Pri pripravi hranilnih gojišč je treba upoštevati potrebo gojenih mikroorganizmov po različnih hranilih. Obstajajo različne klasifikacije kulturnih medijev.
Razvrstitev hranilnih medijev po sestavi:
1. Preprosta okolja(MPB, MPA, želatina, peptonska voda). Mesno-peptonska juha (MPB) je beljakovinska osnova vseh gojišč.
MPB lahko pripravite na več načinov:
a) na mesni vodi z dodatkom že pripravljenega peptona;
b) o razgradnji produktov hidrolize surovin z uporabo encimov.
Mesni peptonski agar (MPA) - pripravljen z dodajanjem agar-agarja (1,5-3%) MPB. Če je MPA razporejen diagonalno po epruveti ali steklenički, je to poševni agar. Če je medij navpično razporejen v epruveti z višino 5-7 cm, je to kolona agarja. MPA, zamrznjen v petrijevkah v obliki paste - ploščasti agar. Če ima gojišče navpično plast visoko 2-3 cm in enako veliko diagonalno plast, gre za pol poševni agar.
2. Kompleksna okolja pripravljeno na enostavni osnovi z določenimi dodatki (ogljikovi hidrati, kri, žolč, jajca, sirotka, mleko, soli, rastni faktorji itd.)
Razvrstitev hranilnih medijev glede na začetne sestavine:
1. Naravni kulturni medij je naravni izdelek živalskega ali rastlinskega izvora.
Je lahko:
Zelenjava (začetni izdelki - soja, grah, krompir, korenje itd.).
Živali (izhodni proizvodi - meso, ribe, jajca, mleko, živalsko tkivo, žolč, krvni serum itd.).
Mešano (MPA, okolje Levenshtein-Jensen itd.).
2. Zgrajena okolja vsebujejo predelane naravne produkte (mesna voda, digest), snovi, pridobljene iz teh produktov (peptoni, kvasni in koruzni izvlečki) in različne dodatke. To je največja in po sestavi najbolj raznolika skupina medijev. Pripravljeni so po določenih receptih iz različnih poparkov ali decokcij živalskega ali rastlinskega izvora z dodatkom anorganskih soli, ogljikovih hidratov in dušikovih snovi.
3. Sintetični mediji(znane kemijske sestave) sestavljajo kemično čiste spojine v natančno določenih koncentracijah (z dodatkom ogljikovih hidratov, soli, aminokislin, vitaminov itd.). Na osnovi teh medijev, z dodajanjem naravnih ali umetnih medijev, dobimo polsintetične medije.
Razvrstitev hranilnih medijev glede na konsistenco: obstajajo okolja tekočina(gojišče brez agarja), poltekoče(z agarjem do 1%), gosto(agar - 1,5-2,5%). Tekoči mediji se pogosteje uporabljajo za preučevanje fizioloških in biokemičnih lastnosti mikroorganizmov ter kopičenje biomase in presnovnih produktov. Poltekoča gojišča se običajno uporabljajo za shranjevanje kultur, trdna gojišča za izolacijo mikroorganizmov, preučevanje morfologije kolonij, diagnostične namene, kvantitativno beleženje, določanje antagonističnih lastnosti itd.
Razvrstitev hranilnih medijev glede na predvideni namen: univerzalni (splošno uporabljeni) in posebni.
Univerzalna (osnovna) okolja. Ta gojišča se uporabljajo za gojenje večine relativno nezahtevnih mikroorganizmov ali pa se uporabljajo kot osnova za pripravo posebnih gojišč, ki jim dodajajo kri, sladkor, mleko, sirotko in druge sestavine, potrebne za razmnoževanje določene vrste mikroorganizmov. V to skupino spadajo: MPB - mesno-peptonska juha, MPA - mesno-peptonski agar, MPG - mesno-peptonska želatina itd.
Posebna okolja. Zasnovan za izolacijo in selektivno gojenje določenih vrst mikroorganizmov, ki ne rastejo na preprostih medijih.
Ločimo naslednje vrste posebnih gojišč: obogatitvena gojišča, selektivna gojišča, diferencialno diagnostična gojišča, konzervacijska gojišča in kopična gojišča.
Obogatitveni mediji.Številni mikroorganizmi ne rastejo na običajnih gojiščih, zato dodamo ogljikove hidrate (sladkorna juha ali agar) ali beljakovine (sirotkin agar in juho, krvni agar in juho), da povečamo hranilno vrednost gojišč. Krvni agar ali krvno juho pripravimo tako, da hranilnemu mediju dodamo 5-10 % segrete sterilne defibrinirane krvi ovce, kunca, konja ali človeka. Gojišče se uporablja za izolacijo streptokokov, pnevmokokov in drugih bakterij ter za preučevanje hemolitične aktivnosti. Sirotkino juho ali sirotkin agar pripravimo z dodatkom 15-20 % konjskega ali govejega seruma navadnemu mediju.
