen aroG, për tirozinë - futje IS100 në gjen aroF, për tiaminë (BO me fshirje të 13 bp - në gjen thiG dhe futja e një të vetme
Nukleotidi i 8-të në MN. Bazuar në të gjithë kompleksin e mutacioneve të identifikuara për shtamet e nënspecieve kaukaziane dhe të tjera, si dhe biovarët e patogjenit të murtajës, u përcaktuan gjenotipe karakteristike që mund të përdoren për të krijuar një skemë gjenetike për klasifikimin intraspecifik. Y. pestis.
Miratimi i punës. Materialet e disertacionit u prezantuan dhe u diskutuan në Konferencën IX Shkencore dhe Praktike Ndërshtetërore të Shteteve Anëtare të CIS "Teknologjitë moderne në zbatimin e strategjisë globale për luftimin e sëmundjeve infektive në territorin e shteteve anëtare të Komonuelthit të Shteteve të Pavarura", Volgograd , 2008; Konferenca e VI Ndërkombëtare “Diagnostika Molekulare dhe Biosiguria”, M., 2009; Shkolla shkencore dhe praktike e konferencës së shkencëtarëve dhe specialistëve të rinj të Shërbimit Federal për Mbikëqyrjen e Mbrojtjes së të Drejtave të Konsumatorit dhe Mirëqenies së Njeriut “Teknologjitë moderne për garantimin e sigurisë biologjike”, 25-27 maj 2010; në konferencat përfundimtare vjetore të RosNIPCI "Microbe", Saratov 2008 - 2010.
Teza
Odinokov, Georgy Nikolaevich
Diplomë akademike:
Kandidat i Shkencave Biologjike
Vendi i mbrojtjes së tezës:
Kodi i specialitetit HAC:
03.02.03, 03.02.07
Specialiteti:
Mikrobiologjia
Numri i faqeve:
PREZANTIMI
KAPITULLI 1. SHQYRTIMI I LITERATURËS
1.1. Idetë moderne rreth organizimit të gjenomit të patogjenit të 15-të të murtajës
1.2. Skemat e klasifikimit intraspecifik për Yersinia pestis 28 KËRKIM VET
KAPITULLI 2. MATERIALET DHE METODAT
2.1. Llojet bakteriale të përdorura në punë dhe kushtet e kultivimit të tyre 36
2.2. Metodat për studimin e aktivitetit denitrifikues, 46 fermentimi i glicerinës, arabinozës, ramnozës, melibiozës, izocitralazës në shtamet e Y. pestis
2.3. Përcaktimi i kërkesave ushqyese të shtameve Y. pestis
2.4. Izolimi i ADN-së bakteriale
2.5. Kryerja e reaksionit zinxhir të polimerazës
2.6. Regjistrimi elektroforetik i rezultateve
2.7. Përcaktimi i sekuencave nukleotide të gjeneve
2.8. Kryerja e analizave filogjenetike
KAPITULLI 3. ANALIZA E VETITË MIKROBIOLOGJIKE DHE BIOKEMIKE TË SHTESAVE TË Y. pestis TË NËNSPEKTEVE PRIMARE DHE JO KRYESORE NGA TË NDRYSHME NATYRORE
MURTAJA FOKUSET
3.1. Karakteristikat e shtameve Y. pestis nga vatra të ndryshme natyrore të murtajës sipas karakteristikave biokimike që qëndrojnë në bazë të ndarjes në nëngrupe dhe biovarë
3.2. Përcaktimi i nevojave ushqyese të shtameve K resNB të nënspecieve Kaukaziane
KAPITULLI 4. PËRCAKTIMI I STRUKTURO-FUNKSIONALE 60 ORGANIZIMI I GJENEVE KOKODIME TË KARAKTERISTAVE BIOKIMIKE TË PËRDORUR PËR DIFEENCIIMIN E BIOVARS TË SHKAKUT TË MURTAJËS
4.1. Përcaktimi i organizimit strukturor dhe funksional të gjeneve të çifteve 60 të operonit dhe gjeneve të tjera që kodojnë reduktimin e nitratit
4.2. Analiza krahasuese e ndryshueshmërisë së sekuencave nukleotide të gjeneve të operonit arabinoz në shtamet e operonit K.
KAPITULLI 5. IDENTIFIKIMI I NDRYSHIMEVE NË KODIMIN E GJENIT 83 KARAKTERISTIKAT DIFERENCIALE TË PËRDORUR KUR NDAREN SHKAKUT MURTAJËS NË NËNSPEKTET KRYESORE DHE JO KRYESORE
5.1. Identifikimi i ndryshimeve në strukturën e gjeneve në shtamet e agjentit shkaktar të murtajës 83 të nëngrupeve kryesore dhe të vogla që kodojnë fermentimin e melibiozës
5.2 Përcaktimi i mutacioneve në gjenet e biosintezës së isocitratit liazës në shtamet U. periasus
kapitulli 6
6.1. Analiza krahasuese kompjuterike e ndryshueshmërisë së sekuencave nukleotide të gjeneve të përfshira në biosintezën e argininës
6.2. Zbulimi i mutacioneve në gjenet për biosintezën e fenilalaninës, tirozinës dhe 101 vitaminës B1 (tiaminë)
6.3. Studimi i gjendjes strukturore dhe funksionale të gjeneve për biosintezën e argininës, fenilalaninës, tirozinës dhe vitaminës B1 (tiaminë) në shtamet e nënspecieve Kaukaziane
KAPITULLI 7. VLERËSIMI I PERSPEKTIVESËS SË TË DHËNAVE TË PËRFITUARA PËR KRIJIMIN E NJË SKEME GJENETIKE TË KLASIFIKIMIT INTRA-SPECIFIK TË SHKAKTORIT TË MURTAJËS
Prezantimi i disertacionit (pjesë e abstraktit) Me temën "Analiza gjenetike e karakteristikave biokimike të shtameve Yersinia pestis të nëngrupeve kryesore dhe të vogla"
Rëndësia e problemit
Murtaja është një sëmundje infektive bakteriale në karantinë, fokale natyrore zoonotike, veçanërisht e rrezikshme me një mekanizëm të transmetueshëm të transmetimit të patogjenit [Cherkassky, 1996]. Murtaja paraqet një kërcënim real për popullatën për shkak të ekzistencës së vatrave të shumta natyrore të murtajës, 42 prej të cilave ndodhen në Federatën Ruse dhe vendet fqinje [Onischenko et al., 2004]. Ekziston rreziku që patogjeni i murtajës të futet në Rusi nga vendet fqinje të paprekura nga kjo sëmundje, si dhe si pasojë e akteve bioterroriste. Sipas OBSH-së, më shumë se 2000 raste të murtajës regjistrohen çdo vit në mbarë botën, shumë prej të cilave janë fatale. Një shpërthim i madh i murtajës pneumonike në vitin 2009 ndodhi në Rajonin Autonom të Tibetit Hainan të Kinës, i cili gjithashtu raportoi një numër vdekjesh. Të gjitha këto fakte kërkojnë urgjentisht zhvillimin e metodave të reja, shumë efektive diagnostikuese të bazuara në teknologjitë moderne për shkaktarin e murtajës, mjetet e parandalimit dhe trajtimit të sëmundjes veçanërisht të rrezikshme që ajo shkakton.
Klasifikimet e Yersenia pestis të përdorura deri më tani kanë marrë parasysh vetëm vetitë morfologjike, kulturore, biokimike dhe të tjera fenotipike, si dhe dallimet në virulencën e shtameve patogjene [Bezsonova, 1928; Berlin A.JL et al., 1938; Tumansky, 1959; Timofeeva, 1972; Kutyrev et al., 1998; Devignat, 1951; Dale et al., 2002; Cobbs et al., 2004; Dennis et al, 2004; Lazarus et al., 2004]. Klasifikime të tilla, natyrisht, kontribuan në sistemimin e Y. pestis dhe në përgjithësi pasqyrojnë marrëdhëniet filogjenetike ekzistuese në këtë specie. Ata nuk e kanë humbur rëndësinë e tyre deri më sot dhe përdoren ende gjerësisht në mikrobiologjinë praktike, megjithatë, përparimet e fundit në gjenetikën themelore dhe mikrobiologjinë molekulare bëjnë të mundur transferimin e zgjidhjes së problemeve të sistemimit të agjentit shkaktar të murtajës në një nivel cilësor. bazuar në përdorimin e veçorive të tij gjenetike molekulare Përkthimi i klasifikimit ekzistues të patogjenit të murtajës mbi baza gjenetike do të përmirësojë besueshmërinë, besueshmërinë dhe cilësinë e sistemimit, si dhe do të shmangë disavantazhet e qenësishme të skemave klasike për shkak të ndryshueshmërisë së Vetitë fenotipike të patogjenit Gjenomi bakterial ka një strukturë mjaft konservatore, të mbrojtur nga ndryshimet e rastësishme nga sistemet e riparimit të ADN-së, dhe për këtë arsye skemat e diferencimit gjenetik janë më të besueshme, të riprodhueshme dhe kanë rezolucion më të madh në krahasim me klasifikimet fenotipike.
Në përputhje me klasifikimin vendas të pranuar aktualisht, shtamet e patogjenit të murtajës ndahen në nëngrupet kryesore dhe 4 të vogla (Kaukaziane, Altai, Gissar dhe Ulegei) [Kutyrev et al., 1998]. Sipas klasifikimit të gjerë të huaj, shtamet e 7. parabeneve, bazuar në dallimet në një sërë vetive biokimike (aftësia për të fermentuar glicerinën, për të reduktuar nitratet, për të oksiduar amoniakun) dhe në një parim historik dhe gjeografik, ndahen në tre biovarë: anpyanaia. (e lashtë), tesNeuainz (mesjetare) dhe openianus (orientale). Sipas karakteristikave fenotipike, shtamet e nëngrupeve kryesore korrespondojnë me tre biovarë (të lashtë, mesjetar dhe oriental) të pranuar në klasifikimin e huaj. Megjithatë, shtamet e patogjenit të murtajës që qarkullojnë në vatra natyrore të murtajës c. Federata Ruse dhe vendet fqinje mbeten të pa sistemuar nga përkatësia biovare.
Për sa i përket shprehjes së karakteristikave biokimike diferenciale të rëndësishme, më aktivet janë shtamet e biovarit antik. Ata fermentojnë glicerinën dhe kanë aktivitet denitrifikues. Llojet e biovarit mesjetar U. reese nuk janë të afta të reduktojnë nitratet, por fermentojnë glicerinë dhe arabinozën. Llojet e biovarit lindor nuk fermentojnë glicerinë, por reduktojnë në mënyrë aktive nitratet dhe përdorin arabinozën.
Arsyet gjenetike për shprehjen e ndryshme të karakteristikave biokimike të përdorura në ndarjen e shtameve të Y. pestis në biovare mbeten të studiuara mjaftueshëm deri më sot. Në literaturë ka një numër të kufizuar botimesh për këtë çështje. E vetmja gjë që është vërtetuar me besueshmëri është se arsyeja e mungesës së fermentimit të glicerinës në shtamet e biovarit lindor është një mutacion në gjenin e glicerol-3-fosfat dehidrogjenazës (glpD). U tregua se të gjitha shtamet e biovarit lindor kanë një fshirje prej 93 bp në këtë gjen. . Ka të dhëna kontradiktore në lidhje me ndryshimet në gjenet që përcaktojnë karakteristika të tjera biokimike të përdorura në diferencimin e biovareve.
Ndarja e Y. pestis në nënspecie në përputhje me klasifikimin e miratuar në 1985 në Mbledhjen Gjithë Bashkimi për Taksonominë e Mikrobit të Murtajës bazohet në aktivitetin e pabarabartë biokimik të shtameve, ndryshimet e tyre në virulencë në lidhje me kafshët laboratorike dhe vendndodhje të ndryshme peizazhore-gjeografike [ Kutyrev, Protsenko, 1998; Anisimov et al., 2004]. Llojet e nëngrupeve kryesore janë, si rregull, shumë virulente dhe kanë rëndësi të lartë epidemike. Ata nuk fermentojnë ramnozën dhe melibiozën, nuk janë të ndjeshëm ndaj pesticinës I dhe kanë një nivel të lartë të prodhimit të isocitralazës. Llojet e nënspecieve të vogla fermentojnë ramnozën dhe melibiozën, janë të ndjeshme ndaj pesticinës I, nuk shfaqin aktivitet izocitrat-liazë, janë virulente selektive për kafshët laboratorike dhe kanë një rëndësi të vogël epidemike.
Baza gjenetike e aktivitetit të ndryshëm biokimik të shtameve që shkaktojnë murtajën e nëngrupeve të ndryshme praktikisht nuk është studiuar. Jashtë vendit, kjo çështje është studiuar pak për shkak të mungesës në koleksionet e huaja të shtameve të nënspecieve të vogla, të cilat shpërndahen kryesisht në vatra natyrore të Federatës Ruse dhe vendeve fqinje. Në literaturën vendase ka vetëm disa punime për përcaktimin e dallimeve në strukturën e gjeneve, U. resI të nënspecieve kryesore dhe jo kryesore; kodimi i reduktimit të nitrateve dhe fermentimit të ramnozës [Eroshenko et al., 2008; Kukleva etj., 2008, 2009]. Llojet e patogjenit të murtajës të nënspecieve kryesore dhe të vogla që qarkullojnë në Rusi dhe vendet fqinje mbeten të pastudiuara për sa i përket strukturës së gjeneve të përfshira në reduktimin e nitrateve, fermentimin e glicerinës, arabinozës, melibiozës, liazës izocitrate dhe karakteristikave të tjera të rëndësishme për klasifikimin. Arsyeja për heterogjenitetin e shtameve të mikrobeve të murtajës për sa i përket nevojave ushqyese nuk është vërtetuar. Llojet nga vatra të ndryshme natyrore të murtajës kanë nevoja të ndryshme ushqyese, të përcaktuara nga shqetësimet në gjenet e metabolizmit të ndërmjetëm, të cilat mund të përdoren në një skemë gjenetike për diferencimin e tendosjeve ¥. ngrihen nga vatra të ndryshme natyrore të murtajës.
Identifikimi i ndryshimeve në strukturën e gjeneve që qëndrojnë në themel të shprehjes së ndryshme të tipareve mikrobiologjike dhe biokimike do të shërbejë si një bazë e besueshme për krijimin e një skeme gjenetike për klasifikimin e shtameve të patogjenit të murtajës, si dhe për përcaktimin e drejtimeve kryesore të evolucionit intraspecifik të U. pechnia.
Qëllimi i punës. Përcaktimi i bazës gjenetike për shprehjen e ndryshme të karakteristikave biokimike të përdorura për të ndarë shtamet e patogjenit të murtajës në nënspecie dhe biovarë.
Objektivat e kërkimit:
1. Karakterizoni shtamet e G. resiz të përdorura në punim, të izoluara në vatra natyrore të murtajës në Federatën Ruse dhe vendet fqinje, sipas vetive biokimike (reduktimi i nitrateve, prodhimi i iso-citrat liazës, fermentimi i arabinozës dhe melibiozës. ), të cilat qëndrojnë në bazë të ndarjes në nëngrupe dhe biovarë. Për të përcaktuar nëse shtamet që qarkullojnë në Rusi dhe vendet fqinje i përkasin biovarëve të caktuar.
2. Studioni organizimin strukturor dhe funksional të gjeneve që kodojnë karakteristikat diferenciale të përdorura në ndarjen në biovare - reduktimi i nitrateve dhe fermentimi i arabinozës.
3. Të identifikojë ndryshimet në gjenet e U. ribbi, të cilat përcaktojnë fermentimin e melibiozës dhe prodhimin e izocitratit liazës, të cilat qëndrojnë në themel të diferencimit të nënspecieve kryesore dhe të vogla të patogjenit të murtajës.
4. Përcaktoni nevojat ushqyese të shtameve U. rhenium të nënspecieve Kaukaziane dhe vendosni bazën gjenetike të auksotrofisë së tyre.
5. Vlerësoni perspektivat e përdorimit të rezultateve të marra për të krijuar një skemë gjenetike për klasifikimin intraspecifik të shtameve U. paratilis dhe përcaktoni drejtimet kryesore të evolucionit intraspecifik të këtij patogjeni.
Risi shkencore e veprës. Bazuar në të dhënat nga një analizë gjithëpërfshirëse mikrobiologjike, biokimike dhe gjenetike, u vërtetua se shtamet e patogjenit të murtajës që qarkullojnë në vatra natyrore të Federatës Ruse dhe vendeve fqinje i përkasin biovarëve antikë dhe mesjetarë.
Për herë të parë u tregua se arsyeja e mungesës së aktivitetit reduktues të nitratit në disa shtame të nëngrupeve kryesore që qarkullojnë në Federatën Ruse dhe vendet fqinje është prania e një zëvendësimi të vetëm nukleotid O me T në pozicionin 613 të periplazmës. gjen nitrat reduktazë – çifti A, i cili dëshmon se këto shtame i përkasin periudhës mesjetare. Mungesa e shprehjes së këtij tipari në shtamet e nëngrupeve Altai dhe Gissar shkaktohet nga futja e një nukleotidi timine (+T) në pozicionin 302 të një gjeni tjetër - një gjen që çon në një zhvendosje në kornizën e leximit dhe ndërprerje të struktura e proteinës së transportit të koduar -8 eA, e përfshirë gjithashtu në reduktimin e nitrateve.
Për herë të parë, u konstatua se mungesa e fermentimit të arabinozës në shtamet e U. resia të nëngrupeve Altai dhe Gissar shoqërohet me praninë e një mutacioni në gjenin rregullator, operon arabinoz - agaC, i cili përmban një futje të një nukleotid guanine (+b) në pozicionin 773 nga fillimi i gjenit, duke çuar në një zhvendosje në kornizën e leximit dhe prishje të strukturës së proteinës rregulluese AgaC, e cila është e nevojshme për fillimin e transkriptimit të gjeneve të arabinozës operon.
Për herë të parë është vendosur baza gjenetike e prodhimit të ndryshëm të izo-citrat liazës në shtamet e patogjenit të murtajës të nënspecieve kryesore dhe të vogla, e cila shoqërohet me praninë e një futjeje të dy nukleotideve (+CC) në gjen rregullator ShK. në pozicionin 269-270, e cila çon në inaktivizimin e proteinës acetate operon shtypëse IcIR të koduar prej saj dhe është shkaku i sintezës konstituive të enzimës izocitrat liazë në shtamet e nëngrupit kryesor. Llojet e nënspecieve të vogla përmbajnë një gjen iIII të paprekur dhe nuk janë të afta për sintezën konstituive të isocitralazës.
U tregua se mungesa e fermentimit të melibiozës në shtamet e rrëshirës 7. të nëngrupit kryesor është për shkak të futjes së sekuencës së futjes 18255 në gen1B, që kodon enzimën galaktoside permeazë. Në shtamet e nënspecieve të vogla, futja 1B255 në gjenin te1B mungon.
Për herë të parë është identifikuar baza gjenetike e auxotrofisë së shtameve të nënspecieve Kaukaziane, e cila shoqërohet me futjen e sekuencave të insertimit 1$>100 në gjenet a^A dhe agora, një futje 10 bp. në gjenin agoO, me futjen e një nukleotidi timine në gjenin d/Ru me fshirje të 13 bp. në gjenin gcJ.
Karakterizimi molekular që rezulton i shtameve U. paratilis të nënspecieve kryesore dhe të vogla sipas gjeneve që kodojnë karakteristikat biokimike që qëndrojnë në themel të ndarjes në nënspecie dhe biovarë krijon bazën për zhvillimin e një skeme gjenetike për klasifikimin intraspecifik të patogjenit të murtajës.
Bazuar në rezultatet e punës, u depozituan aplikime për shpikjen "Metodë për përcaktimin e përkatësisë së nënspecieve të shtameve patogjene të murtajës duke përdorur metodën e sekuencës" (Nr. 2009116913. Prioriteti i datës 14 maj 2009. U mor një vendim pozitiv për lëshimin e një patentë) dhe “Metodë për diferencimin e nënspecieve të shtameve Yersinia pestis me metodën e sekuencës multilocus - tipizimi (Nr. 2009146094. Prioriteti datë 11/12/2009).
Rëndësia praktike e punës. Bazuar në rezultatet e punës, u hartuan dhe miratuan rekomandimet metodologjike "Përcaktimi i nëngrupeve të shtameve të patogjenit të murtajës bazuar në sekuencën e gjeneve rhaS dhe agaC që kontrollojnë fermentimin e ramnozës dhe arabinozës" (miratuar nga drejtori i RosNIPCI “Protokolli nr. 6 i 16 qershorit 2009) dhe “Përcaktimi i llojeve Yersinia pestis duke përdorur tipizimin e sekuencës multilocus (miratuar nga drejtori i RosNIPCI “Microbe”. Protokolli nr. 1 i 23 shkurtit 2010).
Tre shtame janë depozituar në Koleksionin Shtetëror të Baktereve Patogjene: Y. pestis KM 910 i Altait, KM 596 i nëngrupit Gissar dhe KM 1861 i nëngrupit Ulegei si shtame referencë të këtyre nënspecieve.
