Çalışmaya giriş
Sorunun alaka düzeyi. Veba, bulaşıcı bir patojen bulaşma mekanizmasına sahip, zoonotik, doğal bir odak noktasıdır, özellikle tehlikeli karantina bakteriyel bulaşıcı hastalıktır [Cherkassky, 1996]. Veba, bazıları Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerde bulunan çok sayıda doğal veba odağının varlığı nedeniyle nüfus için gerçek bir tehdit oluşturmaktadır [Onshtsenko ve diğerleri, 2004]. Veba patojeninin, bu hastalıktan etkilenmeyen komşu ülkelerden ve ayrıca biyoterörist eylemlerin bir sonucu olarak Rusya'ya girme olasılığı yüksek. Dünya Sağlık Örgütü'ne göre, dünya çapında her yıl 2.000'den fazla veba vakası kaydediliyor ve bunların çoğu ölümcül. 2009 yılında Çin'in Hainan Tibet Özerk Bölgesi'nde büyük bir pnömonik veba salgını meydana geldi ve bu salgın aynı zamanda çok sayıda ölümün de habercisi oldu. Tüm bu gerçekler, veba patojenini teşhis etmek için modern teknolojilere dayanan yeni, son derece etkili yöntemlerin ve neden olduğu özellikle tehlikeli hastalığın önlenmesi ve tedavisine yönelik araçların acilen geliştirilmesini gerektirmektedir.
Şu ana kadar kullanılan sınıflandırmalar Yersinia pestis yalnızca morfolojik, kültürel, biyokimyasal ve diğer fenotipik özellikler dikkate alınmıştır [Bezsonova, 1928; Borzenkov, 1938; Tumansky, 1957; Timofeeva, 1968; Kutyrev, Protsenko, 1998; Devignat, 1951] ve bu özelliklerin değişkenliğiyle ilgili dezavantajlar da vardı. Bununla birlikte, temel genetik ve moleküler mikrobiyolojideki son gelişmeler, vebaya neden olan ajanın sistematik hale getirilmesi sorunlarının çözümünün, moleküler genetik özelliklerinin kullanımına dayalı olarak niteliksel olarak yeni bir düzeye taşınmasını mümkün kılmaktadır.
Şu anda kabul edilen yerli sınıflandırmaya göre, veba patojeninin türleri ana ve 4 küçük (Kafkas, Altay, Gissar ve Ulegey) alt türe ayrılmıştır [Timofeeva, 1985; Kutyrev, Protsenko, 1998]. Yaygın yabancı sınıflandırmaya göre suşlar Y. pestis Bir dizi biyokimyasal özellikteki farklılıklara (gliserolü fermente etme, nitratları azaltma, amonyağı oksitleme yeteneği) ve tarihsel ve coğrafi temelde üç biyovara ayrılırlar: antiqua (antik), ortaçağ (ortaçağ) ve orientalis (doğu). ). Fenotipik özelliklere göre, ana alt türün türleri, yabancı sınıflandırmada kabul edilen üç biyovara (antik, ortaçağ ve doğu) karşılık gelir. Ancak suşlar Y. pes-
4 bu Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerde vebanın doğal odaklarında dolaşan hastalıklar, belirli biyovarlara ait olmalarına göre sistematize edilmemiştir.
Diferansiyel olarak önemli biyokimyasal özelliklerin ifadesine göre, en aktif olanlar eski biyovarın suşlarıdır. Bunlar, gliserolü fermente eder ve ortaçağ biyovarının denitrifikasyon aktivitesine sahiptir. ". pestis nitratları azaltamazlar, ancak gliserol ve arabinozu fermente edebilirler; Doğu biyovarının türleri gliserolü fermente etmez, ancak aktif olarak nitratları azaltır ve arabinozu kullanır.
Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerde dolaşan ana alt türlerin türleri, kural olarak oldukça öldürücüdür ve yüksek salgın önemine sahiptir. Ramnoz ve melibiyozu fermente etmezler, PESTICE I'e duyarlı değildirler ve yüksek düzeyde izositralaz üretimine sahiptirler. Küçük alt türlerin suşları ramnoz ve melibiyozu fermente eder, pestisin I'e duyarlıdır, izositrat-liyaz aktivitesi sergilemez, laboratuvar hayvanları için seçici olarak öldürücüdür ve çok az salgın önemi vardır.