2. Izbirna (selektivna) okolja. Ti mediji so zasnovani za selektivno izolacijo in kopičenje mikroorganizmov določene vrste iz materiala, ki vsebuje več vrst mikrobov. Pri setvi materiala, ki vsebuje mešanico različnih mikroorganizmov, se bo najprej pojavila rast vrste, za katero bo to gojišče selektivno. Selektivnost okolja se doseže z ustvarjanjem pogojev, ki so optimalni za gojenje določenih mikrobov (pH, Eh, koncentracija soli, sestava hranil), t.j. pozitivna selekcija. Ali z dodajanjem snovi v okolje, ki zavirajo druge mikroorganizme (žolč, visoke koncentracije NaCl, antibiotiki itd.), t.j. negativna selekcija. Ta skupina vključuje:
Selenit okolje- je najboljši obogatitveni medij za mikrobe salmonele in dizenterije Sonne. Natrijev selenit, ki ga vsebuje gojišče, spodbuja rast teh bakterij in zavira rast pripadajoče flore.
Bizmutov sulfitni agar - vsebuje bizmutove soli, briljantno zelene. Salmonele rastejo na tem gojišču v obliki črnih kolonij. Druge vrste bakterij na tem mediju ne rastejo.
Rumenjakov solni agar (YSA) - gojišče za izolacijo stafilokokov vsebuje do 10% natrijevega klorida, ki zatre večino bakterij v materialu. Poleg tega je ta medij tudi diferencialno diagnostičen, saj prisotnost jajčnega rumenjaka omogoča odkrivanje encima lecitinaze (lecitovitelaze), ki ga tvorijo patogeni stafilokoki. Lecitinaza razgrajuje lecitin na fosfoholine in v vodi netopne maščobne kisline, zato okolje okoli lecitinaza pozitivnih kolonij postane motno in pojavi se opalescentna cona v obliki "mavričnega venca".
Žolčna juha selektiven za salmonelo, katere razmnoževanje spodbuja dodana 10% žolča, hkrati pa zavira rast spremljajočih mikroorganizmov.
Alkalni agar oz alkalna peptonska voda so selektivni za Vibrio cholerae, alkalna reakcija okolja (pH 9,0) ne prepreči rasti Vibrio cholerae, zavira pa rast drugih mikroorganizmov. 3-5 dni. IN
3. Diferencialno diagnostična okolja. Diferencialno diagnostični mediji se uporabljajo za razlikovanje ene vrste mikroorganizmov od druge na podlagi narave njihove encimske aktivnosti. Sestava teh gojišč je izbrana tako, da se jasno prepoznajo najbolj značilne lastnosti določene vrste mikroorganizma na podlagi značilnosti njegovega metabolizma.
Gojišča za ugotavljanje proteolitične in hemolitične sposobnosti mikrobov, ki vsebujejo beljakovinske snovi: kri, mleko, želatina itd. Najpogostejši mediji so mesna peptonska želatina (MPG), strjeni konjski serum, mleko in krvni agar (BA).
Mediji za preučevanje glikolitičnih lastnosti vključujejo tri glavne komponente: hranilno osnovo (bujon, agar), substrat (mono- in disaharidi, polihidrični alkoholi) in indikator za identifikacijo ustreznih encimov. Encimska razgradnja substratov povzroči premik pH in spremembo barve medija. Najpogostejši so barvni mediji, ki vsebujejo različne ogljikove hidrate (npr. bromotimol modro, indikator krvnega tlaka). Široko se uporabljajo tudi mediji Hiss, ki upoštevajo razlike v sposobnosti fermentacije različnih ogljikovih hidratov s tvorbo kisline ali kisline in plina.
Za razlikovanje enterobakterij se uporablja peptonska voda z naborom različnih ogljikovih hidratov, Andredejevim indikatorjem in plovci, ki olajšajo detekcijo nastajanja plinov in pomagajo vizualno določiti spremembo pH, značilno za različne mikroorganizme. Predvsem premik na kislo stran povzroči, da se medij z Andredejevim reagentom obarva rdeče ali rumeno pri uporabi medija z bromotimol modrim, medtem ko pri alkalizaciji Andredejev indikator in bromotimol modro ne spremenita barve medija. Na primer, za izolacijo patogenih bakterij iz črevesja se uporabljajo gojišča, ki omogočajo razlikovanje patogenih mikroorganizmov od stalnih prebivalcev črevesja - mikroorganizmov, ki razgrajujejo laktozo.