Të dhënat mbi organizimin gjenetik të shtameve Y. pestis të marra gjatë studimit përdoren gjatë mbajtjes së leksioneve mbi temën " Gjenetika e patogjenit të murtajës"Në kurse specializimi për infeksione veçanërisht të rrezikshme në RosNIPCI "Microbe" dhe kurse trajnimi të avancuara për programin e trajnimit të avancuar për mjekët në specialitetin "bakteriologji" në RosNIPCHI "Microbe".
Dispozitat për mbrojtjen:
1. Shtamet e patogjenit të murtajës të nënspecieve kryesore që qarkullojnë në vatra natyrore të Federatës Ruse dhe vendeve fqinje i përkasin biovarëve antikë dhe mesjetarë, siç dëshmohet nga të dhënat nga një analizë gjithëpërfshirëse e vetive mikrobiologjike, biokimike dhe gjenetike të këtyre shtameve.
2. Baza për manifestimet e ndryshme dhe karakteristikat biokimike të përdorura kur ndahen shtamet e Y. pestis në nënspecie dhe biovarë janë lloje të ndryshme mutacionesh në gjenet që kodojnë këto karakteristika. Mungesa e aftësisë për të reduktuar nitratet në shtamet e nëngrupeve kryesore të biovarit mesjetar shoqërohet me praninë e një mutacioni të pakuptimtë (G T) në gjenin paraA të reduktazës periplazmike të nitratit, dhe në shtamet e nëngrupeve Altai dhe Gissar - me futja e një nukleotidi të vetëm në gjenin ssuA të proteinës transportuese periplazmike SsuA. Mungesa e fermentimit të arabinozës në shtamet e nënspecieve Altai dhe Gissar është për shkak të futjes së një nukleotidi guanine në sekuencën e gjenit agaC.
3. Aktiviteti i ndryshëm biokimik i shtameve të nënspecieve kryesore dhe të vogla të patogjenit të murtajës sipas një sërë karakteristikash diferenciale shkaktohet nga reduktimi i gjeneve që i kodifikojnë në nënspeciin kryesor dhe paprekshmëria e tyre në nënspeciin minor. Mungesa e fermentimit të melibiozës nga shtamet e nënspecieve kryesore është për shkak të futjes së IS2S5 në gjenin melB galaktoside permeazë, dhe sinteza përbërëse e liazës izocitrate në shtamet e këtij nëngrupi është për shkak të futjes së dy nukleotideve (CC) në sekuenca e gjenit rregullator iclR. Llojet e nëngrupeve të vogla përmbajnë gjene të paprekur melB dhe iclR.
4. Arsyeja e nevojave të shumta ushqyese të shtameve Y. pestis të nënspecieve kaukaziane është inaktivizimi i një numri gjenesh për biosintezën e aminoacideve dhe vitaminave. Varësia e shtameve të këtij nëngrupi për argininën shkaktohet nga futja 100 në gjenin argA, dhe për fenilalaninën - nga një futje prej 10 bp. në gjenin aroG, për tirozinë - duke futur IS100 në gjenin aroF, për tiaminë (B]) me fshirje të 13 bp. - në gjenin thiG dhe futja e një nukleotidi të vetëm në thiH. Bazuar në të gjithë kompleksin e mutacioneve të identifikuara për shtamet e nënspecieve kaukaziane dhe të tjera, si dhe biovarët e patogjenit të murtajës, u përcaktuan gjenotipe karakteristike që mund të përdoren për të krijuar një skemë gjenetike, klasifikim intraspecifik të Y. pestis.
Miratimi i punës. Materialet e disertacionit u prezantuan dhe u diskutuan në Konferencën IX Shkencore dhe Praktike Ndërshtetërore të Shteteve Anëtare të CIS "Teknologjitë moderne në zbatimin e strategjisë globale për luftimin e sëmundjeve infektive në territorin e shteteve anëtare të Komonuelthit të Shteteve të Pavarura", Volgograd , 2008; Konferenca e VI Ndërkombëtare” Diagnostifikimi molekular dhe biosiguria“, M., 2009; shkollë-konferencë shkencore dhe praktike e shkencëtarëve dhe specialistëve të rinj të Shërbimit Federal për Mbikëqyrjen e Mbrojtjes së të Drejtave të Konsumatorit dhe Mirëqenies së Njeriut " Teknologji moderne për sigurimin e sigurisë biologjike“, 25 - 27 maj 2010; në konferencat përfundimtare vjetore të RosNIPCI "Microbe", Saratov 2008 - 2010.
Publikimet. 7 punime të shtypura janë botuar në temën e disertacionit, 4 prej tyre në revista periodike nga "Lista e revistave shkencore kryesore të vlerësuara nga kolegët e rekomanduar nga Komisioni i Lartë i Vërtetimit të Ministrisë së Arsimit dhe Shkencës të Rusisë". Janë lëshuar dy patenta për shpikje " Metoda për diferencimin e nënspecieve të shtameve patogjene të murtajës duke përdorur metodën e sekuencës"(Nr. 2009116913. Prioriteti datë 14.05.2009. Është marrë vendim pozitiv për lëshimin e patentës) dhe "Metoda për diferencimin e nënspecieve të shtameve Yersinia pestis duke përdorur metodën e tipizimit të sekuencës multilocus" (Nr. 2004.1469. datë 12/11/2009).
Struktura dhe qëllimi i disertacionit. Disertacioni është paraqitur në 156 faqe tekst të shkruar me makinë, përbëhet nga një hyrje, një kapitull i rishikimit të literaturës, pesë kapituj të hulumtimit të vet, një përfundim dhe përfundime. Puna është ilustruar me 11 tabela dhe 34 vizatime. Indeksi bibliografik përmban 203 burime vendase dhe të huaja.
Përfundimi i disertacionit me temën "Mikrobiologjia", Odinokov, Georgy Nikolaevich
1. Bazuar në një analizë gjithëpërfshirëse të vetive biokimike dhe gjenetike të shtameve natyrore Y pestis nga vatra të ndryshme natyrore të murtajës, u vërtetua se shtamet e nëngrupeve kryesore që qarkullojnë në Federatën Ruse dhe vendet fqinje i përkasin biovarëve antikë dhe mesjetarë.
2. Arsyeja e mungesës së shprehjes së tiparit diferencial biokimik - reduktimi i nitrateve në shtamet Y. pestis të nënspecieve kryesore të izoluara në vatra natyrore të murtajës në Rusi dhe vendet fqinje, është prania e një mutacioni - zëvendësimi i një nukleotidi të vetëm. në gjenin paraA të nitrat reduktazës periplazmike, dhe në nënspeciet Altai dhe Gissar - futja e një nukleotidi të vetëm në gjenin ssuA të proteinës transportuese periplazmike.
3. Për herë të parë është vendosur baza gjenetike e shprehjes së ndryshme të tipareve të fermentimit të melibiozës dhe prodhimit të liazës izocitrate në shtamet e nënspecieve kryesore dhe të vogla të mikrobit të murtajës. U tregua se mungesa e aftësisë së shtameve të nëngrupit kryesor për të fermentuar disakaridin melibiozë është për shkak të futjes së IS2&5 në sekuencën e gjenit strukturor melB, që kodon galaktozid permeazën. Është vërtetuar se sinteza konstituive e liazës izocitrate, karakteristikë e nëngrupeve kryesore të mikrobit të murtajës, shkaktohet nga futja e dy nukleotideve (+CC) në pozicionet 269 - 270 të gjenit represor iclR.
4. Arsyeja e arabino-negativitetit të shtameve pestis të nëngrupeve Altai dhe Gissar është një mutacion në gjenin rregullator të operonit arabinoz - agaC, i cili shkaktohet nga futja e një nukleotidi të vetëm guanine në pozicionin 773 të këtij gjeni. .
5. Për herë të parë është përcaktuar baza gjenetike e auksotrofisë së shtameve Y. pestis të nënspecieve Kaukaziane. U vërtetua se auxotrofia për argininën është për shkak të futjes së IS 100 në gjenin argA, dhe për fenilalaninën - një futje prej 10 r.n. në aroG, për tirozinën - me futjen e IS 100 në aro F, për vitaminën Bi - me fshirjen e 13 bp në thiG dhe me futjen e timinës në thiH.
6. U përcaktuan gjenotipet karakteristike të nëngrupeve kryesore (të lashta, mesjetare, orientale) dhe të vogla të patogjenit të murtajës, përdorimi i të cilave lejon diferencimin intraspecifik të Y. pestis. Tregohen perspektivat për përdorimin e rezultateve të marra për të krijuar një skemë gjenetike për klasifikimin intraspecifik të shtameve Y. pestis.
PËRFUNDIM
Gjatë më shumë se një shekulli studimi të agjentit shkaktar të murtajës pas zbulimit të tij në 1894, A. Yersen dhe S. Kitazato propozuan në mënyrë të përsëritur skema të ndryshme klasifikimi për Y. pestis, të cilat bazoheshin në manifestime të ndryshme mikrobiologjike, biokimike dhe të tjera. vetitë fenotipike. Klasifikimet e propozuara sigurisht që korrespondonin me nivelin e njohurive dhe qasjet metodologjike që kishin studiuesit. Kështu në vitin 1928 A.A. Bezsonova, të gjitha shtamet e Y. pestis u ndanë në dy grupe sipas aftësisë së tyre për të fermentuar glicerinën: glicerinë-negative dhe glicerin-pozitive. Në vitin 1938 A.L. Berlin dhe A.K. Borzenkov ndau llojet e patogjenit të murtajës në raca oqeanike dhe kontinentale. R. Devignat në vitin 1951, bazuar në një sërë vetive biokimike (aftësi të ndryshme për denitrifikimin dhe fermentimin e glicerinës) dhe veçorive të origjinës peizazhore-gjeografike, propozoi ndarjen e shtameve Y. pestis në tre grupe, të cilat aktualisht janë përcaktuar si biovarë të Mikrobi i murtajës: antik, mesjetar dhe oriental. Në vitin 1985, në Mbledhjen Gjithë Bashkimi për Taksonominë e Mikrobit të Murtajës, u miratua një skemë sistematike e unifikuar e kategorive të nënspecieve për patogjenin e murtajës, bazuar në vetitë fenotipike, virulencën në lidhje me kafshët laboratorike dhe zonën e shpërndarjes. Llojet e mikrobit të murtajës që qarkullonin në vendet e CIS dhe Mongoli u ndanë në pesë nënspecie: kryesore, Kaukaziane, Altai, Gissar, Ulegey (Timofeeva 1972; Kutyrev, Protsenko, 1985).
Të gjitha skemat e propozuara ishin, natyrisht, të dobishme për studiuesit dhe kontribuan në sistemimin e Y. pestis, dhe shumë prej tyre (ndarja në nënspecie dhe biovarë) përdoren gjerësisht sot. Sidoqoftë, zhvillimi i shpejtë i teknologjive moderne të biologjisë molekulare, renditja e gjenomave të plota të Yersinia patogjene bën të mundur zgjidhjen e problemit të përmirësimit të klasifikimit intraspecifik të patogjenit të murtajës në nivelin gjenetik molekular modern, bazuar në gjenomikën krahasuese të patogjenit të murtajës. sforcimet. Përkthimi i skemave ekzistuese të klasifikimit diferencial për këtë patogjen në nivelin gjenetik do të rrisë rezolucionin, efikasitetin dhe besueshmërinë e tyre, si dhe do të përmirësojë cilësinë e sistematizimit të specieve Y. pestis.
Baza gjenetike e aktiviteteve të ndryshme biokimike të shtameve patogjene të murtajës të nënspecieve të ndryshme mbetet praktikisht e paeksploruar. Vetëm defekte gjenetike individuale janë identifikuar në gjenet e përdorura për ndarjen intraspecifike të Y. pestis. Kështu, është treguar se në shtamet e nënspecieve kryesore të biovarit mesjetar, mungesa e aftësisë për të reduktuar nitratet shoqërohet me praninë e një mutacioni në gjenin strukturor të çifteve L të nitrat reduktazës periplazmike, të nevojshme për manifestimi i kësaj vetie dhe paaftësia e shtameve të biovarit lindor (shtamet glicerol-negative ose raca oqeanike) për të fermentuar glicerinën e shkaktuar nga një fshirje në gjenin e glicerol-3-fosfat dehidrogjenazës glpD. Janë marrë dëshmi se arsyeja për negativitetin e ramnozës së të gjitha shtameve të studiuara të nënspecieve kryesore është prania e një zëvendësimi josinonim të një nukleotidi të vetëm në gjenin rregullator rhaS të operonit të ramnozës [Kukleva et al., 2008; 2009]. Për sa i përket gjeneve të tjera që përcaktojnë tipare të rëndësishme biokimike, ose ka informacione mjaft kontradiktore ose thjesht mungojnë të dhënat. Llojet e Y. pestis të nënspecieve kryesore dhe të vogla që vazhdojnë në vatra natyrore të Federatës Ruse dhe vendeve fqinje praktikisht nuk janë studiuar për gjenet me karakteristika biokimike diferenciale të rëndësishme. Studimi i organizimit gjenetik të shtameve të nënspecieve të ndryshme që janë në faza të ndryshme të evolucionit të Y. pestis është një detyrë e rëndësishme, pasi do të bëjë të mundur përcaktimin e atyre transformimeve evolucionare të gjenomit patogjen që çuan në formimin e një virusi shumë virulent. bakteri Y. pestis.
Për të vendosur bazën gjenetike për shprehjen e ndryshme të karakteristikave biokimike të përdorura në ndarjen e shtameve të patogjenit të murtajës në nënspecie dhe biovarë, ne përdorëm metodat tradicionale mikrobiologjike dhe biokimike dhe metodat moderne të biologjisë molekulare - reaksioni zinxhir polimerazë, sekuenca, si dhe metodat bioinformatike. . Janë përdorur burimet e internetit - NGBI GenBank, KEGG Metabolic Pathways, PF AM, Modeller bazat e të dhënave dhe programet kompjuterike: Mega 4.0 dhe PHYLIP me metodat e matricës së distancës.
Për të vendosur bazën gjenetike për shprehjen e ndryshme të karakteristikave biokimike të përdorura për të ndarë shtamet e patogjenit të murtajës në nënspecie dhe biovarë, u përdor një algoritëm i përgjithshëm i analizës. Në fazën e parë u studiua shprehja e tiparit mikrobiologjik ose biokimik në studim në shtamet natyrale të Y. pestis. Shprehja e tipareve të rëndësishme diferenciale (reduktimi i nitrateve, fermentimi i arabinozës, melibioza, prodhimi i isocitratit liazës) u studiua në një numër të madh (rreth njëqind) shtame Y. pestis nga vatra të ndryshme natyrore të murtajës.
Njëkohësisht, duke përdorur analizën kompjuterike të shtameve Y. pestis KIM (biovar mesjetar), C092 (biovar lindor), Antiqua, Angola, Ne-pa1516 (biovar antik), 91001 (microtus biovar), Pestoides F (nënspecie kaukaziane) dhe Y.berberculosis pseudotu. PB1 /+, IP32953, IP31758, YPIII, nukleotidet e plota të gjenomave të të cilave janë paraqitur në bazën e të dhënave NCBI GenBank, ne identifikuam rajone të ndryshueshme të gjeneve, produktet e të cilave, në përputhje me Rrugët Metabolike KEGG dhe bazat e të dhënave PF AM, përfshihen në shprehje të këtij tipari. Primerët u krijuan për rajone të ndryshueshme të gjeneve që me sa duket ishin arsyeja e mungesës së manifestimit fenotipik të tiparit, me ndihmën e të cilave fragmentet e gjeneve të ndryshueshme u përforcuan në PCR në shtame të ndryshme natyrore të agjentit shkaktar të murtajës. Bazuar në një krahasim të sekuencave nukleotide të gjeneve në shtame që ndryshojnë në shprehjen e tiparit të studiuar, u identifikuan mutacione që shkaktuan mungesën e këtij tipari.
Duke përdorur këtë algoritëm, ne studiuam organizimin strukturor dhe funksional të gjeneve, produktet e të cilave përfshihen në manifestimin e karakteristikave diferenciale që qëndrojnë në themel të ndarjes së shtameve Y. pestis në biovarë - reduktimi i nitrateve dhe fermentimi i arabinozës në çifte u krye operoni, si dhe gjenet pagP dhe ssuA - proteinat rregullatore (NarP) dhe transportuese (SsuA) të përfshira në reduktimin e nitrateve, në shtamet e paraqitura në bazën e të dhënave të NCBI GenBank, si dhe në një numër të madh (rreth një njëqind) shtame natyrore të Y. pestis dhe nëngrupe të vogla të izoluara në vatra të ndryshme natyrore të murtajës në Federatën Ruse, afër dhe larg jashtë vendit.
Është vërtetuar se arsyeja e mungesës së aftësisë denitrifikuese në disa shtame të nënspecieve kryesore është prania e një zëvendësimi të vetëm nukleotid G në T në pozicionin 613 të çiftit të gjenit A, që kodon proteinën - nitrat reduktazën periplazmike. Arsyeja e pamundësisë për të reduktuar nitratet nga shtamet e nëngrupeve Altai dhe Gissar është e ndryshme dhe shoqërohet me praninë e një mutacioni në gjenin e proteinës transportuese - ssuA, e cila në këto shtame në pozicionin 302 përmban një futje të vetme nukleotide (+T ). Të dhënat e marra, së bashku me karakteristikat biokimike të shtameve (aftësia për të reduktuar nitratet, fermentimi i arabinozës dhe glicerinës), na lejuan të konkludojmë se shtamet e biovarëve antikë dhe mesjetarë qarkullojnë në Federatën Ruse dhe vendet fqinje, ndërsa shtamet e lindore biovarët zbulohen vetëm midis shtameve nga vendet e huaja.
Me sa duket, arsyeja e mungesës së aktivitetit reduktues të nitratit në shtamet biovare të mikrotusit është i njëjti mutacion si në shtamet e nëngrupeve Altai dhe Gissar - futja e një nukleotidi të vetëm në gjenin ssu. Ne kemi vërtetuar se një mutacion në gjenin pairA - futja e një gjeni të vetëm çift A në pozicionin 1021 nuk mund të jetë arsyeja për mungesën e shprehjes së tiparit në shtamet e mikrotusit [siç sugjerohet nga D. Zhou et al., 2004] , meqenëse e kemi identifikuar edhe në shtamet e nënspecieve Kaukaziane, si dhe në shtamet e pseudotuberkulozit 7, të cilët reduktojnë nitratet. "
Për herë të parë, një analizë strukturore dhe funksionale e gjeneve të operonit arabinoz u krye në një numër të madh të shtameve natyrore të agjentit shkaktar të murtajës dhe sekuencës së plotë nukleotide të gjenit rregullator agaC, i përfshirë në rregullimin e u përcaktua shprehja e fermentimit të arabinozës. Është vërtetuar se arsyeja e mungesës së këtij tipari në nëngrupet Altai dhe Gissar është prania e një futjeje të vetme nukleotide në gjenin agaC në pozicionin 773 që nga fillimi i gjenit. Llojet e nëngrupeve kryesore, Kaukaziane dhe Ulegay nuk përmbajnë një mutacion të tillë, i cili lidhet me aftësinë e tyre për të fermentuar arabinozën.
U krye një studim mbi strukturën e gjeneve që kodojnë fermentimin e melibiozës dhe prodhimin e liazës izocitrate, të cilat përdoren në ndarjen e shtameve Y. pestis në nënspeciet kryesore dhe të vogla. Më parë, përcaktimi gjenetik i manifestimeve të ndryshme të këtyre vetive në shtamet e nënspecieve kryesore dhe jo kryesore nuk është studiuar. Nuk ka të dhëna për këtë çështje në literaturë.
Një analizë kompjuterike krahasuese e sekuencës nukleotide të gjeneve të fermentimit të melibiozës (melA, melB dhe melR) në shtamet Y. pestis dhe 7. pseudotuberculosis të paraqitura në bazën e të dhënave NCBI GenBank tregoi praninë në gjenin melB (1232 bp), i cili përcakton sintezën e permeazës galaktozide, futja e sekuencës së futjes IS2&5 (1322 bp) pas 73 bp. në shtamet patogjen4 të murtajës C092, KIM, Antiqua, Nepal516. Në shtamet e tjera të 7 pestis Angola, 91001, Pestoides F dhe në të gjitha shtamet e 7 pseudotuberkulozit, u gjet një strukturë e paprekur e gjenit melB. Në analizën PCR duke përdorur primerët e llogaritur në krahun e rajonit të futjes IS2SJ, fragmente specifike të gjenit melB u morën nga një numër i madh shtamesh natyrale të patogjenit të murtajës. Në studimin e 7 shtame pestis të nëngrupeve jo-kryesore - Kaukazian, Altai, Gissar dhe Ulegei - PCR prodhoi përforcime prej 325 bp në madhësi, të cilat korrespondonin me strukturën e paprekur të gjenit melB. Në të kundërt, në shtamet e nënspecieve kryesore fragmentet kishin një madhësi më të madhe prej 1648 bp, gjë që tregonte futjen e një sekuence futjeje në këtë gjen dhe lidhej me mungesën e aktivitetit enzimatik të tyre kundër melibiozës. Kështu, për herë të parë kemi krijuar një shkak gjenetik; shprehje e ndryshme e një veçorie diferenciale - fermentimi i melibiozës në shtamet e patogjenit të murtajës të nëngrupit kryesor dhe të vogël, i cili shoqërohet me një shkelje të strukturës së gjenit melB në shtamet e nëngrupeve kryesore për shkak të futjes së sekuencës së futjes. IS2&5.