Bölmede kullanılan biyokimyasal özelliklerin ve suşların farklı ifadelerinin genetik nedenleri Y. pestis Biyovarlara ve alt türlere yönelik çalışmalar bugüne kadar yeterince araştırılmamıştır. Güvenilir bir şekilde tespit edilen tek şey, doğu biyovarının suşlarında gliserol fermantasyonu eksikliğinin nedeninin, gliserol-3-fosfat dehidrojenaz genindeki bir mutasyon olduğudur. (glpD). Bu gende doğu biyovarının tüm suşlarının 93 bp'lik bir silinmeye sahip olduğu gösterilmiştir. . Literatürde gen yapısındaki farklılıkların belirlenmesine yönelik çok az çalışma bulunmaktadır. Y. pestis Nitratların azaltılmasından ve ramnozun fermantasyonundan sorumlu olan ana ve küçük alt türler [Kukleva ve diğerleri, 200 2009; Anisimov ve diğerleri, 2004; Zhou ve diğerleri, 2004].
Veba suşlarının beslenme ihtiyaçları açısından heterojenliğinin nedenleri hala bilinmiyor. Çeşitli doğal veba odaklarından gelen suşlar, suşların farklılaşması için genetik şemada kullanılabilen, ara metabolizma genlerindeki bozukluklarla belirlenen beslenme ihtiyaçlarında farklılık gösterir. Y. pestisçeşitli doğal veba odaklarından.
Mikrobiyolojik ve biyokimyasal özelliklerin farklı ifadelerinin altında yatan genlerin yapısındaki değişikliklerin tanımlanması, veba patojeninin türlerini sınıflandırmak için bir genetik şema oluşturmak ve ayrıca tür içi evrimin ana yönlerini belirlemek için güvenilir bilgi olarak hizmet edecektir. Y. pestis.
5 İşin amacı. Veba patojeni suşlarını alt türlere ve biyovarlara bölmek için kullanılan biyokimyasal özelliklerin farklı ekspresyonunun genetik temelinin belirlenmesi.
Araştırma hedefleri:
Çalışmada kullanılan suşları karakterize edin Y. pestis, alt türlere ve biyovarlara bölünmenin temelini oluşturan biyokimyasal özelliklere (nitratların azaltılması, izositrat liyaz üretimi, arabinoz ve melibiyozun fermantasyonu) göre Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerdeki doğal veba odaklarında izole edilmiştir. Rusya'da ve komşu ülkelerde dolaşan suşların belirli biyovarlara ait olup olmadığını belirlemek.
Nitrat indirgemesi ve arabinoz fermantasyonu gibi biyovarlara bölünmede kullanılan diferansiyel özellikleri kodlayan genlerin yapısal ve fonksiyonel organizasyonunu incelemek.
Genlerdeki değişiklikleri tanımlayın Y. pestis, veba patojeninin ana ve küçük alt türlerinin farklılaşmasının altında yatan melibiyozun fermantasyonunu ve izositrat liyaz üretimini belirlemek.
Suşların beslenme ihtiyaçlarını belirleyin Y. pestis Kafkas alt türleri ve onların oksotrofilerinin genetik temelini oluşturur.
Suşların intraspesifik sınıflandırması için bir genetik şema oluşturmak amacıyla elde edilen sonuçları kullanma olasılığını değerlendirin Y. pestis ve bu patojenin tür içi evriminin ana yönlerinin belirlenmesi.
Çalışmanın bilimsel yeniliği. Karmaşık mikrobiyolojik, biyokimyasal ve genetik analizlerden elde edilen verilere dayanarak, Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerin doğal odaklarında dolaşan veba patojeni türlerinin eski ve ortaçağ biyovarlarına ait olduğu tespit edildi.
Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerde dolaşan ana alt türlerin bazı suşlarında nitrat azaltıcı aktivite eksikliğinin nedeninin, 613. pozisyonda tek bir nükleotid ikamesi G -»T'nin varlığı olduğu ilk kez gösterildi. periplazmik nitrat redüktaz geni - çift, bu da bu suşların bir ortaçağ biyovarına ait olduğunu kanıtlıyor. Altay ve Gissar alt türlerinin suşlarında bu özelliğin ifadesinin bulunmaması, başka bir genin 302. pozisyonuna bir timus nükleotidinin (+T) eklenmesinden kaynaklanır - ssuA, bu da okuma çerçevesinde bir kaymaya ve aynı zamanda nitratların azaltılmasında rol oynayan kodlanmış taşıma proteini SsuA'nın yapısının bozulmasına yol açar.
Suşlarda arabinoz fermantasyonunun bulunmadığı ilk kez tespit edilmiştir.] pestis Altay ve Hissar alt türleri, arabinoz operonunun düzenleyici geninde bir mutasyonun varlığıyla ilişkilidir - evetS, genin başlangıcından itibaren 773. pozisyona bir guanin nükleotidinin (+G) eklenmesini içerir, bu da arabinoz operonunun genlerinin transkripsiyonunu başlatmak için gerekli olan düzenleyici protein AgaC'nin yapısının bozulmasına ve çerçeve kaymasına yol açar. .