Tak medij je medij Endo. Glavne sestavine medija Endo so MPA, laktoza in bazični fuksin, razbarvan z natrijevim sulfitom. Začetni hranilni medij je obarvan svetlo rožnato. Pri fermentaciji laktoze nastane acetaldehid, ki reagira s sulfitom in ob sproščanju fuksin obarva kolonije svetlo rdeče. Zato E. coli, ki fermentira laktozo, pri rasti na tem gojišču tvori rdeče kolonije s kovinskim leskom, salmonele in šigele pa so brezbarvne, saj ne fermentirajo laktoze.
4. Mediji za shranjevanje, na katerih pride do hitre rasti določenih vrst mikroorganizmov.
5. Konzervativna (transportna) sredstva. Zasnovan za ohranjanje mikroorganizmov med prevozom na raziskovalno mesto. Ti mediji vsebujejo dodatke, ki preprečujejo razmnoževanje in smrt mikrobov, kar pomaga ohranjati njihovo sposobnost preživetja. Najpogosteje se uporabljajo mešanica glicerola (Teaguejev medij), mešanica fosfatnega pufra in gojišča Kari-Blair, Amies (z aktivnim ogljem in brez aktivnega oglja), Stewart in drugi.
Sterilizacija gojišč.
Vse hranilne gojišča, ne glede na njihov namen, vlijemo v čiste posode in steriliziramo. Večino medijev steriliziramo z avtoklavom, vendar pod različnimi pogoji, odvisno od njihove sestave.
1. Sintetična gojišča in vsa agar gojišča, ki ne vsebujejo nativnih beljakovin in ogljikovih hidratov, steriliziramo 15-20 minut v avtoklavu pri temperaturi 115-120°C in tlaku 1-1,5 atmosfere.
2. Mediji z ogljikovimi hidrati in mlekom (ki vključuje laktozo), hranilno želatino steriliziramo s tekočo paro pri temperaturi 100°C frakcijsko ali v avtoklavu pri 112°C in tlaku do 1 atmosfere.
3. Gojišča, ki vsebujejo beljakovinske snovi (krvni serum, ascitna tekočina), se dekontaminirajo s tindalizacijo ali filtracijo.
4. Za sterilizacijo gojišč, ki vsebujejo naravne proteine, se uporablja filtracija skozi membranske filtre Seitz.
Za nadzor sterilnosti gojišča po sterilizaciji ga postavite v termostat na 37°C za 3-5 dni. Tekoča gojišča morajo ostati bistra in na površini ali v debelini trdnih gojišč se ne smejo pojaviti znaki rasti. Poleg kontrole sterilnosti se izvaja kemijska kontrola pripravljenih gojišč, ki obsega določanje pH, količine skupnega in aminskega dušika ter kloridov v več vzorcih vsake serije.
Obstaja tudi biološki nadzor medijev. V tem primeru se več vzorcev gojišča inokulira z laboratorijsko kulturo mikroba, za katerega je medij pripravljen, in preučuje naravo njegove rasti. Šele ko so mediji prestali nadzor, se lahko uporabljajo za predvideni namen.
Razvrstitev kulturnih medijev:
Naravno– so sestavljeni iz proizvodov živalskega ali rastlinskega izvora in imajo nedoločeno kemično sestavo. Na primer: zelenjavni in sadni sokovi, živalska tkiva, kri, mleko, jajca itd. (IPA, MPB).
Polsintetika– sestava vključuje spojine znane kemijske narave in snovi neznane sestave. Na primer: MPB z glukozo, medij Endo, medij Sabouraud.
Sintetična– vsebujejo samo kemično čiste spojine v natančnih koncentracijah. Uporablja se v laboratorijskih poskusih. Na primer: okolje Chapek, Omelyansky, Ushinsky itd.
Namen kulturnih medijev
Univerzalni(splošen namen) - primeren za gojenje številnih vrst mikroorganizmov in se uporablja kot osnova za posebne hranilne medije. Primeri: MPB, MPA, Hottingerjev medij, GRM, tioglikolatni medij.
Poseben uporablja se v primerih, ko mikroorganizmi ne rastejo na preprostih gojiščih. Ti vključujejo kri, serumski agar, juho iz sirotke, ascitno juho, ascitni agar in druge.
1. Izbirna okolja- nekateri mikroorganizmi se na njih razvijajo hitreje in intenzivneje kot druge vrste bakterij. Na primer, 1% alkalna peptonska voda je selektivno gojišče za vibrije kolere, Rouxovo in Lefflerjevo gojišče za povzročitelje davice.
2. Selektivno - zahvaljujoč selektivnim dodatkom (žolč, barve, antibiotiki itd.) lahko zavirajo razvoj nekaterih vrst mikroorganizmov, ne vplivajo pa na druge vrste. Primeri: Müllerjevo gojišče je selektivno za tifusno-paratifusne bakterije, furazolidon-tween agar je selektiven za korinebakterije in mikrokoke. Dodatek antibiotikov v gojišča jih naredi selektivne za glive (npr. Sabouraudov medij itd.).