Për të diferencuar shtamet Y. pestis të nëngrupeve kryesore nga ato jo kryesore dhe shkaktarin e pseudotuberkulozit, përdoret aftësia e tyre për të sintetizuar në mënyrë konstituive enzimën isocitrate liazë. Analiza krahasuese kompjuterike e sekuencave nukleotide të gjeneve të operonit acetat (aceA, aceB, aceK, iclR) në shtamet G. pestis dhe Y. pseudotuberculosis të paraqitura në bazën e të dhënave NCBI GenBank tregoi praninë e një futjeje të dy nukleotideve në iclR ( madhësia e gjenit 843 bp) (+CC) në pozicionin 269-270 nga fillimi i gjenit në shtamet e Y. pestis C092, KIM, Antiqua, Nepal516. Në të kundërt, shtamet e tjera të mikrobit të murtajës Angola, 91001, Pestoides F dhe të gjitha shtamet e pseudotuberkulozit kanë një strukturë të paprekur të gjenit iclR. Sekuenca e rajonit të ndryshueshëm të gjenit iclR, i kryer nga ne në shtamet natyrale të Y. pestis, zbuloi praninë e të njëjtit mutacion në shtamet e nënspecieve kryesore të Y. pestis - futja e dy nukleotideve (+CC) në pozicionet 269 - 270, në kontrast me nënspeciet e vogla në të cilat struktura e këtij gjeni është e paprekur. Mutacioni i identifikuar çon në inaktivizimin e gjenit dhe prishjen e strukturës (dhe funksionit) të proteinës represore të operonit acetat IclR, i shoqëruar me humbjen e skajit C-terminal të domenit (148 - 271 aa) që lidh molekulën induktuese. . Kjo çon në shprehjen konstituive të gjeneve të operonit acetat dhe lidhet me aktivitetin e lartë të enzimës izocitrate liazë në shtamet e nëngrupeve kryesore të Y. pestis.
Më parë, u sugjerua se shtamet më të lashta të mikrobit të murtajës janë shtame të nënspecieve Kaukaziane [Bobrov, Fillipov, 1997; Kukleva etj., 2002]. Studimi i tyre është me interes të konsiderueshëm, pasi na lejon të përcaktojmë ato faza të ndryshimeve evolucionare në gjenom që çuan në shndërrimin e një bakteri enteropatogjen saprofitik - një mikrob pseudotuberkulozi - në një patogjen sistemik shumë virulent me një mekanizëm thelbësisht të ndryshëm të transmetimit të patogjenit. . Rezultatet tona tregojnë se nëngrupi Kaukazian është më aktivi për sa i përket karakteristikave diferenciale biokimike dhe përmban gjene të paprekura (paraA, ssuA, glpD, araC, melB, iclR), si agjenti shkaktar i pseudotuberkulozit. Kjo konfirmon afërsinë më të madhe të nëngrupit kaukazian me paraardhësin e tij, Y. pseudotuberculosis, krahasuar me nënspeciet e tjera të Y. pestis.
Ne kryem gjithashtu studime mikrobiologjike për të studiuar nevojat ushqyese të shtameve Y. pestis të nënspecieve kaukaziane, pasi kishte informacione kontradiktore për këtë çështje në literaturë. U vërtetua se të gjitha shtamet e studiuara të nëngrupeve Kaukaziane silleshin në mënyrë uniforme. Ata kanë identifikuar nevojën për dy aminoacide aromatike - fenilalaninë dhe tirozinë, si dhe aminoacidin argininë dhe vitaminë Bi (tiaminë). Përveç kërkesave për argininë, fenilalaninë, tirozinë dhe vitaminë B1, shtamet nga fokusi i murtajës në malet e larta të Kaukazit Lindor treguan gjithashtu një varësi nga leucina, ndërsa shtamet e nënspecieve Kaukaziane nga Leninakan, Prisevan, Zangezur-Karabakh dhe Vatra natyrore Araksin e një varësie të tillë nuk kishte.
Për të vendosur bazën gjenetike të auxotrofisë së shtameve të nënspecieve kaukaziane, duke përdorur bazat e të dhënave KEGG dhe PFAM, një analizë e rrugëve metabolike dhe identifikimin e sistemeve enzimatike të përfshira në biosintezën e aminoacideve aromatike - fenilalaninës, tirozinës, aminoacidit arginine dhe vitamina Bt (tiaminë) janë kryer. Mutacione të rëndësishme u gjetën në gjenet e biosintezës së argininës (argA), fenilalaninës (aroG), tirozinës (aroF) dhe vitaminës Bl (thiH, thiG) në shtamet e nënspecieve Kaukaziane. Në gjenin strukturor a^A, u zbulua një futje e sekuencës së futjes \S100 prej mezi 196 bp, që është arsyeja e auksotrofisë së nëngrupit Kaukazian për argininën. Në gjenin më parë
Kështu, ne kemi vendosur për herë të parë bazën gjenetike të auksotrofisë së shtameve të nënspecieve Kaukaziane. Karakteristikat gjenetike të marra të shtameve të nënspecieve kaukaziane për gjenet e karakteristikave biokimike diferenciale ((ggarA, vvi, glpD, agaC, me1B, yuSh) dhe për gjenet e biosintezës së faktorëve të rritjes (agA, agoC, agor, ¿/g /C dhe ShN) tregojnë lashtësinë më të madhe të këtij nëngrupi, si dhe periudhën e gjatë të evolucionit të tij, pavarësisht nga nënllojet e tjera të U. re, M"ya.
Bazuar në një analizë të detajuar gjenetike molekulare të shtameve natyrore të U. resib nga vatra të ndryshme të murtajës, u përcaktuan gjithashtu karakteristikat gjenetike të shtameve të nënspecieve të tjera që qarkullojnë në Rusi, afër dhe larg jashtë vendit. Përdorimi i mutacioneve gjenetike të identifikuara në gjenet paraA, agaC, glpD, mA dhe SHR bën të mundur me efikasitet dhe besueshmëri të lartë përcaktimin e përkatësisë së shtameve të U. pebis në nënspeciet kryesore ose të vogla, dhe shtamet e kryesore. nënspecie në një nga tre biovarët - të lashtë, mesjetar ose oriental. U identifikuan gjenotipet karakteristike të secilës prej këtyre njësive taksonomike - specia Y. pestis.
Ndryshueshmëria e gjeneve të çifteve A, ssu, araC, melB, iclR, argA, aroH, aog F, thiH dhe thiG, e vendosur gjatë kësaj pune, së bashku me ndryshueshmërinë e identifikuar më parë të gjenit glpD, u përdor për të rindërtuar Skema filogjenetike e evolucionit të nënspecieve kryesore dhe të vogla të patogjenit të murtajës, e cila konfirmoi lashtësinë e shtameve kaukaziane, si dhe nënspeciet e tjera të vogla të Y. pestis (Figura 34).
Siç vijon nga ky diagram, agjenti shkaktar i murtajës e ka origjinën nga mikrobi pseudotuberkuloz dhe është një degë e evolucionit të kësaj Yersinia enteropatogjene. Nënlloji më i lashtë i Y. pestis është filogjenetikisht më afër Y. pseudotuberculosis në krahasim me nënllojet e tjera të mikrobit të murtajës. Një tjetër degë e lashtë e evolucionit të Y pestis përfaqësohet nga nëngrupet Ulega, Altai dhe Gissar, të cilat janë gjenetikisht afër njëra-tjetrës dhe, me sa duket, të ndara nga trungu i përgjithshëm i evolucionit në një grup të vetëm, i cili më vonë u nda në nënspecie të veçanta. Me sa duket, më e vjetra prej tyre është nëngrupi Ulega, i cili përmban një numër më të vogël mutacionesh në gjenet mbështetëse të jetës (në veçanti, i mungon një mutacion në gjenin agaC) në krahasim me shtamet e nëngrupeve Altai dhe Gissar. Këto të fundit janë filogjenetikisht të afërta me njëra-tjetrën, si dhe me shtame të grupit microtus, të cilat përmbajnë të njëjtat mutacione në gjenet e karakteristikave biokimike diferenciale si shtamet e nënspecieve Altai dhe Gissar. Ne ishim të parët që sugjeruam se shtamet e mikrotusit i përkasin grupit të nëngrupeve Altai-Gissar.
C092 (orientalis)
KIM 776 (meclievalis) (meclievalis)
NepalSlö (antiqua) subsp. ulegeica subsp. hismrica
91001 (microtus) subsp. altaika.
231, 680 subsp. kaukazika
Y. pseu dotu bereu losis
Figura 34. Skema e evolucionit intraspecifik të U. rheaT^ya
Studimet e kryera në këtë punë formojnë bazën për zhvillimin e një taksonomie molekulare të patogjenit të murtajës, qëllimi i së cilës është të krijojë një taksonomi të plotë intraspecifike të Y. pestis bazuar në ndryshueshmërinë e gjeneve për karakteristika të rëndësishme mikrobiologjike dhe biokimike. të mikrobit të murtajës.
Lista e referencave për kërkimin e disertacionit Kandidati i Shkencave Biologjike Odinokov, Georgy Nikolaevich, 2010
1. Akiev A.K. Mbi ndryshueshmërinë fiziologjike të mikrobit të murtajës // Problemet e infeksioneve veçanërisht të rrezikshme. - 1969. Çështje. 6 (10). - F. 22 - 25.
2. Anisimov A.P. Faktorët e Yersinia pestis që sigurojnë qarkullimin dhe ruajtjen e patogjenit të murtajës në ekosistemet e vatrave natyrore. Mesazhi 1 // Molekulat, gjenetika. 2002. - Nr. 3. - F. 3 - 23.
3. Anisimov A.P. Faktorët e Yersinia pestis që sigurojnë qarkullimin dhe ruajtjen e patogjenit të murtajës në ekosistemet e vatrave natyrore. Mesazhi 2 // Molekulat, gjenetika. 2002. - Nr. 4. - F. 3 - 11.
4. Aparin T.P., Golubinsky E.P. Mikrobiologjia e murtajës: Një manual. - Irkutsk / Shtëpia Botuese Irkutsk. Univ., 1989. - 90 f.
5. Bazanova L.P., Innokentyeva T.I. Mbi rolin e pleshtave - bartësit kryesorë dhe dytësorë të murtajës - në qarkullimin e patogjenit në vatrat natyrore të Siberisë // Med. para. dhe paraliza sëmundjet. 2008. - Nr. 3. - F. 54 - 60.
6. Balakhonov S.B., Tsenjaev S.N., Erdemabat A.B. Plazmidovarët e rinj të shtameve patogjene të murtajës të izoluar në Mongoli // Molekulat, gjenetika, mikrobiol. dhe virusol. - 1991. - Nr. 11. 27 - 29.
9. Bibikova V.A., Klassovsky V.N., Transmetimi i murtajës nga pleshtat. - M.: - Mjekësi, 1974. 188 f.
10. Bobrov A.G., Fillipov A.A. Prevalenca e IS285 dhe IS 100 në gjenomet e Yersinia pestis dhe Yersinia pseudotuberculosis II Mol. gjenetikë, mikrobiol. dhe virusol. 1997. - Nr 2. - F. 36 - 40.f
11. Vashchenok B.C. Pleshtat transmetojnë patogjenë të sëmundjeve të njerëzve dhe kafshëve. - L.: Nauka, 1988. - 160 f.
12. Velichko L.N., Kondrashkina K.I., Ermilov A.P. dhe të tjera jashtëqitjet e pleshtave janë një mjedis natyror për ruajtjen afatgjatë të mikrobit të murtajës // Problemet e infeksioneve veçanërisht të rrezikshme. - 1978. - Numri. (64). - F. 51 - 53.
13. Volkov Yu.P., Eroshenko G.A. Analiza e efektivitetit të disa metodave për ndërtimin e pemëve filogjenetike të përdorura në vlerësimin e marrëdhënieve evolucionare të mikroorganizmave // Problemet e infeksioneve veçanërisht të rrezikshme. 2009. - Numri. 1 (99). - F. 35 - 41.
14. Gusfield J. Vargjet, pemët dhe sekuencat në algoritme: Shkenca kompjuterike dhe biologjia kompjuterike. - Shën Petersburg: Dialekti Nevski, BHV-Petersburg, 2003. 654 f.
15. Goldfarb L.M., Domaradskaya T.I., Japaridze M.N. Drejt vlerësimit të testit izocitat-miu-liazë për diferencimin e patogjenëve të murtajës dhe pseudotuberkulozit // Çështjet aktuale në diagnostikimin laboratorik dhe biokiminë e patogjenëve të murtajës dhe kolerës. - 1984. S. 23 - 27.
16. Goldfarb L.M., Domaradskaya T.I., Japaridze M.N. Testi i aktivitetit izocitrate-liazë për diferencimin intraspecifik të murtajës Yersinia // Aspekte moderne të parandalimit të infeksioneve zoonotike. - 1984. - pjesa 2.-S. 21 -22.
17. Domaradsky I.V. Murtaja. M.: Mjekësi, 1998. - 173 f.
18. Ilyina T.S., Romanova Yu.M., Ginzburg A.JI. Biofilmi si një mënyrë e ekzistencës së baktereve në mjedis dhe organizmin pritës: fenomeni, kontrolli gjenetik dhe sistemet për rregullimin e zhvillimit të tyre // Gjenetika. - 2004. -T. 40, nr. 11. - F. 1 12.
19. Klassovsky L.N., Martinevsky I.L., Stepanov V.M. Mbi faktorët e rritjes së shtameve të baktereve të murtajës të izoluara në malësitë Transkaukaziane nga volet dhe pleshtat e tyre // Problemet e infeksioneve veçanërisht të rrezikshme. 1972. - Çështje. 1. - fq 186 - 188.
20. Kozlov M.P. Murtaja. M.: Mjekësi, 1979. - 192 f.
21. Kokushkin A.M. Disa tipare të infeksionit ushqyes dhe manifestimet e murtajës në brejtësit e egër // Probl. veçanërisht infeksionet e rrezikshme. - 1994.-№5.-S. 23-31.
22. Kokushkin A.M. Aspektet sociale dhe biologjike të epidemiologjisë së murtajës: Abstrakt i autorit. dis. dok. mjaltë. Shkencë. 1995. - 46 f.
23. Kukleva L.M. Eroshenko G.A. Shavina N.Yu. et al. Analiza krahasuese e shpërndarjes së pseudogjeneve. gjenomi i shtameve të nëngrupeve kryesore dhe të vogla të patogjenit të murtajës // Molecular Genet., Microbiol. dhe virusol. 2009. - Nr. 2. - F. 32-36.
24. Kukleva L.M., Eroshenko-G.A., Pavlova A.I. dhe të tjera Karakteristikat e shtameve patogjene të murtajës të nëngrupeve të ndryshme bazuar në reduktimin e nitrateve, glicerinës dhe fermentimit të arabinozës // Problemet e infeksioneve veçanërisht të rrezikshme. - 2007.-Nr 94.-P. 50-53.
25. Kukleva L.M., Eroshenko G.A., Shavina N.Yu. dhe të tjerët Analizë krahasuese e shpërndarjes së pseudogjeneve në gjenomin e shtameve të nëngrupeve kryesore dhe të vogla të patogjenit të murtajës // Molekul, gjenetikë, mikrobiol. dhe virusol. - 2008. -Nr 2.-S. 32-36.
26. Kukleva J.M., Kuzmichenko I.A., Protsenko O.A. Karakteristikat krahasuese të vetive biokimike të shtameve të nëngrupeve të ndryshme të Yersinia pestis dhe shtameve të Yersinia pseudotuberculosis II Problemet e infeksioneve veçanërisht të rrezikshme. - 2001.-Çështje. 1.-S. 105-110.
27. Kukleva J.M., Protsenko O.A., Kutyrev V.V. Idetë moderne në lidhje me marrëdhëniet midis patogjenëve të murtajës dhe pseudotuberkulozit / Molekulat, gjenetika, mikrobioli. dhe virusol // 2002. Nr. 1 - f. 3 - 7.
28. Kutyrev V.V., Eroshenko G.A., Popov N.V. dhe të tjerë mekanizmat molekularë të ndërveprimit të patogjenit të murtajës me kafshët jovertebrore // Molekul, gjenetik, mikrobiol. dhe virusol. 2009. Nr. 4. - F. 7 - 12.
29. Kutyrev V.V., Konnov N.P., Volkov Yu.P. Ultrastruktura e agjentit shkaktar të murtajës dhe lokalizimi në vektor / Ed. V.V. Kutyreva. - M.: Mjekësi. 2007. 224 fq.
30. Kutyrev V.V., Popov Yu.A., Protsenko O.A. Plazmidet e patogjenitetit të mikrobit të murtajës // Mol. gjenetike., mikrobiol., virusol. 1986. - Nr 6. - S.Z -11.
31. Kutyrev V.V., Protsenko O.A. Klasifikimi dhe studimet gjenetike molekulare të Yersinia pestis II Problemet e infeksioneve veçanërisht të rrezikshme. 1998. - Nr. 78. - F. 11 - 12.
32. Kutyrev V.V., Smirnova N.I., Diagnostifikimi i gjeneve dhe tipizimi molekular i patogjenëve të murtajës, kolerës dhe antraksit // Molekul, gjenetik., mikrobiol. dhe virusol. - 2003 - Nr. 1. - F. 6 14.
33. Kutyrev V.V., Smirnova N.I. Diversiteti gjenetik dhe evolucioni i gjenomave të patogjenëve të infeksioneve veçanërisht të rrezikshme të murtajës, kolerës dhe antraksit: e tashmja dhe e ardhmja // Bioteknologjia: gjendja dhe perspektivat e zhvillimit.-M., 2005.-Ch. 1.-S. 17.
34. Diagnostifikimi laboratorik i sëmundjeve infektive veçanërisht të rrezikshme. Udhëzues praktik / Redaktuar nga G.G Onishchenko, V.V. Kutyrev.-M.: Mjekësi, Shiko, 2009. 472 f.
35. Maniatis T., Fritsch E., Sambrook J. Klonimi molekular. M.: Mir, 1984.-480 f.
36. Martinevsky I.L. Taksonomia e gjinisë Yersinia II Mat. 4 shkencore konf. sipas natyrës vatra, dhe prof. murtaja - Alma-Ata, 1965. F. 142 - 148.
37. Martinevsky I.L. Biologjia dhe karakteristikat gjenetike të murtajës dhe mikrobeve të lidhura ngushtë. M.: Mjekësi, 1969. - 295 f.
38. Martinevsky I.L., Stepanov V.M., Kenzhebaev A.Ya. Taksonomia, mutacioni dhe gjenetika e patogjenitetit të murtajës dhe mikrobeve të lidhura me to. Nukus. Nga “Karakalpakstan”, 1990. - 151 f.
39. Metodat e bakteriologjisë së përgjithshme, bot. F. Gerhardt et al.: Mir, 1984. -264 f.
40. Mikhailova P.S. Taksonomia e mikrobit të murtajës që qarkullon midis voles në Malësitë Transkaukaziane // Materiale për konferencën, kushtuar. 50 vjetori i Institutit të Mikrobeve. Saratov, 1968. - F. 67 - 68.
41. Key to Bacteria Bergey, ed. J. Hoult. N. Krieg, P. Sneath, J. Staley dhe Williams. - M.: Mir, 1997. Botimi i 9-të. (në 2 vëllime). - 799 f.
42. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., Popov N.V. dhe të tjera vatra natyrore të murtajës në Kaukaz, rajonin e Kaspikut, Azinë Qendrore dhe Siberi / Ed. G.G Onishchenko, V.V. Kutyreva. -M.: Mjekësi, 2004. 192 f.
43. Peisakhis L.A., Stepenov V.M. Klasifikimi intraspecifik i agjentit shkaktar të murtajës sipas parimit të zonimit gjeografik // Problemet e infeksioneve veçanërisht të rrezikshme. 1975. - Çështje. 2. - f. 5 - 9.
44. Popov Yu.A. Projektimi dhe përdorimi i sondave të ADN-së për përfaqësuesit e gjinisë Yersinia // Gjenetikë, mikrobiol. dhe përmirësimin e metodave laboratorike. Diagnoza është veçanërisht e rrezikshme. inf. Saratov, 1991. - F. 3-13.
45. Popov Yu.A. Organizimi strukturor dhe funksional i plazmideve dhe zhvillimet e inxhinierisë gjenetike mbi këtë model: Dis.Dr. biol. Shkencë. Saratov, 1991. - 248 f.
46. Popov Yu.A., Gorshkov O.V., Savostina E.P. et al., Genotipizimi i shtameve Yersinia pestis nga vatra të ndryshme natyrore të murtajës // Molekul, gjenetika, mikrobiologjia dhe virologjia 2000. - Nr. 3. - F. 12-17.
47. Popov Yu.A., Protsenko O.A., Anisimov P.I., Kokushkin A.M., Mozharov
48. T. Zbulimi i plazmideve të pesticinogjenitetit të mikrobit të murtajës me elektroferezë në xhel agarozë // Parandalimi i veçanërisht i rrezikshëm. inf.- Saratov, 1980.-P. 20-25.
49. Popov N.V., Sludsky A.A. Udovikov A.I. dhe të tjerët Roli i biofilmave Yersinia pestis në mekanizmin e enzootikëve të murtajës // Zhurn. mikrobiol., epidemiol. imunol. 2008. - Nr. 4. - F. 118 - 120.
50. Popov Yu.A., Fursov V.V., Organizimi strukturor i derivateve plazmidike të pesticinogjenitetit të etiketuar me transpozon Tn1 dhe Tn9 // Mol. biol., gjenetike. dhe imunol. murtaja dhe kolera Saratov, 1983. - fq. 34 - 39.
51. Popov Yu.A., Yashechkin Yu.I., Drozdov I.G. Analiza gjenetike molekulare e strukturës së ADN-së të plazmideve pFra të shtameve patogjene të murtajës të biovarëve të ndryshëm // Gjenetikë. 1998. - T. 34. - F. 198 - 205.
52. Protsenko O.A., Anisimov P.I., Mozharov O.T. dhe të tjerët Identifikimi dhe karakterizimi i plazmideve të mikrobit të murtajës që përcaktojnë sintezën e pesticinës1, fraksionit të antigjenit I dhe toksinës së "miut" ekzotoksina // Gjenetika. 1983. -T. 19, nr 7.-S. 1081-1090.
53. Ratner V.A. Gjenetika molekulare: parimet dhe mekanizmat. Novosibirsk: Nauka, 1983. - 256 f.
54. Rozanova G.N., Serdyukova T.V., Shekhikyan M.T. et al. Agjenti shkaktar i murtajës nga vatra të llojit fushor në kërkimin shkencor të Kaukazit. Instituti Antiplague i Kaukazit dhe Transkaukazisë. Stavropol, 1987. 17 f.
55. Savostina E.P., Popov Yu.A., Polimorfizmi gjenomik i shtameve të nëngrupeve kryesore të patogjenit të murtajës // Molekul, gjenetikë, mikrobiologji dhe virologji 2009. - Nr. 4. - F. 23 - 26.
56. Smirnov G.B. Mekanizmat e përvetësimit dhe humbjes së informacionit gjenetik nga gjenomet bakteriale // Përparimet në biologjinë moderne. 2008. - T. 128. - Nr. 1.-S. 52-76.
57. Smirnov I.V. Agjenti shkaktar i yersiniozës dhe mikroorganizmave të lidhur // Klin, mikrobiol. antimikrobik, kimioter. - 2004. - T. 6, Nr. 1. - F. 10 -21.
58. Smirnova N.I., Kutyrev V.V., Analizë krahasuese e veçorive gjenetike molekulare të gjenomave dhe transformimeve të tyre evolucionare në agjentët shkaktarë të kolerës, murtajës dhe antraksit // Molekul, gjenetik., mikrobiol. dhe virusol. 2006. - Nr. 2. - F. 9 - 19.
59. Stybaeva G.S., Atshabar B.B. Karakteristikat gjenetike molekulare të agjentit shkaktar të murtajës (rishikim i literaturës) // Infeksionet karantine dhe zoonotike në Kazakistan. 2003. - Nr. 1 (7). - F. 52 - 67.
60. Suleimenov B.M. Mekanizmi i murtajës enzootike. Almaty, 2004. - 236 f.
61. Sultanov G.V., Kozlov M.P. Murtaja. Mikrobiologjia, patogjeneza, diagnostifikimi. Vëllimi 1. Makhachkala: Nga Akad. rurale Shkenca, 1995. 223 f.
62. Timofeeva L.A. Mbi taksonominë e mikrobit të murtajës // Problemet e infeksioneve veçanërisht të rrezikshme. 1972. - Çështje. 1 (23).- F. 15 - 22.
63. Timofeeva L.A., Aparin T.P., Trofimenko N.Z. Kërkesat për aminoacide të shtameve të mikrobeve të murtajës të izoluara në vatra të Siberisë // Dokl. Irkutsk, instituti kundër murtajës. Irkutsk, 1971. - Çështje. 9. - fq. 43 - 44.
64. Timofeeva L.A., Zhamyan Suren, Sotnikova A.N. dhe të tjera vetitë biologjike të shtameve të mikrobeve të murtajës të izoluara në Mongoli në 1969 - 1971. // Problemet e infeksioneve veçanërisht të rrezikshme. 1974. - Nr.3 (37). - F. 37 - 42.
65. Timofeeva JI. A., Logachev A.I. Yersinia pestis ulegeica është një nëngrup i ri i mikrobit të murtajës i izoluar në Mongoli. Në librin: Epidemiologjia dhe parandalimi i infeksioneve veçanërisht të rrezikshme në Mongoli dhe BRSS. - Ulaanbaatar: B.I., 1975. - F. 63 -64.
66. Tumansky V.M. Ndryshueshmëria e mikrobit të murtajës në kushtet natyrore të vatrës së murtajës // Libri: Natyra, vatra dhe epidemiologjia. informacione veçanërisht të rrezikshme - Saratov, 1959. S. 189 - 199.
67. Filippov A.A., Kutyrev V.V., Vidyayeva N.A. dhe të tjera Klonimi i vendndodhjes së plazmidit të varësisë nga kalciumi i Yersinia pestis (Lehmann, Neumann), që kodon sintezën e proteinës së membranës së jashtme (BVM2) // Gjenetikë. 1991. - T. 27, Nr. 4.-S. 598-606.
68. Filippov A.A., Solodovnikov N.S., Kukleva L.M. dhe të tjerët Studimi i përbërjes plazmidike të shtameve patogjene të murtajës nga vatra të ndryshme natyrore // JMEI. 1992. - Nr. 3. - F. 10 - 13.
69. Tseneva G.Ya., Solodovnikova N.Yu., Voskresenskaya E.A. Aspektet molekulare të virulencës së Yersinia // Klin, mikrobiol. antimikrobik, kimio. 2002. - T. 4, nr. 3. - F. 248 - 266.
71. Yashechkin Yu.I., Kirillina O.A., Popov Yu.A. dhe të tjera Harta fizike e plazmidit 68 ppm Y pestis 231 // Problemet e infeksioneve veçanërisht të rrezikshme. -1999. -Nr 1 S. 26-28.
72. Achtman M., Morelli G., Zhu R. etj. Mikroevolucioni dhe historia e bacilit të murtajës, Yersinia pestis II Proc. Natl". Acad. Sei. SHBA. 2004. - 101. - P. 17837-17842.
73. Achtman M., Zurth K., Morelli G. et al. Yersinia pestis, shkaktari i murtajës, është një klon i shfaqur së fundmi i Yersinia pseudotuberculosis II PNAS. 1999. - V. 96;N24. -P. 14043-14048.
74. Anisimov A.P.*, Lindler L.E., Pier G.B. Diversiteti intraspecifik i Yersinia pestis II Clin. Mikrobiol. 2004. - V. 17 (2). - F. 434 - 464.
75. Anisimov P.I., Popov Iu.A., Kokushkin A.M. Ndryshueshmëria fenotipike funksionale në patogjenin e murtajës dhe enzootikët e murtajës // Med. Parazitol. (Mosk). 2001. - N2.-P. 35-40.
76. Bai G., Smith E., Golubov A., Pata J. et al. Rregullimi diferencial i gjenit në Yersinia pestis kundrejt Yersinia pseudotuberculosis: efektet e hipoksisë dhe roli i mundshëm i një rregullatori plazmid // Adv. Exp. Med. Biol. 2007. - V. 603. - F. 131 - 144.
77. Baxevanis A.D., Francis-Ouellette B.F./ Bioinformatics. Një udhëzues praktik për analizën e gjeneve dhe proteinave / John-Willey N.Y., 2001. 470 f.
78. Bearden S.W., Sexton C., Pare J. et al. Izolimet enzootike (pestoide) të dobësuara të Yersinia pestis shprehin aspartazën aktive // Mikrobiologji. 2009 - V.155. -P. 198-209.
79. Beale J., Lee S.Y., Iwata S., Beis K. Struktura e proteinës alifatike që lidhet me sulfonat SsuA nga Escherichia coli II Acta Cryst. 2010. - V. 66. - F. 391 -396.
80. Ben-Gurion R., Hertman J., Plazmidi linear material i ngjashëm me bakteriocinën e Yersinia enterocolitica me skaje të mbyllura kovalente // Moll. Mikrobiol. - 1958-V. 48.-P. 989-1003.
81. Bercovier H. Lidhja brenda dhe ndërspeciale e Yersinia pestis nga hibridizimi i ADN-së dhe lidhja e saj me Yersinia pseudotuberculosis II Curr. Mikrobiol. 1980. - Nu 4. - F. 225 - 229.
82. Bobrov A.G., Kirillina O.A., Forman S. et al. Vështrim në zhvillimin e biofilmit Yersinia pestis: topologjia dhe bashkëveprimi i proteinave të membranës së brendshme hms të përfshira në prodhimin e ekzopolisakarideve // Mjedisi.mikrobiol. - 2008. V. 10, N 6.-P. 1419-1432.
83. Bobrov A.G., Perry R.D. Yersinia pestis lacZ shpreh një beta-galaktozidazë me aktivitet të ulët enzimatik // FEMS Microbiol. Lett. 2006. - V. 255, N 1. - F. 43 -51.
84. Brubaker R.R. Ndërkonvertimi i mononukleotideve purine në Pasteurella pestis II Infect. imun. 1970. - V. 1. - F. 446 - 454.
85. Brubaker R.R. Gjinia Yersinia: biokimia dhe gjenetika e virulencës // Temat aktuale në Microbiol dhe Immunol. 1972. -N 57. - F. 293 - 299.
86. Brubaker R.R. Shfaqja e fundit e murtajës: një proces i evolucionit kriminel // Ekologjia mikrobike. 2004. - V. 47. - F. 293 - 299.
87. Burrows T.W. Virulenca e Pasteurella pestis dhe imuniteti ndaj murtajës // Er-geb Mikrobiol Immunitatsforsch Exp Ther. 1963 - V. 37. - F. 59-113.
88. Buchrieser C., Prentice M., Carniel E. Rajoni i paqëndrueshëm me 102 kilobazë i Yersinia pestis përfshin një ishull me patogjenitet të lartë të lidhur me një segment pigmentimi i cili i nënshtrohet rirregullimit të brendshëm // J. Bacterid. - 1998. - V. 180. - F. 2321-2329.
89. Cao Y., Huang H., Meng K. et al. Klonimi dhe shprehja funksionale e një a-galaktozidaze nga Yersinia pestis biovar Microtus str. 91001 //Biosci. Bioteknol. Biokimik. 2008.-V. 72, N 8. - P. 2203 - 2205.
90. Zinxhiri P.S., Carniel E., Larimer F.W. et al. Vështrime mbi evolucionin e Yersinia pestis përmes krahasimit të gjithë gjenomit me Yersinia pseudotuberculosis! I Proc. Natl. Akad. Sei. SHBA. 2004. - V. 191, N38.-P. 13826-13831.
91. Zinxhiri P. S., Hu P., Malfatti S. A. et al. Sekuenca e plotë e gjenomit të llojit Yersinia pestis Antiqua dhe Nepal516: dëshmi e reduktimit të gjeneve në një patogjen në zhvillim // J. Bacterid. 2006. - V. 188, N 12. - F. 4453 - 4463.
92. Chuang Peng / Metodat e bazuara në distancë në ndërtimin e pemëve filogtetike, f. 1 -11,2007.
93. Cobbs C.G., Chansolme D.H. Murtaja. // Klin. Dermatoli. 2004. - V. 22 (3). -P. 303-312f
94. Cornells G.R., Boland A., Boyd A.P. et al. Plazmidi i virulencës së Yersinia, një gjenom antihost // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - V. 62, nr. 4. -P. 1315-1352.
95. Cowan C. et al., Pushtimi i qelizave epiteliale nga Yersinia pestis: dëshmi për një pushtim specifik të Y. pestis // Infekt. imun. 2000. - V. 68 (8). - F. 4523 - 4530.
96. Dale C., Wang B. et al. Murtaja // Proc. Natl. Akad. Sei. SHBA. 2002. -Vëll.99, Nr.19.-P. 12397-12402.
97. Darby C., Ananth S.L., Tan L., Hinnebusch B.J. Identifikimi i gmhA një gjeni Yersinia pestis i nevojshëm për bllokimin e pleshtave duke përdorur një biofilm Caenorhabditis elegans// Infect.Immun.- 2005. V.73, N11. - P. 7236 - 7242.
98. Deng W., Burland V., Plunkett G. et al. Sekuenca gjenomike e Yersinia pestis KIM // J. Bacteriol. 2002 - V. 184 - P. 4601 - 4611.
99. Dennis D.T., Chow C.C. Murtaja // J. Pediatr. Infektojnë. Dis. 2004. - V. 23 (1). -P. 69-71.
100. DeSalle R., Giribet G., Wheeler W. / Techniques in molecular systematics and evolution / Birkhauser, 2002. 420 f.
101. Devignat R. Variétés de l'espèce pestis // OBSH 1951. - V. 4.-P.
102. Epinger M., Guo Z., Sebastian T., Song Y., Lindl er L.E., Yang R., Ravel J. Draft sekuencat e gjenomit të izolimeve Yersinia pestis nga vatra natyrore të murtajës endemike në Cine // J. Bacteril. 2009. - V. 191. - F. 7628 - 7629.
103. Epinger M., Rosovitz M.J., Fricke W.F. et al. Sekuenca e plotë e gjenomit të Yersinia pseudotuberculosis IP31758, agjenti shkaktar i Etheve të Skarletit të Lindjes së Largët // Plos Genetics 2007. - V. 3 - P. 1508 - 1522.
104. Eppinger M., Worsham P.L., Nikolich M.P. et al. Sekuenca gjenomike e sojit me rrënjë të thella Yersinia pestis Angola zbulon njohuri të reja mbi evolucionin dhe pangjenomën e bakterit të murtajës // J. Bacteriol. 2010. - V. 192, N 6. - P.i1685-1699.
105. Felek S., Tsang T.M., Krukonis E.S. Tre adezina Yersinia pestis lehtësojnë shpërndarjen e Yop në qelizat eukariote dhe kontribuojnë në virulencën e murtajës // Infektojnë. imun. V. 77 (2). - F. 825 - 836.
106. Felsenstein J., PHYLIP-Phylogeny Inference Package (versioni 3.2). Cladistics, 1989, vëll. 5, fq. 164 -166, http://evolution.genetics.washington.edu/philip.html.
107. Fetherston J.D., Perry R.D. Lokusi i pigmentimit të Yersinia pestis KIM6+ është i rrethuar nga një sekuencë futjeje dhe përfshin gjenet strukturore për ndjeshmërinë ndaj pesticinës dhe HMWP2 // Mol. Mikrobiol. 1994. - V. 13, nr. 4. - F. 697 - 708.
108. Forman S., Wulff C. R., Myers-Morales T. et al. yadBC e Yersinia pestis, një përcaktues i ri i virulencës për murtajën bubonike // Infektoni imunitetin. - 2008. V. 76(2). -P. 578-587.
109. Garcia E., Worsham P., Bearden S. et al. Pestoides F, një lloj atipik Yersinia pestis nga ish-Bashkimi Sovjetik // Adv Exp Med Biol. 2007. - V. 603. -P. 17-22.
110. Gascuel O. / Matematika e evolucionit dhe filogjenisë. / Clarendon shtyp. Oksfordit. 2004.-33 f.
111. Gintsburg A.L., Shovadaeva G.A., Shubin F.N. et al. Integrimi me kromozomin - një gjendje alternative e plazmideve të varura nga kalciumi në Yersinia // Mol. Gjeneral. mikrobiol. Virusol. 1989. -N 5. -P. 7-11.
112. Guiyoule A., Gerbaud G., Buchriester C. et al. Rezistenca e transferueshme e ndërmjetësuar nga plazmida ndaj streptomicinës në një izolim klinik të Yersinia pestis II Emerg. Infektojnë. Dis. 2001. - Vëll. 7, nr. 1. - F. 43 - 48.
113. Guo Y., Zhang L., Xia L. et al. Karakteret biokimike të Yersinia pestis të izoluara nga qarku Yulong i provincës Yunnan në Kinë // Endem. Dis. dem. -2008.-V. 23.-P. 12-14.
114. Hall-Stoodley L., Costerton J.W., Stoodley P. Biofilmat bakterial: nga mjedisi natyror te sëmundjet infektive. Nat. Rev. Mikrobiol. 2004, N2. - P 95 -108.
115. Hare J.M., McDonough K.A. Mekanizmat e varur dhe të pavarur nga RecA me frekuencë të lartë të mutacioneve lidhëse të kuqe të Kongos në Yersinia pestis. H J Bakteriol. 1999.-V. 181 (16). - F. 4896-4904.
116. Hillier S.L., Charnetzky W.T. Testi i shpejtë diagnostikues që përdor aktivitetin e isocitratit liazës për identifikimin e Yersinia pestis II J.Clin.Microbiol. - 1981. V.13, N4. -P. 661-665.
117. Hinnebusch B.J. Evolucioni i transmetimit të shkaktuar nga pleshtat në Yersinia pestis II Curr. Çështjet Mol. Biol. 2005. - V. 7, N2. - F. 197 - 212.
118. Hinnebusch B.J., Fisher E.R., Schwan T.G. Vlerësimi i rolit të aktivizuesit të plazminogenit Yersinia pestis dhe faktorëve të tjerë të koduar të plazmidit në bllokimin e varur të butë të pleshtit // Infektojnë. imun. 1998. - V. 178. - F. 1406 -1415.
119. Hinnebusch B.J., Perry R.D., Schwan T.G. Roli i vendndodhjes së ruajtjes së heminit Yersinia pestis (hms) në transmetimin e murtajës nga pleshtat // Shkencë. 1996. - V 273, N5273-P. 367-370.
120. Hinnebusch B.J., Rudolf A.E., Cherepanov P.et al. Roli i toksinës së mykut Yersinia në mbijetesën e Yersinia pestis në zorrën e mesme të vektorit të pleshtit // Shkencë. - 2002.-V. 296.-P. 733-735.
121. Hoiczyk E., Roggenkamp A., Reichenbecher M. et al. Analiza e strukturës dhe e sekuencës së Yersinia YadA dhe Moraxella UspA zbulon një klasë të re të adezinave // J. EMBO 2000. - V. 19(22). - F. 5989 - 5999.
122. Iriarte M., Cornelis G.R. Përcaktuesit molekularë të patogjenezës së Yersinia // Microbiologia. 1996.-V. 12 (2). - F. 267-280.
123. Jackson S., Burrows T.W. Efekti rritës i virulencës i hekurit në mutantët jo të pigmentuar të shtameve virulente të Pasteurella pestis // Br. J. Exp. Pathol. - 1956. -Y. 37.- F. 577-583.
124. Joshua G.W.P., Karlyshev A.V., Smith M.P. et al. Një model Caenorhabditis elegans i infeksionit Yersinia: formimi i biofilmit në një sipërfaqe biotike // Mikrobiologji. 2003. - V. 149. - F. 3221 - 3229.
125. Kienle Z., Emody L., Svanborg C., O"Toole P.W. Vetitë ngjitëse të dhëna nga aktivizuesi i plazminogenit të Yersinia pestis. II J. Gen. Microbiol. 1992. -V. 138.-1679-1687.
126. Kitching I.J., Forey P.L., Humphries C.J., Williams D.M. / Kladistika. Teoria dhe praktika e analizës së maturisë. - Botimet shkencore të Oksfordit, 1998. - 223 f.
127. Kutyrev V.V., Boolgakova E.G., Yidyaeva N.A. et al. Karakteristikat krahasuese të grupeve të ndryshme bakteriale të gjinisë Yersinia // Infekti natyror. Dis.: Abst. i Shkencës. Konf. 6 dhjetor. Ulanbaatar, 2001. - F. 39 - 40.
128. Kutyrev V.V., Filippov A.A., Oparina O.S. et al. Analiza e përcaktuesve kromozomikë Yersinia pestis Pgm+ dhe Psts të lidhur me virulencën // Microb. Pa-tog. 1992.-V. 12.- Fq. 177-186.
129. Kutyrev V.Y., Vidyaeva N.A., Bobrov A.G. et al. Gjeni i toksinës së mirit kodon për një fosfolipazë D të sekretuar // Toksina të proteinave bakteriale. Jena-Shtutgart. - 1997.-P. 59-60.