3. Diferencialna diagnostika- skupina medijev, ki omogočajo določanje biokemičnih lastnosti mikroorganizmov in njihovo razlikovanje. Delimo jih na gojišča za določanje proteolitičnih, peptolitičnih, saharolitičnih, hemolitičnih, lipolitičnih in redukcijskih lastnosti (mediji Endo, Levin, Ploskirev, Gissa).
4. Konzervans (transport) -
zasnovan tako, da ohranja sposobnost preživetja mikroorganizmov od trenutka zbiranja
biomaterial pred setvijo za diagnostiko
Tekočina(brozi) – preučevanje fizioloških in biokemičnih lastnosti ter kopičenje biomase mikroorganizmov
Poltekoče(1% agar) – shranjevanje kultur in gojenje anaerobov
Gosto(3-5% agar) – izolacija čistih kultur, akumulacija, kvantitativno beleženje, študij kulturnih lastnosti, antagonistični odnosi
V razsutem stanju– skladiščenje semena v industriji (proso, otrobi)
Suha– ki jih proizvaja industrija za pripravo hranilnih gojišč
Transportni sistem z okoljem Stuart
Stewartovo gojišče je poltrden, s hranili reven substrat za ohranjanje in transport širokega nabora patogenih mikroorganizmov, kot npr. Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Corynebacterium diphteriae, Trichomonas vaginalis, Streptococcus sp., Salmonella sp., Shigella sp. itd. Najzahtevnejši mikroorganizmi preživijo v tem okolju več kot en dan, drugi pa tudi več dni.
Prisotnost tioglikolata v mediju zavira encimsko aktivnost bakterij, odsotnost dušika pa preprečuje njihovo razmnoževanje.
Transportni sistem z okoljem Keri Blair
Transportni medij Keri Blair je modifikacija Stewartovega osnovnega transportnega medija, zasnovanega posebej za fekalne vzorce.
Glicerofosfat, ki je metabolit nekaterih enterobakterij ( Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, itd.), nadomestiti z anorganskim fosfatom,
Metilensko modro smo odstranili in pH medija povečali na 8,4.
Gojišče Keri Blair omogoča ohranitev večine patogenov, vključno z izbirčnimi mikroorganizmi, kot je npr. Neisseria sp., Haemophilus sp., Streptococcus sp..
Ta medij je standarden za transport anaerobov.
Transportni sistem z okoljem Ames
Amesov transportni medij je še ena modifikacija osnovnega Stewartovega transportnega medija, v katerem je glicerofosfat nadomeščen z anorganskim fosfatom, saj je glicerofosfat metabolit nekaterih enterobakterij ( Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae itd.) in lahko podpira rast nekaterih gram-negativnih mikroorganizmov.
Metilensko modro je nadomestilo aktivno oglje farmacevtske kakovosti.
Za vzdrževanje prepustnosti bakterijskih celic smo v gojišče dodali kalcij in magnezij.
To okolje je sposobno podpirati mikroorganizme, kot je npr Neisseria sp., Haemophilus sp., Corynebacteria, Streptococci, Enterobacteriaceae itd., vendar so najboljši rezultati doseženi z gojenjem v prvih 24 urah.
Univerzalna obogatitvena medija: mesni peptonski agar (MPA) in mesna peptonska juha (MPB)
So glavna gojišča za inokulacijo mikroorganizmov za preverjanje čistosti kultur pred biokemijo in serotipizacijo.
Uporabljajo se za gojenje in štetje nezahtevnih mikroorganizmov. V poltekoči obliki se gojišče lahko uporablja za shranjevanje kontrolnih (referenčnih) mikroorganizmov.
Univerzalna pomnilniška okolja Hottingerjevo okolje
Zasnovan za gojenje različnih mikroorganizmov, kot so enterobakterije, Pseudomonas aeruginosa, stafilokoki in nekatere vrste streptokokov. Po potrebi ga lahko obogatimo z ogljikovimi hidrati in solmi.
Vsebuje Hottingerjev hidrolizat, ki je pridobljen z encimsko hidrolizo mletega mesa (govedina) s pankreatinom, ki mu sledi filtracija in dodajanje kloroforma kot konzervansa.
Univerzalna pomnilniška okolja:Mueller-Hinton okolje
Ta medij se uporablja za gojenje Neisseria sp. in ugotavljanje občutljivosti mikroorganizmov na protimikrobna sredstva.
Sreda McConkey
Gojišča MacConkey se priporočajo kot diferencialna gojišča za selektivno izolacijo enterobakterij in sorodnih gramnegativnih bacilov.