130. Lahteenmaki K., Virkola R., Saren A. et al. Shprehja e aktivizuesit plazminogen pla të Yersinia pestis rrit lidhjen bakteriale në matricën jashtëqelizore të gjitarëve // Infekto Immun. 1998. - V. 66 (12). - F. 5755 - 5762.
131. Lathem W.W., Price P.A., Miller V.L., Goldman W.E. Një proteazë që aktivizon plazminogen kontrollon në mënyrë specifike zhvillimin e murtajës pneumonike primare // Shkencë. 2007. - V. 315 (5811). - F. 509 - 513.
132. Lazarus A.A., Decker C.F. Murtaja // Klinika e Kujdesit për frymëmarrjen. N Am. 2004. -V. 10 (1).-P. 83-98.
133. Li Y., Hauck Y., Platonov M.E. et al., Gjenotipi dhe analiza e Yersinia pestis nga ML VA: njohuri mbi zgjerimin mbarëbotëror të vatrave të murtajës së Azisë Qendrore // PLoS ONE. 2009.-V. 4 (6)., e6000.j
134. Liang Y., Hou X., Wang Y. et al. Rirregullimet e gjenomit të shtameve plotësisht të sekuencave të Yersinia pestis II J. Clin. Mikrobiol. - 2010. - V. 48 (5). - F. 1619-1623.
135. Lillard J.W., Fetherston J.D., Pedersen L. et al. Sekuenca dhe analiza gjenetike e sistemit të ruajtjes së heminës (hms) të Genit Yersinia pestis II. - 1997. V. 193. - F. 13-21.
136. Lindler LE. Metodat e tipit për patogjenin e murtajës, Yersinia pestis II J. AOAC Int. 2009. - V. 92 (4). - F. 1174 - 1183.
137. Lindler L.E. Yersinia pestis - plazmidet specifike pFra dhe pPla // Biologjia molekulare dhe qelizore e Yersinia / Ed.: E. Carniel, B.J. Yinnebusch. Horison Bio-science, 2004. - Kapitulli.
138. Matsumoto H., Young G.M. Efektorët e zhvendosur të Yersinia // Curr. Opinion. Mikrobiol. 2009. - V. 12 (1). - F. 94 - 100.
139. McDonough K.A., Barnes A.M., Quan T.J. et al. Mutacioni në gjenin pla të Yersinia pestis ndryshon rrjedhën e ndërveprimit të bacilit të murtajës-pleshtit (Siphonaptera: Cerato-phyllidae) I I J.Med. Entomil. 1993. - V. 30. - V. 772 - 780.
140. Mollaret H., Mollaret C. Fermentimi i melibiozës në gjininë Yersina dhe rëndësia e tij në diagnostikimin e varieteteve të Y. pestis II Bull Soc Pathol Exot Filiales. 1965.-V. 58 (2).-P. 154-156.
141. Mali D. W. / Bioinformatics. Analiza e sekuencës dhe gjenomit. Shtypi laboratorik Gold Spring Harbor, 2003. - 50 f.
142. Naumov A.V., Kuz"michenko I.A., Taranenko T.M. et al. Aspektet biokimike të patogjenitetit të agjentit shkaktar të murtajës // Med. Parazitol. (Mosk). 1995. - N 4 - P. 17-22.
143. Navid A., Almaas E. Rindërtimi në shkallë gjenomi i rrjetit metabolik në Yersinia pestis, tendosje 91001 // Mol. Biosist. 2009. - V. 5 (4). - F. 368 -375.
144. Odaert M., Berche P., Simonet M. Tipizimi molekular i Yersinia pseudotuberculosis duke përdorur një element të ngjashëm me IS200 // J. Clin. Mikrobiol. 1996. - V. 34 (9). -P. 2231-2235.
145. Paerregaard A., Espersen F., Skurnik M. Roli i proteinës së membranës së jashtme Yersinia YadA në ngjitjen me indin e zorrëve të lepurit dhe fshikëzat e membranës kufitare të furçës së zorrëve të lepurit // APMIS. 1991. - V. 99 (3). - F. 226 - 232.
146. Paiva Nunes M., Suassuna I., Rocco Suassuna I. Karakteristikat biokimike të mostrave të Yersinia pestis të izoluara në Brazil // Rev. Latinoam. Mikrobiol. 1977. -V. 19 (4).-P. 189-197.
147. Pan N.J., Brady M.J., Leong J.M., Goguen J.D. Synimi i sekretimit të tipit III në Antimicrob Yersinia pestis II. Agjentët Chemother. 2009. - V. 53 (2). - F. 385 -392.
148. Panina E.M., Vitreschak A.G., Mironov A.A., Gelfand M.S. Rregullimi i byosintezës së aminoacideve aromatike në gama-proteobakteret // J. Mol. Mikrobiol. Bioteknol. 2001. - V. 3, N 4. - F. 529 - 543.
149. Parhill J., Wren B:W., Thomson N.R. et al. Sekuenca e gjenomit të Yersinia pestis, agjenti shkaktar i murtajës // Natyra. 2001. - V. 413. - F. 523 - 527.
150. Patel C.N., Wortham B.W., Lines J.L. et al. Poliaminat janë thelbësore për formimin e biofilmit të murtajës // J. Bacteriol. 2006.-V. 188, N 7. - F. 2355 - 2363.
151. Pendrak M.L., Perry R.D. Karakterizimi i një lokali depozitues hemin të Yersinia pestis I I Biol. Metalet 1991. - V. 4. - F. 41 - 47.
152. Pendrak M.L., Perry R.D. Proteinat thelbësore për shprehjen e Hms+ fe-notipit të Yersinia pestis II Mol. Mikrobiol. 1993. - V.8. - F. 857 - 864.
153. Perry R.D., Pendrak M., Schuetze P. Identifikimi dhe klonimi i një lokali depozitues hemin të përfshirë në fenotipin e pigmentimit të Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - F. 5929 - 5937.
154. Perry R.D., Balbo P.B., Jones H.A. et al. Yersiniabactin nga Yersinia pestis." Karakterizimi biokimik i sideroforit dhe roli i tij në transportin dhe rregullimin e hekurit // Mikrobiologji. 1999. - V. 145, Pjesa 5. - P. 1181 - 1190.
155. Perry R.D., Fetherston J.D. Yersinia pestis agjent etiologjik i murtajës // Clin. mikrobiol. Rev. 1997. - V. 10. - F. 35.
156. Perry R.D., Lucier T.S., Sikkema D.J. et al., Rezervuarët e depozitimit të heminës dhe hekurit inorganik në Yersinia pestis II Infect. imun. - 1993. V. 61. - F. 32 - 39.
157. Perry R.D., Straley S.C., Fetherston J.D. et al. Sekuenca e ADN-së dhe analiza e plazmidit pCDl me përgjigje të ulët Ca2+ të Yersinia pestis KIM5 // Infekt. imun. 1998. - V. 6, N 10. - F. 4611 - 4623.
158. Perry R.D. Një murtajë pleshtash: mbijetesa dhe transmetimi i Yersinia pestis II ASM News. 2003. - V.69, N 7. - F. 385 - 389.
159. Murtaja. Fletët e të dhënave N267. Organizata Botërore e Shëndetësisë, e disponueshme në: http//www.who.int/mediacentre/factssheets/fs267/en/index.htm. Aksesuar më 18 prill 2006.
160. Portnoy D.A., Moseley S.L., Falkow S. Karakterizimi i plazmideve dhe përcaktuesve të lidhur me plazmidën e patogjenezës së Yersinia enterocolitica // Infekt. imun. 1981. - V. 31. - F. 775 - 782.
161. Pouillot F., Fayolle C., Camiel E. Karakterizimi i rajoneve kromozomale të konservuara në Yersinia pseudotuberculosis dhe të humbura nga Yersinia pestis I I Infect. imun. 2008. - V. 76 (10). - F. 4592 - 4599.
162. Prasad Maharjan R., Yu P.L., Seeto S., Ferenci T. Roli i liazës izocitrate dhe cikli i glioksilatit në Escherichia coli që rritet nën kufizimin e glukozës // Res. Mikrobiol. 2005. - V. 156 (2). - F. 178 - 183.
163. Prentice MB, Rahalison L. Plague // Lancet. 2007. - V. 369, N 9568. - F. 1196-1207.
164. Price S.B., Cowan C., Perry R.D., Straley S.C. Antigjeni Yersiniapestis V është një proteinë rregullatore e nevojshme për rritjen e varur nga Ca2(+) dhe shprehjen maksimale të gjeneve të virulencës me përgjigje të ulët Ca2+ // J. Bacterid. 1991. - V. 173 (8). - F. 2649 - 2657.
165. Rakin A., Boolgakowa E., Heesemann J. Organizimi strukturor dhe funksional i grupit të gjeneve të pesticinës bakteriocin Yersinia pestis // J. Microbiol. 1996.-V. 142.-P. 3415-3424.
166. Richardson D.J., Berks B.C., Russell D.A. et al. Diversiteti funksional, biokimik dhe gjenetik i reduktazave të nitrateve prokariotike // CMLS. 2001. - V. 58. - F. 165-178.
167. Sneath P.H., Socal R.R. Taksonomia numerike II Natyra. 1962. - N 193. - F. 855 - 860.
168. Quan T., Van der Linden J., Tsuchiya K. Vlerësimi i një analize gualitative isocitrate liase për identifikimin e shpejtë supozues të Yersinia pestis II J. Clin. Mikrobiol. 1982.-V. 15,N16.-P. 1178-1179.
169. Sanger F., Nicklen L., Coulson A. Sekuenca e ADN-së me inhibitorë që përfundojnë zinxhirin // Proc. Natl. Akad. Shkencë. SHBA. 1977. - Vëll. 74. - F. 5463 -5467.
170. Savostina E.P., Popov Iu.A., Kashtanova T.N. et al. Polimorfizmi gjenomik i nëngrupeve kryesore të shtameve të agjentit të murtajës // Mol. Gjeneral. mikrobiol. Virusoli. -2009-N4. F. 23-27.
171. Sebbane F., Jarrett C. O., Gardner D. et al. Roli i aktivizuesit të plazminogenit Yersinia pestis në incidencën e formave të veçanta septikemike dhe bubonike të murtajës së pleshtit // Proc.Natl. AcadlSci.SHBA. 2006. - V.103, N 14 - P.5526 - 5530.
172. Sebbane F., Jarrett G.O., Linkenhoker J.R., Hinnebusch B.J. Vlerësimi i rolit të aktivitetit konstituiv të liazës izocitrate në infeksionin Yersinia pestis të vektorit të pleshtave dhe "strehuesit të gjitarëve" // Infect, and Immun - 2004. V. 72, N 12. - P. 7334-7337.
173. Semple C., Steel M. / Phylogenetics. Shtypi i universitetit të Oksfordit, 2003. - 256 P
174. Simonet M., Riot B., Fortineau N., Berche P. Prodhimi i Invasin nga Yersinia pestis shfuqizohet duke futur një element të ngjashëm me IS200 brenda gjenit inv // Infect Immun. 1996. - V. 64 (1). - F. 375 - 379.
175. Skrzypek E., Straley S.C. Efektet diferenciale të delecioneve në lcrV në sekretimin e antigjenit V, rregullimin e përgjigjes me Ca2+ të ulët dhe virulencën e Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1995. - V. 177 (9). - F. 2530 - 2542.
176. Song Y., Tong Z., Wang J. et al., Sekuenca e plotë e gjenomit të llojit Yersinia pestis 91001, një izolim jovirulent për njerëzit // ADN Res. 2004. - V. 11 (3). -P. 179-197.
177. Stenseth N.C., Atshabar B.B., Begon M. et al. Murtaja: e kaluara, e tashmja dhe e ardhmja // PLoS Med. 2008. - V. 5(1), e3.
178. Straley et al., Modulimi mjedisor i shprehjes së gjeneve dhe patogjenezës në Yersinia // Trends Microbiol. 1995. - V. 3(8). - F. 310 - 317.
179. Sun Y.C., Hinnebusch B.J., Darby C. Prova eksperimentale për përzgjedhjen negative në evolucionin e një pseudogjeni Yersinia pestis // Proc. Natl. Akad. Sei. SHBA. 2008. V. 105, N 2. - P. 8097 - 8101.tyf
180. Surgalla M. J., Beesley E. D. Medium për veshjen me agar të kuq të Kongos për zbulimin e pigmentimit në Pasteurella pestis // Aplikim. Mikrobiol. - 1969. V. 18(5). - F. 834 -837.
181. Tahir Y., Skurnik M. YadA, adhesin shumëplanëshe Yersinia // Int. J. Med. Mikrobiol. 2001. - V. 291 (3). - F. 209 - 218.
182. Takahashi H., Watanabe H. Murtaja // Nippon Rinsho. 2007. - V. 65. - F. 54-59.
183. Tiball R.W., Hill J., Lawton D.J., Brown K.A. Yersinia pestis dhe murtaja I I Biochem. Soc. Trans. 2003. - V. 31. - F. 104 - 107.
184. Weerasingle J.P., Dong T., Schertzberg M.R. et al. Shprehja e fazës stacionare të operonit biosintetik të argininës argCBH në Mikrobiologjinë Escherichia coli II BMC. 2006. - V. 6. - F. 14 - 26.
185. Williamson ED. Murtaja. // Vaksina. 2009. - V. 4. - F. 56 - 60.
186. Trumcak B.W. Analiza e gjenomit mikrobial: njohuri mbi virulencën. Përshtatja dhe evolucioni i hostit // Natyra Rev. Genet. 2000. - V. 1. - F. 30 - 39.
187. Trumcak B.W. Yersinia një gjini model për të studiuar evolucionin e shpejtë të patogjenit bakterial// Rishikimet e natyrës. Mikrobiologjia. 2003.-V.l. - Fq.55-64.
188. Worsham P.L., Roy C. Pestoides F, një lloj Yersinia pestis që i mungon aktivizuesi i plazminogenit, është virulent nga rruga e aerosolit // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. - V. 529. -P. 129-131.
189. Xiong Jin / Bioinformatika thelbësore. Universiteti i Kembrixhit. shtyp. 2006. 361 fq.
190. Zhou D., Han Y., Song Y. et al. Gjenomika krahasuese dhe evolucionare e mikrobeve infektuese Yersinia pestis II. 2004. - V. 6 (13). - F. 1226 - 1234.
191. Zhou D., Tong Z., Song Y. et al. Gjenetika e variacioneve metabolike midis biovarëve Yersinia pestis dhe propozimi i një biovari të ri, microtus // J. Bacteriol. -2004. V. 186. - F. 5147 - 5152.
Ju lutemi vini re se tekstet shkencore të paraqitura më sipër janë postuar vetëm për qëllime informative dhe janë marrë nëpërmjet njohjes origjinale të tekstit të disertacionit (OCR). Prandaj, ato mund të përmbajnë gabime që lidhen me algoritme të papërsosur të njohjes.
Nuk ka gabime të tilla në skedarët PDF të disertacioneve dhe abstrakteve që ne ofrojmë.
Yersinia pestis nëngrupet kryesore dhe të vogla
02/03/03 – mikrobiologji
disertacione për një diplomë akademike
kandidat i shkencave biologjike
Saratov - 2010 2
Puna u krye në Institucionin Federal Shtetëror "Instituti Kërkimor Rus kundër Murtajës "Mikrobi" i Shërbimit Federal për Mbikëqyrjen e Mbrojtjes së të Drejtave të Konsumatorit dhe Mirëqenies së Njeriut"
Mbikëqyrësit shkencorë:
Anëtar korrespondues i Akademisë Ruse të Shkencave Mjekësore, Doktor i Shkencave Mjekësore, Profesor Vladimir Viktorovich Kutyrev Doktor i Shkencave Biologjike, Studiuesja e Lartë Galina Aleksandrovna Eroshenko
Kundërshtarët zyrtarë:
Doktor i Shkencave Biologjike, Profesor Lidiya Vladimirovna Karpunina Doktor i Shkencave Mjekësore Natalya Ivanovna Mikshis
Organizata drejtuese: Themelimi i Akademisë Ruse të Shkencave Mjekësore “Instituti Kërkimor i Epidemiologjisë dhe Mikrobiologjisë me emrin Akademik Nderi N.F. Gamaleya RAMS"
Mbrojtja do të bëhet "_"2010_orë në një mbledhje të këshillit të disertacionit D 208.078.01 për mbrojtjen e disertacioneve të doktoraturës dhe kandidatëve në Institutin Federal Shtetëror "Instituti Rus i Kërkimeve kundër Murtajës "Mikrobi"" (410005, Saratov, Universitetskaya St., 46).
Disertacioni mund të gjendet në bibliotekën shkencore të Institucionit Federal Shtetëror "Instituti Rus i Kërkimit Anti-Murtajë" "Mikrobi".
Sekretari shkencor i këshillit të disertacionit, Doktor i Shkencave Biologjike, studiues i lartë A.A. Sludsky
PËRSHKRIMI I PËRGJITHSHËM I PUNËS
Rëndësia Problemet. Murtaja është një sëmundje infektive bakteriale në karantinë fokale natyrore zoonotike, veçanërisht e rrezikshme me një mekanizëm të transmetueshëm të transmetimit të patogjenit [Cherkassky, 1996]. Murtaja përbën një kërcënim real për popullatën për shkak të ekzistencës së vatrave të shumta natyrore të murtajës, disa prej të cilave ndodhen në Federatën Ruse dhe vendet fqinje [Onishchenko et al., 2004]. Ekziston një probabilitet i lartë që patogjeni i murtajës të futet në Rusi nga vendet fqinje që janë të paprekura nga kjo sëmundje, si dhe si rezultat i akteve bioterroriste. Sipas OBSH-së, më shumë se 2000 raste të murtajës regjistrohen çdo vit në mbarë botën, shumë prej të cilave janë fatale. Një shpërthim i madh i murtajës pneumonike në vitin 2009 ndodhi në Rajonin Autonom të Tibetit Hainan të Kinës, i cili gjithashtu raportoi një numër vdekjesh. Të gjitha këto fakte kërkojnë urgjentisht zhvillimin e metodave të reja, shumë efektive për diagnostikimin e patogjenit të murtajës, të bazuara në teknologjitë moderne, si dhe mjete për parandalimin dhe trajtimin e sëmundjes veçanërisht të rrezikshme që ajo shkakton.Klasifikimet e Yersinia pestis të përdorura deri më tani kanë marrë parasysh vetëm karakteristikat morfologjike, kulturore, biokimike dhe karakteristika të tjera fenotipike [Bezsonova, 1928; Borzenkov, 1938; Tumansky, 1957; Timofeeva, 1968; Kutyrev, Protsenko, 1998; Devignat, 1951] dhe nuk ishin pa disavantazhe të lidhura me ndryshueshmërinë e këtyre vetive. Sidoqoftë, përparimet e fundit në gjenetikën themelore dhe mikrobiologjinë molekulare bëjnë të mundur zhvendosjen e zgjidhjes së problemeve të sistematizimit të agjentit shkaktar të murtajës në një nivel cilësor të ri, bazuar në përdorimin e veçorive të tij gjenetike molekulare.
Në përputhje me klasifikimin vendas të pranuar aktualisht, shtamet e patogjenit të murtajës ndahen në nëngrupet kryesore dhe 4 të vogla (Kaukaziane, Altai, Gissar dhe Ulegey) [Timofeeva, 1985; Kutyrev, Protsenko, 1998]. Sipas klasifikimit të huaj të përhapur, shtamet Y. pestis, bazuar në ndryshimet në një sërë vetive biokimike (aftësia për të fermentuar glicerinën, për të reduktuar nitratet dhe për të oksiduar amoniakun) dhe në bazë historike dhe gjeografike, ndahen në tre biovarë: antiqua (antike), medievalis (mesjetare) dhe orientalis (orientale). Sipas karakteristikave fenotipike, shtamet e nëngrupeve kryesore korrespondojnë me tre biovarë (të lashtë, mesjetar dhe oriental) të pranuar në klasifikimin e huaj. Megjithatë, shtamet Y. pestis që qarkullojnë në vatra natyrore të murtajës në Federatën Ruse dhe vendet fqinje mbeten të pa sistematizuara sipas përkatësisë së tyre në biovarë të veçantë.
Për sa i përket shprehjes së karakteristikave biokimike të rëndësishme diferenciale, më aktivet janë shtamet e biovarit antik. Ata fermentojnë glicerinën dhe kanë aktivitet denitrifikues. Llojet e biovarit mesjetar Y.
pestis nuk janë në gjendje të reduktojnë nitratet, por fermentojnë glicerolën dhe arabinozën.
Llojet e biovarit lindor nuk fermentojnë glicerinë, por reduktojnë në mënyrë aktive nitratet dhe përdorin arabinozën.
Llojet e nëngrupeve kryesore që qarkullojnë në Federatën Ruse dhe vendet fqinje janë, si rregull, shumë virulente dhe kanë një rëndësi të lartë epidemike. Ata nuk fermentojnë ramnozën dhe melibiozën, nuk janë të ndjeshëm ndaj pesticinës I dhe kanë një nivel të lartë të prodhimit të isocitralazës. Llojet e nënspecieve të vogla fermentojnë ramnozën dhe melibiozën, janë të ndjeshme ndaj pesticinës I, nuk shfaqin aktivitet izocitrat-liazë, janë virulente selektive për kafshët laboratorike dhe kanë një rëndësi të vogël epidemike.
Arsyet gjenetike për shprehjen e ndryshme të karakteristikave biokimike të përdorura në ndarjen e shtameve Y. pestis në biovarë dhe nënspecie mbeten të studiuara mjaftueshëm deri më sot. E vetmja gjë që është vërtetuar me besueshmëri është se arsyeja e mungesës së fermentimit të glicerinës në shtamet e biovarit lindor është një mutacion në gjenin e glicerol-3-fosfat dehidrogjenazës (glpD). U tregua se të gjitha shtamet e biovarit lindor kanë një fshirje prej 93 bp në këtë gjen. . Në literaturë, ka vetëm disa punime për përcaktimin e dallimeve në strukturën e gjeneve Y. pestis të nënspecieve kryesore dhe të vogla, që kodojnë reduktimin e nitrateve dhe fermentimin e ramnozës [Kukleva et al., 2008;
2009; Anisimov et al., 2004; Zhou et al., 2004].
Arsyet për heterogjenitetin e shtameve të mikrobeve të murtajës për sa i përket nevojave ushqyese mbeten të panjohura. Llojet nga vatra të ndryshme natyrore të murtajës ndryshojnë në nevojat ushqyese, të përcaktuara nga shqetësimet në gjenet e ndërmjetme të metabolizmit, të cilat mund të përdoren në një skemë gjenetike për diferencimin e shtameve të Y. pestis nga vatra të ndryshme natyrore të murtajës.
Identifikimi i ndryshimeve në strukturën e gjeneve që qëndrojnë në themel të shprehjeve të ndryshme të tipareve mikrobiologjike dhe biokimike do të shërbejë si një bazë e besueshme për krijimin e një skeme gjenetike për klasifikimin e shtameve të patogjenit të murtajës, si dhe për përcaktimin e drejtimeve kryesore të evolucionit intraspecifik të Y. pestis.
Qëllimi i punës. Përcaktimi i bazës gjenetike për shprehjen e ndryshme të karakteristikave biokimike të përdorura për të ndarë shtamet e patogjenit të murtajës në nënspecie dhe biovarë.
Objektivat e kërkimit:
Për të karakterizuar shtamet Y. pestis të përdorura në punim, të izoluara nga vatra natyrore të murtajës në Federatën Ruse dhe vendet fqinje, sipas vetive biokimike (reduktimi i nitrateve, prodhimi i isocitratit liazës, fermentimi i arabinozës dhe melibiozës), të cilat qëndrojnë në themel të ndarjes. në nënspecie dhe biovarë. Për të përcaktuar nëse shtamet që qarkullojnë në Rusi dhe vendet fqinje i përkasin biovarëve të caktuar.
Për të studiuar organizimin strukturor dhe funksional të gjeneve që kodojnë karakteristikat diferenciale të përdorura në ndarjen në biovarë - reduktimi i nitrateve dhe fermentimi i arabinozës.
Për të identifikuar ndryshimet në gjenet e Y. pestis që përcaktojnë fermentimin e melibiozës dhe prodhimin e liazës izocitrate, të cilat qëndrojnë në themel të diferencimit të nënspecieve kryesore dhe të vogla të patogjenit të murtajës.
Për të përcaktuar nevojat ushqyese të shtameve Y. pestis të nënspecieve kaukaziane dhe për të vendosur bazën gjenetike të auksotrofisë së tyre.
Për të vlerësuar perspektivat e përdorimit të rezultateve të marra për të krijuar një skemë gjenetike për klasifikimin intraspecifik të shtameve Y. pestis dhe për të vendosur drejtimet kryesore të evolucionit intraspecifik të këtij patogjeni.
Risi shkencore puna. Bazuar në të dhënat nga analizat komplekse mikrobiologjike, biokimike dhe gjenetike, u vërtetua se shtamet e patogjenit të murtajës që qarkullojnë në vatra natyrore të Federatës Ruse dhe vendeve fqinje i përkasin biovarëve antikë dhe mesjetarë.
Për herë të parë u tregua se arsyeja e mungesës së aktivitetit reduktues të nitratit në disa shtame të nënspecieve kryesore që qarkullojnë në Federatën Ruse dhe vendet fqinje është prania e një zëvendësimi të vetëm nukleotid GT në pozicionin e reduktazës nitrateve periplazmike. gjen - napA, i cili dëshmon se këto shtame i përkasin biovarit mesjetar. Mungesa e shprehjes së këtij tipari në shtamet e nëngrupeve Altai dhe Gissar shkaktohet nga futja e një nukleotidi timine (+T) në pozicionin 302 të një gjeni tjetër, ssuA, i cili çon në një zhvendosje në kornizën e leximit dhe ndërprerje të struktura e proteinës së transportit të koduar, SsuA, e cila gjithashtu është e përfshirë në reduktimin e nitrateve.
Për herë të parë u vërtetua se mungesa e fermentimit të arabinozës në Y.
pestis i nënspecieve Altai dhe Gissar shoqërohet me praninë e një mutacioni në gjenin rregullator të operonit arabinoz - araC, i cili përmban një futje të një nukleotidi guanine (+G) në pozicionin 773 nga fillimi i gjenit, duke çuar në një zhvendosje në kornizën e leximit dhe prishje e strukturës së proteinës rregulluese AraC, e nevojshme për fillimin e transkriptimit të gjeneve të operonit arabinoz.
Për herë të parë, është vendosur baza gjenetike e prodhimit të ndryshëm të liazës izocitrate në shtamet e patogjenit të murtajës të nënspecieve kryesore dhe të vogla, e lidhur me praninë e një futjeje të dy nukleotideve (+CC) në gjenin rregullator iclR. në pozicionin 269, që çon në inaktivizimin e proteinës represore të operonit acetat IclR të koduar prej tij dhe është shkaku i sintezës konstituive të enzimës izocitrate liazë në shtamet e nëngrupit kryesor. Llojet e nëngrupeve të vogla përmbajnë një gjen iclR të paprekur dhe nuk janë të afta për sintezën konstituive të izocitratit liazës.
Është treguar se mungesa e fermentimit të melibiozës në shtamet Y. pestis të nënspecieve kryesore është për shkak të futjes së sekuencës së futjes IS285 në gjenin melB, i cili kodon enzimën galaktoside permeazë. Në shtamet e nënspecieve të vogla, futja IS285 në gjenin melB mungon.
Për herë të parë është identifikuar baza gjenetike e auksotrofisë së shtameve të nënspecieve kaukaziane, e cila shoqërohet me futjen e sekuencave të futjes IS100 në gjenet argA dhe aroF, një futje 10 bp. në gjenin aroG, futja e një nukleotidi timine në gjenin thiH dhe fshirja e 13 bp. në gjenin thiG.
Karakteristikat molekulare të marra të shtameve Y. pestis të nënspecieve kryesore dhe të vogla nga gjenet që kodojnë karakteristikat biokimike që qëndrojnë në bazë të ndarjes në nënspecie dhe biovarë, krijojnë bazën për zhvillimin e një skeme gjenetike për klasifikimin intraspecifik të patogjenit të murtajës.
Bazuar në rezultatet e punës, aplikimet për shpikjen “Metodë për përcaktimin e nënspecieve të shtameve patogjene të murtajës me sekuencë” (Nr. 2009116913. Prioriteti i datës 14 maj 2009. Është marrë një vendim për lëshimin e një patente) dhe “Metoda për diferencimi i nënspecieve të shtameve Yersinia pestis duke përdorur tipizimin e sekuencës multilocus (Nr. 2009146094) Prioriteti i datës 12/11/2009.
Rëndësia praktike puna. Bazuar në rezultatet e punës, u hartuan dhe miratuan rekomandimet metodologjike: "Përcaktimi i nëngrupeve të shtameve patogjene të murtajës bazuar në sekuencën e gjeneve rhaS dhe araC që kontrollojnë fermentimin e ramnozës dhe arabinozës" (miratuar nga drejtori i RosNIPCI “Mikrobi nr. 6 i 16 qershorit 2009) dhe “Përcaktimi i shtameve të nënspecieve të Yersinia pestis duke përdorur tipizimin e sekuencës multilocus (miratuar nga drejtori i RosNIPCI “Microbe”. Protokolli nr. 1 i datës 23 shkurt 2010).
Tre shtame janë depozituar në Koleksionin Shtetëror të Baktereve Patogjene: Y. pestis KM 910 i Altait, KM 596 i nëngrupit Gissar dhe KM 1861 i nëngrupit Ulegey si shtame referencë të këtyre nënspecieve.
Të dhënat mbi organizimin gjenetik të shtameve Y. pestis të marra gjatë studimit përdoren gjatë mbajtjes së leksioneve mbi temën "Genetika e agjentit shkaktar të murtajës" në kurse specializimi dhe trajnimi të avancuara në RosNIPCI "Microbe".
Dispozitat për mbrojtjen:
1. Shtamet e patogjenit të murtajës të nënspecieve kryesore që qarkullojnë në vatra natyrore të Federatës Ruse dhe vendeve fqinje i përkasin biovarëve antikë dhe mesjetarë, siç dëshmohet nga të dhënat nga një analizë gjithëpërfshirëse e vetive mikrobiologjike, biokimike dhe gjenetike të këtyre shtameve.
2. Baza për manifestimet e ndryshme të karakteristikave biokimike të përdorura në ndarjen e shtameve Y. pestis në nënspecie dhe biovarë janë lloje të ndryshme mutacionesh në gjenet që kodojnë këto karakteristika. Mungesa e aftësisë për të reduktuar nitratet në shtamet e nëngrupeve kryesore të biovarit mesjetar shoqërohet me praninë e mutacionit të pakuptimtë (G T) në gjenin napA të reduktazës periplazmike të nitratit, dhe në shtamet e nëngrupeve Altai dhe Gissar - me futja e një nukleotidi të vetëm në gjenin ssuA të proteinës transportuese periplazmike SsuA. Mungesa e fermentimit të arabinozës në shtamet e nëngrupeve Altai dhe Gissar është për shkak të futjes së një nukleotidi guanine në sekuencën e gjenit araC.
3. Aktiviteti i ndryshëm biokimik i shtameve të nënspecieve kryesore dhe të vogla të patogjenit të murtajës sipas një sërë karakteristikash diferenciale shkaktohet nga reduktimi i gjeneve që i kodifikojnë në nënspeciin kryesor dhe paprekshmëria e tyre në nënspeciin minor.
Mungesa e fermentimit të melibiozës nga shtamet e nënspecieve kryesore është për shkak të futjes së IS285 në gjenin melB galaktoside permeazë, dhe sinteza përbërëse e liazës izocitrate në shtamet e këtij nëngrupi është për shkak të futjes së dy nukleotideve (CC) në sekuenca e gjenit rregullator iclR. Llojet e nëngrupeve të vogla përmbajnë gjene të paprekur melB dhe iclR.
4. Arsyeja e nevojave të shumta ushqyese të shtameve Y. pestis të nënspecieve kaukaziane është inaktivizimi i një numri gjenesh për biosintezën e aminoacideve dhe vitaminave. Varësia e shtameve të këtij nëngrupi për argininën shkaktohet nga një futje IS në gjenin argA për fenilalaninën, ajo shkaktohet nga një futje prej 10 bp. në gjenin aroG, për tirozinë - duke futur IS100 në gjenin aroF, për tiaminë (B1) me fshirje të 13 bp. - në gjenin thiG dhe futja e një nukleotidi të vetëm në thiH. Bazuar në të gjithë kompleksin e mutacioneve të identifikuara për shtamet e nënspecieve kaukaziane dhe të tjera, si dhe biovarët e patogjenit të murtajës, u përcaktuan gjenotipe karakteristike që mund të përdoren për të krijuar një skemë gjenetike për klasifikimin intraspecifik të Y. pestis.
Miratimi i punës. Materialet e disertacionit u prezantuan dhe u diskutuan në Konferencën IX Shkencore dhe Praktike Ndërshtetërore të Shteteve Anëtare të CIS "Teknologjitë moderne në zbatimin e strategjisë globale për luftimin e sëmundjeve infektive në territorin e shteteve anëtare të Komonuelthit të Shteteve të Pavarura", Volgograd , 2008; Konferenca e VI Ndërkombëtare “Diagnostika Molekulare dhe Biosiguria”, M., 2009; Konferenca shkollore shkencore dhe praktike e shkencëtarëve dhe specialistëve të rinj të Shërbimit Federal për Mbikëqyrjen e Mbrojtjes së të Drejtave të Konsumatorit dhe Mirëqenies së Njeriut “Teknologjitë moderne për garantimin e sigurisë biologjike”, 25 – 27 maj 2010; në konferencat përfundimtare vjetore të RosNIPCI "Microbe", Saratov 2008 - 2010.
Struktura dhe qëllimi i disertacionit. Disertacioni është paraqitur në 157 faqe tekst të shtypur me makinë, përbëhet nga një hyrje, një kapitull i rishikimit të literaturës, pesë kapituj të hulumtimit të vet, një përfundim dhe përfundime. Puna është ilustruar me 11 tabela dhe 34 vizatime. Indeksi bibliografik përmban 203 burime vendase dhe të huaja.
THEMELORE PËRMBAJTJA E PUNËS
Materialet dhe metodat Në këtë punë u përdorën 111 shtame të Y. pestis dhe Y. pseudotuberculosis, duke përfshirë llojin kryesor shkaktar të murtajës dhe 50 shtame të nënspecieve të vogla të izoluara në Federatën Ruse, afër dhe larg jashtë vendit. Gjithashtu janë studiuar 10 shtame të Y. pseudotuberculosis me origjinë të ndryshme. Studimi i vetive kulturore, morfologjike dhe biokimike të shtameve u krye duke përdorur metoda të përdorura tradicionalisht [Udhëzues praktik për diagnostikimin laboratorik të sëmundjeve të rrezikshme infektive, 2009]. Izolimi i ADN-së nga shtamet e Y. pestis u krye duke përdorur një metodë standarde në përputhje me procedurën e dhënë në M.U.1.3.2569-09 "Organizimi i punës së laboratorëve duke përdorur metoda të amplifikimit të acidit nukleik gjatë punës me material që përmban mikroorganizma të grupeve të patogjenitetit I - IV". Analiza e produkteve të marra me PCR u krye në xhel agarozë 0.8 – 2% në përputhje me udhëzimet e T. Maniatis et al. . Përcaktimi i sekuencave nukleotide të gjeneve u krye në një analizues gjenetik model "CEQ 8000" (Beckman Coulter) sipas metodës së F. Sanger. Analiza krahasuese e gjenomave të Y. pestis dhe Y. pseudotuberculosis dhe rrugëve metabolike për biosintezën e faktorëve të rritjes u krye duke përdorur algoritmin BLAST të bazave të të dhënave NCBI GenBank dhe KEGG Metabolic Pathways. Analiza filogjenetike e shtameve është kryer duke përdorur programet Mega 4.0, PHYLIP dhe SplitsTree4 dhe metodat e matricës së distancës: UPGMA, FITCH, Kitch, Neighbor-Jining, Minimum Evolution.
REZULTATET E KËRKIMIT
1. Analiza e vetive mikrobiologjike dhe biokimike të shtameve Y. pestis të nëngrupeve kryesore dhe të vogla nga vatra të ndryshme natyrore të murtajës u studiuan për aktivitetin e tyre biokimik: aftësia për të reduktuar nitratet, fermentimi i. glicerina, arabinoza, melibioza, ramnoza, prodhimi i isacitrat liazës – karakteristika të përdorura për ndarjen në nënspecie dhe biovarë. U zbulua se të gjitha shtamet e studiuara të nënspecieve kryesore - Y. pestis ssp. pestis nuk fermentoi ramnozën dhe melibiozën, por prodhoi izocitrate liazë. Në të kundërt, të gjitha shtamet e Y. pestis të nëngrupeve të vogla fermentuan ramnozën dhe melibiozën, por nuk prodhonin liazë izocitrate. Informacioni i marrë lidhet me të dhënat letrare mbi karakteristikat biokimike të shtameve Y. pestis të përdorura për të dalluar nëngrupet kryesore dhe të vogla të patogjenit të murtajës.Gjatë studimit të karakteristikave biokimike të përdorura në ndarjen e shtameve Y. pestis në biovarë - reduktimi i nitrateve, fermentimi i arabinozës dhe glicerinës, heterogjeniteti në këto veti u konstatua në shtamet e nënspecieve kryesore dhe të vogla. Disa nga shtamet e nëngrupeve kryesore të izoluara në Federatën Ruse dhe vendet fqinje nuk reduktuan nitratet, gjë që tregonte se ato i përkisnin një biovari mesjetar. Llojet e nënspecieve të vogla - Altai, Gissar dhe Ulegei gjithashtu nuk reduktuan nitratet, ndërsa shtamet kaukaziane ishin pozitive për këtë tipar.
Sipas karakteristikës së dytë diferenciale - fermentimi i arabinozës, të gjitha shtamet e Y. pestis të nënspecieve kryesore, Kaukaziane dhe Ulega të studiuara në punim ishin homogjene dhe përdorën këtë monosakarid. Llojet e nëngrupeve Altai dhe Gissar nuk fermentuan arabinozën dhe baza gjenetike për shprehjen e ndryshme të këtij tipari mbeti e panjohur.
Mungesa e aftësisë për të fermentuar glicerinën (një tipar tjetër biokimik diferencial) është një tipar karakteristik i shtameve biovar orientalis. Megjithatë, në Federatën Ruse dhe vendet fqinje nuk janë identifikuar vatra me qarkullim të vazhdueshëm të shtameve të tilla. Ekzistojnë vetëm raporte të izoluara në literaturë në lidhje me izolimin e shtameve të izoluara glicerinë-negative të Y. pestis në këto territore [Sagymbek et al., 2003; Onishchenko et al., 2004].
Një shenjë karakteristike gjenetike e shtameve biovar orientalis është një fshirje prej 93 bp. në gjenin glpD – glicerol-3-fosfat dehidrogjenaza.
Ne zbuluam se të gjitha shtamet Y. pestis nga vatrat natyrore të murtajës në Federatën Ruse dhe vendet fqinje nuk përmbanin një fshirje prej 93 bp karakteristike të biovarit oriental në gjenin glpD, gjë që konfirmon mungesën e shtameve biovare orientalis midis tyre (Figura 1 ). Shtame të tilla u zbuluan vetëm midis izolimeve të marra në vendet e huaja.
Figura 1. Analiza PCR e shtameve Y. pestis me primerë për gjenin glpD: 1 – 16 – shtamet e nënspecieve kryesore nga vatra natyrore të murtajës në Federatën Ruse dhe vendet fqinje; 17 – 19 – shtamet e biovarit lindor nga vendet e huaja; 20 – kontroll negativ.
Shigjetat tregojnë madhësitë e amplifikatorëve të formuar.
Kështu, shtamet Y. pestis që studiuam, të izoluara në territorin e Federatës Ruse dhe vendeve fqinje, sipas një kompleksi karakteristikash biokimike (fermentimi i glicerinës, reduktimi i nitrateve) i përkasin biovarëve të lashtë dhe mesjetar, i cili lidhet me mendimin e pranuar përgjithësisht. se shtamet e këtyre biovareve janë të kufizuara në vatrat kontinentale të murtajës, dhe shtamet e biovarit lindor - në vatra të tipit të miut të vendosura përgjatë brigjeve të oqeanit.
Gjatë kësaj pune, shumë vëmendje iu kushtua studimit të shtameve të patogjenit të murtajës të nëngrupeve Kaukaziane, pasi, sipas një numri studiuesish [Bobrov, Filippov, 1997], ato janë më të vjetrat nga llojet e mbijetuara të murtajës. patogjen dhe janë më të afërt me paraardhësin e tij, Y.
pseudotuberkulozi. Për sa i përket vetive biokimike, shtamet e këtij nëngrupi rezultuan të jenë më aktivët midis të gjitha nënspecieve të Y. pestis. Ata kishin aktivitet reduktues të nitratit dhe fermentuan glicerinë, arabinozën, ramnozën dhe melibiozën. Meqenëse literatura përmbante të dhëna kontradiktore mbi nevojat ushqyese të shtameve të këtij nëngrupi [Martinevsky, 1969; Aparin, Golubinsky, 1989], ne kryem kërkime për të sqaruar nevojat ushqyese të shtameve të nënspecieve Kaukaziane.
U vërtetua se të gjitha llojet e studiuara të nëngrupeve Kaukaziane silleshin mjaft uniformisht. Ata kanë identifikuar nevojën për aminoacide - fenilalaninë, tirozinë, argininë dhe vitaminë B1 (tiaminë). Përveç kërkesave për këta faktorë të rritjes, shtamet nga fokusi i murtajës në malet e larta të Kaukazit Lindor treguan gjithashtu një varësi nga leucina, ndërsa shtamet e nënspecieve Kaukaziane nga vatra natyrore Leninakan, Prisevan, Zangezur-Karabakh dhe Araksin nuk kishin një varësi të tillë.