Laktozo pozitivni sevi rastejo z rožnatimi ali rdečimi kolonijami, ki so lahko obdane z območjem obarjanja žolčne soli.
Rdeča barva se pojavi kot posledica zakisanja medija s produkti razgradnje laktoze (ko pH pade pod 6,8) in adsorpcije nevtralnega rdečega.
Sevi, ki ne fermentirajo laktoze (Shigella, Salmonella), običajno tvorijo prozorne brezbarvne kolonije in ne spreminjajo okolja.
Diferencialno diagnostična okolja:Endo okolje
Ta medij je razvil Endo kot gojišče za razlikovanje mikroorganizmov, ki fermentirajo laktozo, in mikroorganizmov, ki ne fermentirajo. Uporablja se za mikrobiološke preiskave vode, odpadne vode, mlečnih in drugih živilskih izdelkov.
Natrijev sulfit in bazični fuksin delujeta zaviralno na gram-pozitivne mikroorganizme. Laktozo mikroorganizmi razgradijo na aldehid in kislino. Aldehid pa sprošča fuksin iz kompleksa fuksin-sulfita, kar poveča rdečo barvo kolonij. Pri E. coli je ta reakcija zelo izrazita in jo spremlja kristalizacija fuksina, ki se kaže z zelenkastim kovinskim sijajem (muchsin gloss) kolonij.
Diferencialno diagnostična okolja:Rumenjak solni agar
To gojišče se uporablja kot selektivno gojišče za izolacijo klinično pomembnih kultur stafilokokov.
Manitol je substrat, ki ga je mogoče fermentirati in diferencirati, ter vir ogljika.
Dodatek (do 5% v/v) emulzije jajčnega rumenjaka omogoča določanje lipazne aktivnosti mikroorganizmov. Emulzija v slanem okolju postane prozorna, zato se ob prisotnosti aktivnosti lipaze okoli kolonij oblikuje rumeno neprozorno območje.
Diferencialno diagnostična okolja:Wilson-Blairov ali bizmutov sulfitni agar
Selektivno gojišče za izolacijo salmonele.
Peptična prebavila živalskega tkiva in mesni izvleček služita kot vir dušikovih hranil, ogljika, žvepla, vitaminov B in elementov v sledovih, potrebnih za rast teh bakterij.
Briljantno zelena zavira rast vseh gram-pozitivnih bakterij. Glukoza je ogljikov hidrat, ki ga je mogoče fermentirati. Železov sulfat lahko zazna proizvodnjo vodikovega sulfida.
Bizmut je težka kovina, ki zavira rast večine gramnegativnih črevesnih bakterij, razen salmonele.
Salmonele reducirajo železov sulfat v prisotnosti glukoze in bizmutovega sulfita v železov sulfid, ki njihove kolonije obarva črno.
Posebna izbirna okolja:Loefflerjevo okolje
Za gojenje se uporablja ta medij z dodatkom konjskega seruma Corynebacterium diphtheriae iz kliničnega materiala in subkultur čistih kultur teh mikroorganizmov.
Visoka serumska koncentracija pomaga določiti proteolitično aktivnost mikroorganizmov, pa tudi tvorbo pigmenta. Pepton in mesni ekstrakt zagotavljata mikroorganizmom osnovna hranila. Glukoza je fermentacijski substrat in vir energije.
Posebni selektivni mediji:Kampilobakagar
Selektivno gojišče za Campylobacter, ki je bilo sestavljeno iz baze krvnega agarja z ovčjo ali konjsko krvjo in antibiotiki.
Protimikrobne komponente znatno zavirajo rast normalne mikroflore, spodbujajo rast in izločanje iz blata Campylobacter fetus ssp. jejuni.
Prisotnost amfotericina B v dodatku bistveno ali popolnoma zavira rast glivic, kasneje uveden cefalotin pa krepi zatiranje normalne črevesne mikroflore.
Kolonije Campylobacter fetus ssp. jejuni so sluzaste narave, plosko sivi z nepravilnimi obrisi ali dvignjeni, okrogli, brez hemolize.
Nekateri sevi lahko proizvajajo rumeno-rjave ali rožnate kolonije.
Na vlažni površini gojišča lahko pride do sotočne rasti ali rojenja.
Hranilni mediji so substrati, ki se uporabljajo v laboratorijski praksi za gojenje mikroorganizmov in drugih bioloških objektov. Rast mikroorganizmov je odvisna od prisotnosti v hranilnem mediju zadostne količine organskih in anorganskih snovi v obliki različnih soli, vitaminov itd. Hranilni medij mora imeti tudi optimalne fizikalne in kemijske lastnosti: pH, viskoznost, vlažnost, osmotsko lastnosti.