Meqenëse arsyet e auksotrofisë së shtameve të nëngrupeve Kaukaziane në aminoacide dhe vitaminë B1 (tiaminë) nuk dihen, ne më pas kryem një studim të bazës gjenetike të auksotrofisë së shtameve të kësaj nëngrupi.
2. Përcaktimi i organizimit strukturor dhe funksional të gjeneve që kodojnë karakteristikat biokimike të përdorura për të diferencuar biovarët e patogjenit të murtajës Mungesa e aftësisë për të reduktuar nitratet është një tipar karakteristik i shtameve Y. pestis të biovarit mesjetar, që i dallon ato nga shtamet. të biovarëve antikë dhe lindorë. Llojet e nëngrupeve të vogla të mikrobit të murtajës që qarkullojnë në vatra natyrore në Federatën Ruse dhe vendet fqinje ndryshojnë gjithashtu në aktivitetin e tyre denitrikues. Megjithatë, arsyet gjenetike për shfaqjen e ndryshme të këtij tipari tek ata mbeten të panjohura.
Bazuar në një analizë kompjuterike krahasuese të gjenomave të Y.
pestis dhe Y. pseudotuberculosis, të paraqitura në bazën e të dhënave NCBI GenBank, u zbulua se gjenet e përfshira në reduktimin e nitrateve kombinohen në nap operon, i cili ka një strukturë identike dhe përbëhet nga gjashtë gjene: napA-F dhe napP (Figura 2) .
U studiuan edhe gjene të tjera të përfshira në reduktimin e nitrateve: narP dhe ssuA, duke koduar përkatësisht proteinën rregullatore NarP dhe proteinën transportuese SsuA Figura 2. Struktura e nap operonit në shtamet Y. pestis Si rezultat i një analize kompjuterike të gjenet e nap operonit, prania e zëvendësimeve të vetme nukleotide në të gjitha gjenet e këtij operoni, por më i rëndësishmi ishte zëvendësimi i nukleotidit GT në pozicionin 613 nga fillimi i gjenit napA, një reduktazë nitrate periplazmike, e cila ishte identifikuar më parë në Y. pestis KIM dhe shtame të tjera të biovarit medievalis. Sipas analizave kompjuterike duke përdorur programin MEGA 4.0, u konstatua se ky mutacion çon në një ndryshim në trefishin e GAA TAA, i cili është një kodon ndalues dhe shkakton ndërprerje të parakohshme të përkthimit të zinxhirit polipeptid (pas mbetjes së aminoacideve të 204-të) të molekulën e kësaj enzime.
Ne identifikuam një mutacion tjetër të rëndësishëm për manifestimin e aktivitetit denitrifikimi në gjenin kromozomal ssuA (madhësia e gjenit – 1123 bp), i cili përmbante një futje të një nukleotidi timine në pozicionin 302 në shtamin 91001 të mikrotusit biovar (NCBI GenBank). Sipas analizave kompjuterike duke përdorur programin Mega 4.0, ky mutacion çon në një zhvendosje të kornizës së leximit dhe prishje të strukturës së proteinës SsuA.
Abetaret u krijuan për rajonet e ndryshueshme të gjeneve napA dhe ssuA, me ndihmën e të cilave fragmente të këtyre gjeneve u përforcuan në PCR dhe, më pas, u përcaktua sekuenca e tyre nukleotide. Për të identifikuar shkaqet e aktivitetit të ndryshëm denitrifikues në shtamet e Y. pestis, ne studiuam 90 shtame Y. pestis të nënspecieve kryesore dhe të vogla nga vatra të ndryshme natyrore të murtajës, si dhe 10 shtame Y. pseudotuberculosis me origjinë të ndryshme. Si rezultat i analizës, u konstatua se shtamet e nëngrupeve kryesore të izoluara në Federatën Ruse dhe vendet fqinje, të paaftë për të reduktuar nitratet, kishin një zëvendësim të vetëm nukleotid GT në pozicionin 613, karakteristik për shtamet biovar medievalis, gjë që çon në një ndryshim i kodonit (GAA TAA) dhe përfundimi i parakohshëm i zinxhirit polipeptid të përkthimit të molekulës periplazmike të nitrat reduktazës. Prania e një zëvendësimi karakteristik të nukleotideve në pozicionin 613, që është një shenjë gjenetike e biovarit medievalis, në disa nga shtamet e studiuara të nënspecieve kryesore, së bashku me mungesën e aktivitetit të tyre denitrikues, shërben si bazë për klasifikimin e tyre si mesjetarë. biovari.
Në të njëjtën kohë, ne nuk zbuluam praninë e këtij mutacioni në gjenin napA në shtamet e nëngrupeve Altai dhe Gissar, të cilat gjithashtu nuk janë në gjendje të reduktojnë nitratet. U zbulua se arsyeja e mungesës së aktivitetit denitrikues në këto shtame është një tjetër mutacion i shkaktuar nga futja e një nukleotidi timine në pozicionin 302 të gjenit ssuA të proteinës transportuese periplazmike SsuA. Ky mutacion u gjet jo vetëm në shtamet e nënspecieve Altai dhe Gissar, por edhe në shtamin 91001 të biovarit microtus, i cili gjithashtu nuk është në gjendje të reduktojë nitratet.
Një tjetër veçori e rëndësishme biokimike e përdorur për diferencimin intraspecifik të shtameve patogjene të murtajës është fermentimi i arabinozës. Të gjitha shtamet e nëngrupeve kryesore, Kaukaziane dhe Ulega janë të afta të përdorin këtë karbohidrat, ndërsa shtamet e nëngrupeve Altai dhe Gissar, si dhe biovari mikrotus, nuk janë në gjendje ta përdorin atë. Sidoqoftë, arsyet gjenetike për mungesën e manifestimit të këtij tipari në shtamet e nëngrupeve Altai dhe Gissar të patogjenit të murtajës mbeten të panjohura.
Bazuar në një analizë kompjuterike krahasuese të gjenomave të Y. pestis dhe Y.
pseudotuberkulozi (NCBI GenBank) është vërtetuar se në të gjitha llojet e mikrobeve të murtajës dhe pseudotuberkulozit, operoni arabinoz ka një strukturë identike dhe përbëhet nga gjashtë gjene. Ai përfshin pesë strukturore - araA, araB, araH, araF, araG dhe një gjen rregullator araC (Figura 3).
Figura 3. Struktura e operonit arabinoz të Y. pestis Si rezultat i një analize kompjuterike krahasuese të gjeneve të operonit arabinoz, si dhe të gjenit araD në shtamet Y. pestis dhe Y. pseudotuberculosis (NCBI GenBank), u vërtetoi se kishte një mutacion të rëndësishëm në gjenin rregullator araC, i cili përmbante një fshirje në 112 bp (26 – 137) dhe një futje guanine në pozicionin 773 në shtamin biovar microtus 91001, siç është gjetur më parë nga D. Zhou et al. .
Dy çifte të mbivendosura primerësh që rrethojnë sekuencën e plotë nukleotide të këtij gjeni u projektuan për rajonet e ndryshueshme të gjenit araC dhe amplifikimit e tij u morën me PCR.
Sekuenca e sekuencës së plotë të gjenit araC, të cilën e kryem në shtamet natyrale të Y. pestis dhe 10 shtame të Y. pseudotuberculosis, vërtetoi se shtamet e vetëm nëngrupeve Altai dhe Gissar kishin një mutacion në gjenin araC, i cili ishte i lidhur me futjen e një nukleotidi guanine në 773 pozicione, ndërsa si shtamet e nënspecieve të tjera dhe shtamet e mikrobeve të pseudotuberkulozit kishin një strukturë të paprekur të këtij gjeni. Prania e një delecioni prej 112 bp, karakteristikë e shtameve biovare të mikrotusit, nuk u zbulua në shtamet e studiuara Y. pestis të izoluara në Federatën Ruse dhe vendet fqinje.
Kështu, ne kemi vërtetuar për herë të parë se mungesa e aftësisë për të përdorur arabinozën në shtamet e nëngrupeve Altai dhe Gissar shoqërohet me futjen e një nukleotidi të vetëm në gjenin araC.
3. Identifikimi i ndryshimeve në gjenet që kodojnë karakteristikat diferenciale të përdorura në ndarjen e agjentit shkaktar të murtajës në nënspeciet kryesore dhe të vogla Shtamet e agjentit shkaktar të murtajës të nënspecieve të vogla, si dhe shtamet e Y.
pseudotuberkulozi kanë aktivitet enzimatik ndaj disakaridit melibiozë. Aftësia për të përdorur melibiozën u gjet gjithashtu në shtamet e Y. pestis biovar microtus. Në të kundërt, të gjitha shtamet shumë virulente të Y. pestis të nënspecieve kryesore nuk fermentojnë melibiozën. Arsyet gjenetike për mungesën e këtij aktiviteti biokimik mbeten të panjohura.
Bazuar në një analizë kompjuterike krahasuese të gjenomave të shtameve Y. pestis dhe Y. pseudotuberculosis, të paraqitura në bazën e të dhënave NCBI GenBank, ne kemi vërtetuar se operoni melibioz i patogjenëve të murtajës dhe pseudotuberkulozit ka një strukturë identike dhe përfaqësohet nga tre gjenet – melA (YP_1469), melB (YP_1470) dhe melR (YP_1471) (Figura 4).
Si rezultat i analizës së strukturës së këtyre gjeneve, u konstatua se ekziston një mutacion i rëndësishëm për manifestimin e vetive të studiuara në gjenin strukturor melB, që kodon proteinën transportuese MelB – galaktozid permeaza. Në sekuencën nukleotide të këtij gjeni në shtamet e nëngrupeve kryesore - CO92, KIM, Antiqua dhe Nepal516 (NCBI GenBank), u zbulua një futje e një sekuence futjeje - IS285 pas 73 nukleotideve. Në të kundërt, soji Y. pestis Pestoides F (nëngrupi kaukazian) dhe të gjitha shtamet e Y. pseudotuberculosis kanë një strukturë të paprekur të gjenit melB.
Një palë primerësh që rrethojnë rajonin e futjes IS285 u projektuan për rajonet e ndryshueshme të gjenit melB dhe një fragment i këtij gjeni u përforcua me PCR. Në të gjitha shtamet Y. pestis të nëngrupeve kryesore të përdorura në punim (51 shtame), përforcimet e marra duke përdorur këtë palë primerësh kishin një madhësi prej 1648 bp, gjë që tregonte futjen e IS285 (1324 bp) në sekuencën e gjenit melB në këto shtame dhe lidhen me mungesën e aktivitetit enzimatik të tyre kundër melibiozës. Në kontrast me nënspeciet kryesore, PCR zbuloi përforcues të një madhësie më të vogël (325 bp) në shtamet e nëntipit jo kryesor, të cilët treguan strukturën e paprekur të gjenit melB dhe korrespondonin me aftësinë e tyre për të fermentuar këtë disakarid (Figura 5).
Kështu, ne kemi vërtetuar se arsyeja e mungesës së aftësisë së shtameve Y. pestis të nëngrupeve kryesore për të fermentuar melibiozën është një shkelje e strukturës së gjenit melB, e shkaktuar nga futja e IS285. Llojet e nënspecieve të vogla përmbajnë një gjen melB të paprekur.
Për të dalluar shtamet e nëngrupeve kryesore të patogjenit të murtajës nga shtamet e nënspecieve të vogla dhe mikrobet e pseudotuberkulozit, përdoret gjithashtu aftësia e të parëve për të sintetizuar në mënyrë konstituive enzimën izocitrate liazë.
Figura 5. Analiza PCR e gjenit melB në shtamet patogjene: 1 – 3 – Nënspecie kaukaziane;
4 – 5 nënlloje Gissar; 6 – 7 – Nëngrupet Altai; 8 – Nëngrupi Ulegai; 9 – 17 – nëngrupi kryesor; 18 – kontroll negativ. Në të majtë janë shënuesit e peshës molekulare X174/HincII.
Është treguar se shtamet e Y. pseudotuberculosis dhe Y. pestis të nëngrupeve jo-kryesore, në ndryshim nga shtamet e nënspecieve kryesore, nuk janë të afta për sintezën konstituive të kësaj enzime. Megjithatë, arsyet gjenetike për dallimet në shprehjen e këtij tipari në shtamet e nënspecieve kryesore dhe jo kryesore janë aktualisht të panjohura.
Sipas analizës sonë të gjenomit të agjentit shkaktar të murtajës dhe pseudotuberkulozit në shtamet e paraqitura në bazën e të dhënave NCBI GenBank, u vërtetua se struktura e operonit acetat në të gjitha shtamet e agjentit shkaktar të murtajës është identike dhe përfshin tre gjene strukturore. - aceA, aceB, aceK, të cilat janë nën rregullimin negativ të gjenit iclR (Figura 6).
Figura 6. Struktura e operonit acetat në shtamet Y. pestis Analiza krahasuese kompjuterike e gjeneve të operonit acetat tregoi praninë e një mutacioni në gjenin rregullator iclR (843 bp) që është domethënës për manifestimin fenotipik të vetive që studiohet . U zbulua se në shtamet Y. pestis CO92, KIM, Antiqua, Nepal516 (nënspeci kryesor), gjeni i iclR u çaktivizua nga futja e dy nukleotideve (+CC) në pozicionet 269-270 nga fillimi i gjenit, dhe madhësia e tij në këto shtame ishte 845 bp. Futja (+CC) që identifikuam në pozicionin 269-270 të gjenit iclR çon në ndërprerjen e parakohshme të përkthimit të zinxhirit polipeptid të proteinës represore IclR, e cila përfshin shprehjen përbërëse të gjeneve të operonit acetat dhe, si pasojë, një nivel i lartë i sintezës së izocitratit liazës.
Për rajonin e ndryshueshëm të gjenit iclR u projektua një palë abetaresh, me ndihmën e të cilave u studiua struktura e këtij gjeni në 95 shtame natyrale të Y.
pestis të nënspecieve kryesore dhe të vogla dhe në 10 shtame të agjentit shkaktar të pseudotuberkulozit. U zbulua se sekuencat nukleotide të fragmenteve të gjenit iclR në të gjitha shtamet e Y. pestis të nëngrupeve Kaukaziane, Altai, Gissar dhe Ulega janë identike, që arrijnë në 370 bp. dhe korrespondojnë plotësisht me sekuencën e ngjashme të shtameve të mikrobit të pseudotuberkulozit, si dhe shtamin Pestoides F (NCBI GenBank), i cili tregon paprekshmërinë e rajonit të sekuencës së gjenit iclR dhe lidhet me aktivitetin e ulët të enzimës izocitrate liazë në to. Një pamje e ndryshme u gjet në shtamet e nëngrupeve kryesore të patogjenit të murtajës. Një futje u identifikua në gjenin iclR - një futje e dy nukleotideve (+CC) në pozicionet 269 - 270, e cila çon në një zhvendosje në kornizën e leximit të gjenit rregullator iclR dhe, si pasojë, në sintezën përbërëse të enzima isocitrate liazë në shtamet Y. pestis të nënspecieve kryesore.
4. Vendosja e bazës gjenetike të auxotrofisë së shtameve Y. pestis të nëngrupit Kaukazian Siç e treguam më lart, të gjitha shtamet e nënspecieve Kaukaziane kërkojnë aminoacide për rritjen e tyre: argininë, tirozinë, fenilalanium dhe vitaminë B1 - tiaminë. Megjithatë, arsyet gjenetike të auksotrofisë së shtameve Y. pestis ssp.caucasica ende nuk janë studiuar.
Në fazën e parë, ne kryem një analizë kompjuterike të rrugës së biosintezës së argininës, tirozinës, fenilalanit dhe vitaminës B1 (tiaminë) në shtamet Y. pestis dhe Y. pseudotuberculosis të paraqitura në bazën e të dhënave KEGG Metabolic Pathways, dhe identifikuam enzimat kryesore për biosinteza e këtyre faktorëve të rritjes dhe gjenet e kodimit të tyre. Duke përdorur algoritmin BLAST, u krye një analizë krahasuese e sekuencave nukleotide të gjeneve për biosintezën e argininës, tirozinës, fenilalanit dhe vitaminës B1 (tiaminë) në shtamet Y. pestis dhe Y. pseudotuberculosis (NCBI GenBank). Sipas rezultateve të analizës kompjuterike, rezultoi mutacioni që zbuluam në shtamin Pestoides F në gjenin strukturor të Nacetylglutamate sintazës - argA, i cili ishte një futje e sekuencës së futjes IS100 pas nukleotidit të 196-të që nga fillimi i gjenit. të jetë domethënëse për shfaqjen e varësisë nga arginina.
Në analizën PCR duke përdorur një palë primerësh që shoqërojnë futjen e IS100, u zbulua se madhësia e fragmentit të gjeneruar të gjenit argA në të gjitha shtamet e agjentit shkaktar të murtajës të nënspecieve kryesore, Altai dhe Ulega, si dhe pseudotuberkulozi, ishte 215 bp, që korrespondonte me një strukturë të paprekur të gjenit. Fragmentet e gjenit argA në shtamet Y. pestis të nënspecieve kaukaziane kishin një peshë të madhe molekulare (2143 bp), për shkak të pranisë së futjes IS100, duke çuar në inaktivizimin e gjenit.
Analiza e gjeneve të përfshira në biosintezën e aminoacideve aromatike tregoi se gjeni aroG (1053 bp), që kodon izoenzimën DAGPS (sintaza 3-deoksi-Darabinoheptulosonate-7-fosfat), në shtamin Pestoides F inaktivizohet nga një futje e nukleotide (në pozicionet 820 – 829), duke çuar në një zhvendosje në kornizën e leximit dhe ndërprerje të sintezës së fenilalaninës.
Gjatë renditjes së fragmentit aroG në 95 shtame natyrore të nënspecieve kryesore dhe të vogla, u zbulua se në shtamet e mikrobit të murtajës të nëngrupeve kryesore, Altai, Gissar dhe Ulegey, ky gjen ka një strukturë të paprekur dhe kodon proteinën funksionale aktive DAGPS. -. Në të kundërt, në shtamet e nënspecieve kaukaziane të Y. pestis, u gjet një futje prej 10 bp në gjenin aroG. në pozicionet 820-829, duke çuar në një zhvendosje në kornizën e leximit dhe prishje të strukturës së enzimës.
Prania e këtij mutacioni në të gjitha shtamet e nënspecieve Kaukaziane lidhet me mungesën e aftësisë së tyre për të sintetizuar fenilalaninë.
Një tjetër gjen strukturor, aroF (1071 bp), që kodon izoenzimën DAGPSTyr, në shtamin Pestoides F inaktivizohet nga futja e sekuencës së futjes IS100 pas 888 nukleotideve që nga fillimi i gjenit, gjë që shkakton humbje të aftësisë për të sintetizuar ty. Në analizën PCR, shtamet e nënspecieve kryesore, Altai, Gissar dhe Ulegei prodhuan përforcues të gjenit aroF me një madhësi prej 563 bp, që korrespondonin me strukturën e paprekur të gjenit. Në shtamet e nënspecieve Kaukaziane, një amplifikimi specifik i gjenit aroF nuk u formua në PCR, i cili tregoi humbjen e fragmentit të tij pas futjes së sekuencës së futjes IS100 dhe lidhej me auksotrofinë e tirozinës e biosintezës së vitaminës B (tiaminë) tregoi praninë e mutacioneve domethënëse në gjenet që kodojnë enzimën tiazole sintazë – thiG dhe thiH, të cilat inaktivizohen në shtamin Pestoides F me një fshirje prej 13 bp.
në pozicionet 384 – 396 dhe futja e një nukleotidi timine (+T) në pozicionin 552.
Sekuenca jonë e fragmenteve thiG dhe thiH në shtamet natyrale të Y. pestis zbuloi strukturën e paprekur të këtyre gjeneve në shtamet e nëngrupeve kryesore, Altai, Gissar dhe Ulegey, të cilat lidheshin me aftësinë e tyre për të sintetizuar vitaminën B1. Ndryshe nga nëngrupet e tjera, shtamet e nënspecieve Kaukaziane shfaqën një futje të një nukleotidi timine në pozicionin 552 të gjenit thiH dhe një fshirje prej 13 bp. në pozicionet 384-396 të gjenit thiG, që përkoi me mungesën e aftësisë së tyre për të sintetizuar tiaminë.
Kështu, ne kemi përcaktuar për herë të parë bazën gjenetike të auxotrofisë së shtameve Y. pestis të nënspecieve Kaukaziane. U vërtetua se auksotrofia për argininën shkaktohet nga futja e IS100 në gjenin argA, për fenilalaninën - nga futja e nukleotideve në aroG, për tirozinë - nga futja e IS100 në aroF, për vitaminën B1 - me një fshirje prej 13 bp. në thiG dhe me futjen e një nukleotidi timine në thiH. Mutacione të tilla nuk ndodhin në shtamet e Y. pestis të nënspecieve të tjera (kryesore, Altai, Gissar dhe Ulegei) dhe për këtë arsye mund të përdoren si shenja gjenetike karakteristike të shtameve kaukaziane.
5. Vlerësimi i perspektivës së përdorimit të të dhënave të marra për të krijuar një skemë gjenetike për klasifikimin intraspecifik të patogjenit të murtajës Si rezultat i hulumtimit tonë, ne vendosëm bazën gjenetike për shprehjen e ndryshme të karakteristikave biokimike të përdorura në ndarjen e Y. pestis. shtamet në nënspecie dhe biovarë. Ndryshueshmëria e gjeneve napA, ssuA, araC, melB, iclR, argA, aroH, aroF, thiH dhe thiG e identifikuar gjatë kësaj pune, së bashku me ndryshueshmërinë e krijuar më parë të gjenit glpD, si dhe ndryshueshmërinë e gjenit rregullator rhaS. i operonit ramnozë [Kukleva et al., 2008] mund të përdoret si bazë për një skemë gjenetike për klasifikimin e shtameve patogjene të murtajës në biovarë dhe nënspecie. Bazuar në një analizë krahasuese të sekuencave të këtyre gjeneve, ne përcaktuam tiparet karakteristike gjenetike të nëngrupeve kryesore (të lashta, mesjetare, orientale) dhe të vogla të Y. pestis (tabela). Ne përdorëm ndryshueshmërinë e sekuencave nukleotide të gjeneve që kodojnë tipare diferenciale biokimike, si dhe biosintezën e faktorëve të ndryshëm të rritjes për të përcaktuar marrëdhëniet evolucionare të shtameve Y. pestis dhe për të ndërtuar pemë filogjenetike duke përdorur programet kompjuterike Mega 4.0, PHYLIP, SplitsTree 4 duke përdorur matri. metodat: UPGMA, FitchMargulis katrore mesatare të ponderuara, Kitch, Neighbor-Joining.
Tabela. Karakteristikat gjenetike të shtameve Y. pestis të nënspecieve kryesore dhe të vogla nga vatra natyrore të Federatës Ruse dhe vendeve fqinje.
P/v kryesore Siç vijon nga Figura 7, përdorimi i objektivave të përzgjedhur të ADN-së bën të mundur diferencimin e plotë të shtameve të patogjenëve të murtajës dhe pseudotuberkulozit, si dhe ndarjen intraspecifike të shtameve Y. pestis jo vetëm në biovarë dhe në nënspecie kryesore dhe të vogla. por edhe në nënspecie të veçanta të këtij patogjeni.
Analiza e të dhënave filogjenetike konfirmon supozimin e deklaruar më parë se dega më e lashtë e evolucionit të mikrobit të murtajës janë shtamet e nënspecieve kaukaziane, të cilat kanë ngjashmërinë më të madhe gjenetike me paraardhësin e tij, mikrobin pseudotuberkuloz (Figura 8).
Nëngrupe të tjera të vogla - Altai, Gissar dhe Ulega janë filogjenetikisht afër njëri-tjetrit dhe përbëjnë një tjetër degë të lashtë të evolucionit të Y. pestis.
Të dhënat tona tregojnë se shtamet e mikrotusit, të cilat studiuesit kinezë propozuan së fundmi për t'i identifikuar si një biovar më vete, i përkasin grupit të llojeve të nëngrupeve Altai dhe Gissar dhe janë shumëllojshmëria e tyre.
Figura 7. Dendrogramet (programi Mega 4.0, metodat: A - UPGMA dhe B - Bashkimi fqinj) i shtameve Y. pestis të nëngrupeve kryesore (antike, mesjetare, lindore) dhe të vogla (kaukaziane, altai, gissar, ulegey), si. si dhe shtamet e Y. pseudotuberculosis.
Figura 8. Skema e evolucionit intraspecifik të Y. pestis Studimet e kryera në këtë punim formojnë bazën për zhvillimin e një taksonomie molekulare të patogjenit të murtajës, qëllimi i së cilës është të krijojë një taksonomi të plotë intraspecifike të Y. pestis bazuar në ndryshueshmëria e gjeneve për karakteristikat diferenciale të rëndësishme mikrobiologjike dhe biokimike të mikrobit të murtajës.
KONKLUZIONET
1. Bazuar në një analizë gjithëpërfshirëse të vetive biokimike dhe gjenetike të shtameve natyrore Y. pestis nga vatra të ndryshme natyrore të murtajës, u konstatua se shtamet e nëngrupeve kryesore që qarkullojnë në Federatën Ruse dhe vendet fqinje i përkasin biovarëve antikë dhe mesjetarë.2. Arsyeja e mungesës së shprehjes së një tipari diferencial biokimik - reduktimi i nitrateve në shtamet Y. pestis të nëngrupeve kryesore të izoluara në vatra natyrore të murtajës në Rusi dhe vendet fqinje, është prania e një mutacioni - zëvendësimi i një nukleotidi të vetëm. në gjenin napA të nitrat reduktazës periplazmike, dhe në shtamet e nënspecieve Altai dhe Gissar - futjet e një nukleotidi të vetëm në gjenin ssuA të proteinës transportuese periplazmike.
3. Për herë të parë është vendosur baza gjenetike e shprehjes së ndryshme të tipareve të fermentimit të melibiozës dhe prodhimit të liazës izocitrate në shtamet e nënspecieve kryesore dhe të vogla të mikrobit të murtajës. U tregua se mungesa e aftësisë së shtameve të nëngrupit kryesor për të fermentuar disakaridin melibiozë është për shkak të futjes së IS285 në sekuencën e gjenit strukturor melB, që kodon galaktoside permeazën. Është vërtetuar se sinteza konstituive e liazës izocitrate, karakteristikë e nënspecieve kryesore të mikrobit të murtajës, shkaktohet nga futja e dy nukleotideve (+CC) në pozicionet 269 – 270 të gjenit represor iclR.
4. Arsyeja e arabino-negativitetit të shtameve Y. pestis të nëngrupeve Altai dhe Gissar është një mutacion në gjenin rregullator të operonit arabinoz - araC, i cili shkaktohet nga futja e një nukleotidi të vetëm guanine në pozicionin 773 të këtij gjeni. .
5. Për herë të parë është përcaktuar baza gjenetike e auksotrofisë së shtameve Y. pestis të nënspecieve Kaukaziane. U vërtetua se auxotrofia për argininën shkaktohet nga futja e IS100 në gjenin argA, dhe për fenilalaninën - nga një futje prej 10 r.n. në aroG, për tirozinë - me futjen IS100 në aro F, për vitaminën B1 - me një fshirje prej 13 bp në thiG dhe me një futje të timinës në thiH.
6. U përcaktuan gjenotipet karakteristike të nëngrupeve kryesore (të lashta, mesjetare, orientale) dhe të vogla të patogjenit të murtajës, përdorimi i të cilave lejon diferencimin intraspecifik të Y. pestis. Tregohen perspektivat për përdorimin e rezultateve të marra për të krijuar një skemë gjenetike për klasifikimin intraspecifik të shtameve Y. pestis.
LISTË PUNIME TË PUBLIKUARA BAZUARA NË MATERIALET E DISERTACIONIT
1. Kukleva L.M., Eroshenko G.A., Kuklev V.E., Krasnov Ya.M., Guseva N.P., Odinokov G.N., Kutyrev V.V. Krahasimi i sekuencës së plotë nukleotide të gjenit rhaS në shtamet e patogjenit të murtajës të nënspecieve kryesore dhe të vogla // Problemet e inf veçanërisht të rrezikshme. – 2008. – Numri. 3 (97). – F. 38 – 42.2. Odinokov G.N., Eroshenko G.A., Vidyayeva N.A., Krasnov Ya.M., Guseva N.P., Kutyrev V.V. Analiza strukturore dhe funksionale e gjeneve të nap operonit në Yersinia pestis të nëngrupeve të ndryshme // Problemet e inf veçanërisht të rrezikshme. – 2008. – Numri. 4 (98). – Fq. 12 – 16.
3. Eroshenko G.A., Kukleva L.M., Vidyayeva N.A., Odinokov G.N., Shavina N.Yu., Kutyrev V.V. Karakteristikat gjenetike të nëngrupeve të vogla të patogjenit të murtajës // Teknologjitë moderne në zbatimin e strategjisë globale për luftimin e sëmundjeve infektive në territorin e shteteve anëtare të Komonuelthit të Shteteve të Pavarura. Materialet e Konferencës IX Shkencore dhe Praktike Ndërshtetërore të Shteteve Anëtare të CIS. – Volgograd, 2008. – F. 71 – 73.
4. Eroshenko G.A., Vidyayeva N.A., Odinokov G.N., Kukleva L.M., Krasnov Ya.M., Guseva N.M., Kutyrev V.V. Analiza strukturore dhe funksionale e gjenit araC në shtamet Yersinia pestis me origjinë të ndryshme // Molekul. gjenetikë, mikrobiol. dhe virusol. – 2009. – Nr.3. – Fq. 36 – 40.
5. Kukleva L.M., Odinokov G.N., Eroshenko G.A., Kutyrev V.V. Diferencimi i shtameve Yersinia pestis të nëngrupeve kryesore dhe të vogla bazuar në ndryshueshmërinë e gjeneve rhaS dhe araC // Mbledhja e materialeve të Konferencës së VI Ndërkombëtare "Diagnostika molekulare dhe biosiguria". M., 2009. – F. 124.
6. Eroshenko G.A., Odinokov G.N., Kukleva L.M., Shavina N.Yu., Krasnov Ya.M., Guseva N.P., Kutyrev V.V. Loci të ndryshueshëm të gjeneve napA, aspA, rhaS, zwf dhe tcaB si objektiva efektive të ADN-së për gjenotipizimin e shtameve Yersinia pestis // Problemet e inf veçanërisht të rrezikshme. – 2010. – Numri. 2 (104). – Fq. 57 – 59.
7. Odinokov G.N., Eroshenko G.A. Karakteristikat gjenetike të diferencimit biokimik të shtameve Yersinia pestis të nëngrupeve kryesore dhe të vogla // Mat.
shkencore - praktike shkollë - konf. shkencëtarët dhe specialistët e rinj Fed. shërbimi për mbikëqyrjen në fushën e mbrojtjes së të drejtave të konsumatorit dhe mirëqenies njerëzore “Teknologjitë moderne për garantimin e sigurisë biologjike”, 25 – 27 maj 2010, faqe 289 – 291.
Formati 60 x 84 1/16 Printim lazer Letër zyre Shtypur në pajisje printimi të Institucionit Federal Shtetëror RosNIPCHI "Mikrobi" i shkencave fizike dhe matematikore Saratov 2012 1 Puna u krye në institucionin arsimor buxhetor shtetëror federal të arsimit të lartë profesional, Shtetit Orenburg Universiteti në Qendrën Shkencore dhe Edukative për Fizikën Biokimike të Nanosistemeve. Mbikëqyrës shkencor: Berdinsky Vitaly Lvovich...”
« KULIKOVSKY MAXIM SERGEEVICH ALGA DIATOME TË DISA KËTAREVE SPAGNUM TË PJESËS EVROPIANE TË RUSISË 03.00.05 – Botanikë Abstrakt i disertacionit për konkursin gradë shkencore kandidat i shkencave biologjike Shën Petersburg 2007 2 Puna u krye në Institutin e Biologjisë së Ujërave të Brendshme me emrin. I.D. Papanin RAS Mbikëqyrës Shkencor, Doktor i Shkencave Biologjike Genkal Sergej Ivanovich Kundërshtarët zyrtarë: Doktor i Shkencave Biologjike, Profesor, Trifonova Irina Sergeevna Doktor i Shkencave Biologjike...”
« SILACHEV DENIS NIKOLAEVICH STUDIM I NEUROPROTEKTORËVE TË RI MBI NJË MODEL TË ISKEMISË FOKALE TË TRURI 03.00.13 – fiziologji Abstrakt i disertacionit për konkursin shkalla shkencore e kandidatit të shkencave biologjike Moskë - 2009 Puna u krye në laboratorin e strukturës dhe funksionit të mitokondrive të Institutit Kërkimor të Biologjisë Fizike dhe Kimike me emrin A.N. Universiteti Shtetëror i Moskës Belozersky. M.V. Lomonosov (drejtues - Doktor i Shkencave Biologjike, Profesor D.B. Zorov), në Fakultetin e Bioinxhinierisë dhe Bioinformatikës të Universitetit Shtetëror të Moskës. M.V. Lomonosov (dekani -..."
“Abstrakti i disertacionit për gradën shkencore Doktor i Shkencave Biologjike St. Medvedev Sergey Glebovich Doktor…”
« KHALIEVA Anna Sergeevna NDIKIMI I NJË FUSHËS MAGNETIKE TË KONSTATUR DHE RREZATIMIT UV NË PROCESET E RRITJES TË BIMËVE MË TË LARTË DHE FITOREMEDIACIONI I TOKËVE NGA KUSHTET TË RËNDA METALET DHE PRODUKTET E NAFTËS Specialiteti 03.02.08 - ekologji (biologji) Abstrakt i disertacionit për gradën e kandidatit të shkencave biologjike Penza - 2013 Puna u krye në Institutin Teknologjik Engels (degë) të Institucionit të Lartë Buxhetor të Arsimit Federal të Shtetit. Edukimi profesional Universiteti Teknik Shtetëror Saratov me emrin Gagarin Yu.A. në..."
« Kalmykova Olga Gennadievna MODELET E SHPËRNDARJES SË BIMËSISË STEPE TË STEPËS BURTINSKAYA (REZERVA SHTETËRORE E ORENBURGUT) 16.00.03 – Abstrakt Ekologji disertacion për gradën shkencore Kandidat i Shkencave Biologjike Shën Petersburg - 2008 Puna u krye në laboratorin e biogjeografisë dhe monitorimit të biodiversitetit të Institutit Steppe të Degës Ural të Akademisë Ruse të Shkencave Mbikëqyrës shkencor: Doktor i Shkencave Biologjike Zyrtare e Safronova Irina Nikolaevna..."
« Astafieva Oksana Vitalievna PËRDORIMI I GLYCYRRHIZA GLABRA L., ACHILLEA MICRANTHA WILLD. DHE HELICHRYSUM ARENARIUM L. PËR ZHVILLIMIN E PRODUKTEVE BIOLOGJIKE ME VETITË ANTIBAKTERIale 01/03/06 - bioteknologji (përfshirë bionanoteknologjinë) ABSTRAKT i disertacionit për gradën shkencore të kandidatit të shkencave biologjike Stavropol - 2013 Puna u krye në Institucionin Arsimor Buxhetor të Shtetit Federal të Arsimit të Lartë Profesional Astrakhan...”
« HOANG THI MINH NGUET Studim i procesit të marrjes së produkteve proteinike dhe karbohidrate nga petali i sojës së bardhë Specialiteti 03.00.23 – bioteknologji ABSTRAKT i disertacionit për gradën e kandidatit të shkencave teknike Moskë 2009 Puna u krye në Departamentin e Bioteknologjisë të Universitetit Kimiko-Teknologjik Rus. DI. Mendelejevi. Udhëheqëse shkencore: Kandidate për Shkenca Kimike, Profesor i Asociuar Alla Albertovna Krasnoshtanova Kundërshtarët zyrtarë: Doktor...”
« NOVOSELOV Sergej Vladimirovich Tiol oksidoreduktaza të reja të sistemeve të tioredoksinës dhe glutaredoksinës. Roli i tyre në rregullimin e ekuilibrit redoks qelizat 03.00.04 – biokimi 03.00.03 – biologji molekulare ABSTRAKT i disertacionit për gradën Doktor i Shkencave Biologjike Pushchino, 2008 1 Punë e kryer në Institutin e Biofizikës Qelizore të Akademisë Ruse të Shkencave, Pushchino dhe në Universitetin e Nebraskës në Lincoln (UNL), Departamenti i Biokimisë, Lincoln, Nebraska, SHBA Zyrtare...”
« Vinogradova Galina Yurievna POLYEMBRYONY IN ALLIUM RAMOSUM L. DHE ALLIUM SCHOENOPRASUM L. (FAMILY ALLIACEAE) 03.00.05 – Botanikë Abstrakt i disertacionit mbi Konkursi për gradën shkencore Kandidat i Shkencave Biologjike St. V.L. Komarova RAS Mbikëqyrës Shkencor Doktor i Shkencave Biologjike, Anëtar Korrespondent i RAS Batygina T.B. Zyrtare..."
« Volkovich Mark Gabrielevich BRUMBULLI I NËFAMILJES POLYCESTINAE (COLEOPTERA, BUPRESTIDAE): MORFOLOGJIA, FILOGJENIA, KLASIFIKIMI 02/03/05 – entomologji Abstrakt i disertacionit për gradën Doktor i Shkencave Biologjike St. Shkenca Biologjike, Profesor...”
« Torgashina Irina Gennadievna STUDIMI I NDJESHMËRISË SË NJË REAGENT ENZIMATIV TË IMOBILIZUAR PËR TESTET EKOLOGJIKE BIOLUMINESCENTI 03.00.16 – ekologji ABSTRAKT i disertacionit për gradën shkencore të Kandidatit të Shkencave Biologjike Krasnoyarsk - 2007 Puna u krye në Departamentin e Biofizikës të Institutit të Shkencave Natyrore dhe Humane të Institutit Federal Shtetëror Arsimor të Arsimit të Lartë Profesional, Universiteti Federal Federal i Siberisë Shkencore Drejtues: Doktor i Shkencave Biologjike, Profesor Kratasyuk Valentina Aleksandrovna...”
« MAYER NIKOLAY KONSTANTINOVICH APLIKIMI I MARKERËVE GJENETIKË MOLEKULARË PËR REZISTENTËN NDAJ MBIKËS SË KOKRRËRIVE NË RRËNJË NË Specialitetin TRITIFIK: 02/03/07 – gjenetikë, 01/03/06 - bioteknologji (përfshirë bionanoteknologjinë) ABSTRAKT i disertacionit për gradën shkencore të kandidatit të shkencave biologjike Moskë 2011 Puna u krye në departamentin e gjenetikës dhe bioteknologjisë dhe në qendrën shkencore dhe arsimore të bioteknologjisë molekulare i Shtetit Agrare Rus ... "
« Mbikëqyrës shkencor: Doktor i Shkencave Biologjike, Profesor Boris Ivanovich Kolupaev Kundërshtarët zyrtarë: Doktor i Shkencave Biologjike, ELENA PUZATKINA ALEXANDROVNA Profesor Sokolina Flyura Mukhametgaleevna; Doktor i Shkencave Biologjike, Profesor Roza Yakhievna Dyganova Organizata drejtuese: Universiteti Shtetëror Nizhny Novgorod me emrin. NDIKIMI N.I. Lobachevsky...”
« Smirnova Lyudmila Olegovna DIVERSITETI GJENETIK I TËrshërës SIPAS NDJESHMËRISË FOTOPERIODIKE DHE Specialitetet e Pjekurisë së HERSHME: 01/06/05 – përzgjedhja dhe prodhimi i farës së bimëve bujqësore, 01/03/05 – fiziologjia dhe biokimia e bimëve ABSTRAKT i disertacionit për gradën kandidat i shkencave biologjike St. elbi dhe departamenti i fiziologjisë së bimëve të gjithë-rusit..."
« Bezzhonova Oksana Vladimirovna Komplekset e llojeve të mushkonjave që thithin gjak të gjinisë Anopheles (Diptera, Culicidae) në Rusi dhe vendet fqinje Specialitete 02/03/05 – entomologji dhe 02/03/07 - gjenetikë ABSTRAKT i disertacionit për gradën shkencore të Kandidatit të Shkencave Biologjike MOSKË - 2011 Puna u krye në Departamentin e Entomologjisë, Fakulteti i Biologjisë, Universiteti Shtetëror i Moskës me emrin M.V. Lomonosov dhe në Laboratorin e Gjenetikës Krahasuese të Kafshëve të Institucionit...”
« RAKHIMOV Ilgizar Ilyasovich AVIFAUNA E RAJONIT TË MESËM TË VOLGËS NË KUSHTET E TRANSFORMIMIT ANTROPOGJEN TË PEIZAZHIT NATYROR Specialiteti 03.00.16 - ekologji ABSTRAKT i disertacionit për gradën Doktor i Shkencave Biologjike Moskë - 2002 Puna u krye në Departamentin e Zoologjisë dhe Ekologjisë të Fakultetit të Biologjisë dhe Kimisë të Universitetit Shtetëror Pedagogjik të Moskës Konsulent shkencor: Doktor i Shkencave Biologjike, Profesor Konstantinov V.M..."
« SALAKHOVA GULNARA MIRZALIFOVNA NDRYSHIMET NË PARAMETRAT EKOLOGJIKE DHE FIZIOLOGJIKE TË BIMËVE DHE MIKROBIOTA RHIZOSFERIKE NË KUSHTET E NDOTJES DHE TË RIKUFIZIMIT TË NAFTËS TOKAT Specialiteti 03.00.16 - Ekologji 03.00.12 - Fiziologjia dhe biokimia e bimëve Abstrakt i disertacionit për gradën kandidat i shkencave biologjike Ufa - 2007 Puna u krye në Departamentin e Biokimisë dhe Bioteknologjisë të Institucionit të Lartë Arsimor Shtetëror Edukim Profesional Bashkir...”