Najpogosteje se kot organska sestavina hranilnih medijev uporabljajo produkti delne razgradnje beljakovin - peptoni ali različne mesne infuzije in ekstrakti. Te komponente se uporabljajo pri izdelavi mnogih tako imenovanih konvencionalnih hranilnih gojišč, ki se najpogosteje uporabljajo za gojenje mikrobnih kultur, predstavljajo pa tudi osnovo kompleksnejših hranilnih gojišč. Običajna gojišča vključujejo mesno peptonsko juho in Hottingerjevo juho. Odvisno od vrste mikroorganizma, ki ga gojimo, gojišča za splošno gojenje vsebujejo dodatke različnih bakterijskih rastnih faktorjev. V nekaterih primerih so to lahko čisti vitamini in aminokisline, v drugih - izvlečki različnih naravnih substratov. Na primer, dodatki za razgradnjo jetrnega tkiva se uporabljajo za gojenje patogenov, povzročitelj oslovskega kašlja pa se goji na gojiščih, ki vsebujejo kri.
Posebna hranilna gojišča vključujejo gojišča, ki se uporabljajo, kadar je treba v proučevanem materialu selektivno identificirati katero koli vrsto mikroorganizma ali njegove posamezne biokemične ali fiziološke lastnosti. Posebni hranilni mediji vključujejo naslednje.
1. Izbirna ali selektivna in obogatitvena okolja. V takšnih okoljih se ustvarijo ugodni pogoji za razvoj katere koli vrste mikroorganizmov, medtem ko so vse druge vrste mikrobov zavirane. Za to se mediju dodajo bodisi hranila, ki jih lahko uporablja samo proučevani mikrob, bodisi različni inhibitorni dejavniki, na katere je ta mikrob neobčutljiv. Ta vrsta gojišča se uporablja za izolacijo in določanje narave mikroorganizmov, prisotnih v materialu, ki ga proučujemo, v zelo majhnih količinah v primerjavi z drugimi oblikami. Primeri selektivnih gojišč so gojišča, ki vsebujejo žolč ali žolčne soli in briljantno zeleno, pa tudi gojišča, ki vsebujejo selenit, ki se uporabljajo za izolacijo patogenih črevesnih bakterij. Ti mediji zavirajo E. coli. Za primarne kulture povzročiteljev davice se uporablja koaguliran konjski serum, na katerem vse druge vrste mikrobov rastejo veliko počasneje.
2. Diferencialno diagnostična okolja. Ta gojišča se uporabljajo za identifikacijo bakterijskih kultur. Uporaba diferencialno diagnostičnih hranilnih gojišč temelji na dejstvu, da ob rasti bakterij na njih pride do kemičnih sprememb v sestavinah gojišča, ki jih je mogoče zlahka opaziti. Kot variabilna komponenta diferencialno diagnostičnih hranilnih medijev se najpogosteje uporabljajo različne beljakovinske snovi, sladkorji in poliatomske snovi, zaradi razgradnje katerih z mikrobi se reakcija medija spremeni, kar se upošteva s spremembo barve. indikatorjev, dodanih gojišču, pojav plinskih mehurčkov itd. Primeri široko uporabljenih diferencialno diagnostičnih hranilnih gojišč so lahko gojišča tako imenovane pestre serije, ki se uporabljajo za ugotavljanje sposobnosti mikrobov za fermentacijo različnih sladkorjev (Hissov medij, itd.). Glejte tudi Diferencialna diagnostična okolja.
Hranilni mediji so osnova bakterioloških raziskav. Služijo za izolacijo čistih kultur mikrobov iz preučevanega materiala in za preučevanje njihovih lastnosti. Hranilni medij ustvarja optimalne pogoje za razmnoževanje mikroorganizmov. Gojišča morajo vsebovati snovi, potrebne za gradnjo vseh sestavin citoplazme, tj. vsi viri rasti živega organizma. Sem spadajo predvsem viri dušika, ogljika, vodika in kisika.
Vir vodika in kisika v hranilnih medijih je voda. Vir dušika so organske spojine, ki jih pridobivamo iz mesa, rib, placente, mleka, jajc in krvi. Zaradi hidrolize s pankreatinom ali tripsinom ti produkti proizvajajo ti. hidrolizati, ki vsebujejo veliko količino aminokislin in peptonov, ki jih večina mikroorganizmov dobro absorbira. Nativne beljakovine prebavljajo samo nekateri mikroorganizmi, ki imajo eksoproteaze. Hidrolizati so osnova za pripravo gojišč za številne mikroorganizme.
Vir ogljika za patogene mikrobe so predvsem različni ogljikovi hidrati: mono- in disaharidi, polihidrični alkoholi, organske kisline in njihove soli.
Poleg organogenov bakterije potrebujejo anorganske spojine, ki vsebujejo fosfor, kalij, žveplo, natrij, magnezij, železo, pa tudi mikroelemente: kobalt, jod, mangan, bor, cink, molibden, baker itd.
Potrebe mikroorganizmov po anorganskih spojinah se zadovoljijo z dodajanjem soli KH2PO4 K2HPO4 in drugih v hranilni medij, ki so potrebni v zanemarljivih količinah kot katalizatorji kemičnih procesov in vstopajo v hranilni medij s peptonom, anorganskimi solmi in vodo. Poleg naštetih organskih elementov številni mikroorganizmi potrebujejo rastne dejavnike, tj. v snoveh, ki jih sami ne morejo sintetizirati. Rastne faktorje je treba hranilnim medijem dodati v pripravljeni obliki. Rastni dejavniki vključujejo različne vitamine, katerih vir v hranilnih medijih so izdelki rastlinskega in živalskega izvora, dodani hranilnemu mediju, ki vsebujejo nikotinsko, pantotensko, parabenzojsko kislino, vitamine A, B, C itd.
Hranila lahko mikrobi absorbirajo le pod določeno reakcijo okolja, ker prepustnost celičnih membran mikrobov se spreminja glede na pH okolja.
Zahteve za hranilne medije.
1. Gojišča morajo vsebovati hranila, potrebna za hranjenje mikrobov.
2. Imejte pH reakcijo, ki je optimalna za vrsto mikroba, ki ga gojite. -
3. Hranilni mediji morajo imeti zadostno vlago in viskoznost, ker mikrobi se hranijo po zakonih difuzije in osmoze.
4. Bodi izotonična in ima določen redoks potencial (rH2).
5. Gojišča morajo biti sterilna, s čimer je zagotovljena možnost gojenja čistih kultur.
Potreba po hranilih in fizični pogoji za različne vrste mikrobov niso enaki, kar izključuje možnost ustvarjanja univerzalnega hranilnega medija.
Glede na konsistenco ločimo trdne in tekoče hranilne gojišča. Goste pripravimo na osnovi tekočih, tako da jim dodamo lepila: agar-agar ali želatino! Agar-agar (žele v malajščini) je proizvod rastlinskega izvora, pridobljen iz morskih alg. Agar-agar se raztopi v vodi pri temperaturi 80-86°C, strdi se pri 36-40, zato se uporablja za stiskanje hranilnih gojišč za gojenje različnih skupin mikroorganizmov pri njihovi optimalni temperaturi.
Hranilni mediji so razvrščeni glede na njihovo sestavo in namen.
1. Glede na sestavo hranilne medije delimo na preproste in kompleksne
Obstaja skupina okolij splošnega namena - preprosta. Ta skupina vključuje mesno-peptonsko juho (preprosta hranilna juha), mesno-peptonski agar (preprosta hranilna agar), hranljivo želatino. Ti mediji se uporabljajo za gojenje številnih patogenih mikrobov. Gojišča za splošno uporabo ali preprosta hranilna gojišča so običajno pripravljena iz hidrolizatov z dodatkom peptona in natrijevega klorida. Uporabljajo se tudi kot osnova za pripravo kompleksnih medijev.
2. V drugo skupino spadajo elektivna, specialna in diferencialno diagnostična okolja.
Izbirna okolja (selektivna, selektivna, kopičenje, obogatitev). Načelo izdelave selektivnih hranilnih gojišč temelji na zadovoljevanju osnovnih biokemičnih in energijskih potreb tiste vrste mikrobov, ki so ji namenjene za gojenje, oziroma na dodajanju inhibitorjev, ki zavirajo rast spremljajoče mikroflore. Določena sestava in koncentracija hranil, mikroelementov, rastnih faktorjev pri strogo določeni vrednosti pH ali dodatek inhibitorjev zagotavlja optimalne pogoje za gojenje ene ali več vrst mikroorganizmov. Pri setvi materiala, ki vsebuje mešanico različnih mikrobov, bo najprej ovenela rast tiste vrste, za katero bo okolje selektivno. Primeri izbirnih gojišč so rumenjakova juha, selenitna juha, Ploskirevov medij - za gojenje mikrobov črevesne družine, alkalna peptonska voda - za Vibrio cholerae.
Rumenjakova juha. MPB dodamo 10-20 % volovske žolče. Žolč zavira rast kokov in zračne flore, vendar je ugoden za širjenje salmonele.
Selenitna juha. Sestavljen je iz fosfatne brozge z dodatkom natrijeve soli selenita, ki je zaviralec rasti kokalne flore in Escherichie coli, ne zavira pa rasti salmonele.
Sreda Ploskireva. Gosto gojišče, ki vsebuje zaviralce E. coli, coli, vendar ugodno za rast šigel in salmonel, katerih razmnoževanje ne zavira briljantno zeleno in žolčne soli.
Peptonska voda. Vsebuje 1% peptona in 0,5% natrijevega klorida. Okolje je selektivno za klorove vibrije, ker se v »lačnih okoljih«, zlasti z alkalno reakcijo, razmnožujejo bolje kot druge bakterije, ker same izločajo kisle odpadne produkte.
Posebna okolja. Potreben za gojenje bakterij, ki ne rastejo na preprostih hranilnih medijih. Za nekatere organizme je treba enostavnim hranilnim medijem dodati ogljikove hidrate, kri in druga dodatna hranila. Primeri preprostih hranilnih gojišč so sladkorna juha in sladkorni agar za streptokoke (pripravljena iz MPB oziroma MPA, ki jima je dodano 0,5-2 % glukoze).
Za pnevmokoke in meningokoke je posebno gojišče sirotkin bujon in sirotkin agar (za pripravo sirotkinega bujona 1 del MPB zmešamo z 2 deloma svežega seruma; za pridobitev sirotkinega agarja dodamo 10-25 % sterilnega konjskega ali govejega seruma v staljeno raztopino. MPA).
Diferencialno diagnostični mediji se uporabljajo za določanje vrste proučevanega mikroba na podlagi značilnosti njegovega metabolizma. Glede na njihov namen so diferencialno diagnostična okolja razdeljena na naslednji način:
1. Gojišča za ugotavljanje proteolitske sposobnosti mikrobov, ki vsebujejo mleko, želatino, kri itd.
2. Mediji z ogljikovimi hidrati in polihidričnimi alkoholi za
odkrivanje različnih saharolitičnih encimov.
Sestavi diferencialno diagnostičnih medijev, namenjenih prepoznavanju saharolitičnih lastnosti in redoks encimov, so dodani indikatorji: nevtralno rdeča, kisli fuksin, bromotimol modra, vodna modra z rožnato kislino (BP). Indikator s spreminjanjem barve pri različnih pH vrednostih kaže na prisotnost encima in razgradnjo sestavine, vnesene v medij.
Primeri diferencialno diagnostičnih okolij:
Endo okolje. Sestavljen je iz MPA z dodatkom 1% laktoze in bazičnega fuksina (indikator), razbarvanega z natrijevim sulfitom. Endo medij je rahlo rožnate barve. Uporablja se pri diagnozi črevesnih okužb za razlikovanje bakterij, ki razgrajujejo laktozo in tvorijo kisle produkte, od bakterij, ki te sposobnosti nimajo. Kolonije laktozo pozitivnih mikrobov (Escherichia coli) so rdeče zaradi redukcije fuksina. Kolonije laktoza-negativnih mikroorganizmov - salmonele, šigele itd. - so brezbarvne.
Diferencialno diagnostična okolja vključujejo kratko in razširjeno pestro serijo. Sestavljen je iz medijev z ogljikovimi hidrati (Hiss media), MPB, mleka in mesno-peptonske želatine.
Hiss gojišča so pripravljena na osnovi peptonske vode, ki so ji dodani kemično čisti mono-, di- ali polisaharidi (glukoza, laktoza, škrob itd.).
Za zaznavanje premikov pH zaradi tvorbe kislin in razgradnje ogljikovih hidratov je mediju dodan indikator. Pri globlji razgradnji ogljikovih hidratov nastanejo plinasti produkti (CO2, CH4 itd.), Ki jih zajamemo s plovci - majhnimi epruvetami, spuščenimi na glavo v medij. Gojišča z ogljikovimi hidrati lahko pripravimo tudi kot gosta gojišča z dodatkom 0,5-1 % agar-agarja. Nato se tvorba plina zazna s tvorbo mehurčkov (prelomov) v stolpcu medija.
Na MPB, ki je del pestre serije, najdemo produkte, ki nastanejo pri razpadu aminokislin in peptonov (indol, vodikov sulfid). Vodikov sulfid zaznamo tako, da po setvi kulture v MPB položimo trak filtrirnega papirja, namočen v raztopino svinčevega acetata. Pri razgradnji aminokislin, ki vsebujejo žveplo, se sprosti vodikov sulfid, zaradi tvorbe svinčevega sulfida pa papir počrni. Za določanje indola je mogoče uporabiti kompleksen indikator. Indol nastane z razpadom triptofana in ga je mogoče zaznati, ko ta indikator dodamo kulturi, gojeni na MPB. V prisotnosti indola se MPB obarva zeleno ali modro.
Suha okolja.
Hranilni agar, kot tudi glavni diferencialno diagnostični mediji, se trenutno proizvajajo v obliki suhih pripravkov, ki vsebujejo vse potrebne sestavine. Takim praškom morate samo dodati vodo in jih zavreti, nato pa jih po vlivanju sterilizirati.