İlk defa, ana ve küçük alt türlerin veba patojeni suşlarında farklı izositr-liyaz üretiminin genetik temeli, düzenleyici gende iki nükleotidin (+CC) eklenmesinin varlığıyla ilişkilendirildi. ICIR 26. pozisyonda! 270, kendisi tarafından kodlanan asetat operon baskılayıcı protein IclR'nin etkisizleştirilmesine yol açar ve ana alt türlerin suşlarında izositr liyaz enziminin yapısal sentezinin nedenidir. Küçük alt türlerin suşları bir shtact geni içerir ICIR ve izositrat liazın yapısal sentezini gerçekleştiremezler.
Suşlarda melibiyoz fermantasyonunun bulunmadığı gösterilmiştir. Y. pestis ana alt tip, bir ekleme dizisinin eklenmesinden kaynaklanmaktadır IS285 gen MelB, Galaktoz permeaz enzimini kodlayan Majör olmayan alt türlerin suşlarında, gene IS2&5 eklenmesi MelB mevcut olmayan.
İlk defa, Kafkas alt türlerinin oksotrofisinin genetik temeli İle ekleme dizilerinin uygulanması IS100 genler argA Ve aroF, 10 bp ekleyin. genin içine aroG, timin nükleotid geninin eklenmesi buHv. 13 bp silme gende bu.
Suşların elde edilen moleküler özellikleri Y. pestis Alt türlere ve biyovarlara bölünmenin altında yatan biyokimyasal özellikleri kodlayan genlere dayanan ana ve yeni alt türler, veba patojeninin intraspesifik sınıflandırması için genetik bir şemanın geliştirilmesinin temelini oluşturur.
Çalışmanın sonuçlarına göre “Veba patojen suşlarının alt türlerinin dizileme yöntemiyle belirlenmesine yönelik yöntem” buluşu için başvurular yapıldı (No. 2009116913. Rüçhan tarihi 14 Mayıs 2009. Patent verilmesine karar verildi ve “ Suşların alt tür farklılaşmasına yönelik yöntem Yersinia pestisçok katmanlı dizi tipleme yöntemiyle (No. 2009146094. Öncelik: 11.12.2009).
İşin pratik önemi.Çalışmanın sonuçlarına dayanarak, “Gen dizilimine dayalı olarak veba patojen suşlarının alt türlerinin belirlenmesi” metodolojik önerileri hazırlanmış ve onaylanmıştır. rhaS Ve evetS, ramnoz ve arabinoz fermantasyonunun kontrol edilmesi" (RosNIHR "Mikrop" direktörü tarafından onaylanmıştır. 16 Haziran 2009 tarihli 6 No'lu Protokol) ve "Alt türlerin belirlenmesi;
7 gerinim özelliği Yersinia pestisçok odaklı dizi tipleme yöntemiyle (RosNIPCI “Mikrobe” direktörü tarafından onaylanmıştır. 23 Şubat 2010 tarihli Protokol No. 1).
Patojenik Bakterilerin Devlet Koleksiyonunda üç tür biriktirilmiştir: Y. pestis Bu alt türlerin referans türleri olarak Altay'ın KM 910'u, Gissar'ın KM 596'sı ve Ulega alt türünün KM 1861'i.
Çalışma sırasında elde edilen suşların genetik organizasyonuna ilişkin veriler Y. pestis RosNIPCI “Mikrop”taki uzmanlık ve ileri eğitim kurslarında “Vebaya Neden Olan Ajanın Genetiği” konulu dersler verilirken kullanılır.
Savunma hükümleri:
Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerin doğal odaklarında dolaşan ana alt türlerin veba etken maddesinin suşları, bu suşların mikrobiyolojik, biyokimyasal ve genetik özelliklerinin kapsamlı bir analizinden elde edilen verilerle kanıtlandığı gibi, eski ve ortaçağ biyovarlarına aittir.
Suşları bölerken kullanılan biyokimyasal özelliklerin farklı tezahürlerinin temeli Y. pestis alt türler ve biyovarlar, bu özellikleri kodlayan genlerde farklı tipte mutasyonlar içerir. Ortaçağ biyovarının ana alt türlerinin suşlarındaki nitratları azaltma yeteneğinin olmaması, gende anlamsız bir mutasyonun (G - T) varlığıyla ilişkilidir. çift periplazmik nitrat redüktaz ve Altay ve Gissar alt türlerinin suşlarında - gene tek bir nükleotidin eklenmesiyle ssuA periplazmik taşıma proteini SsuA. Altay ve Gissar alt türlerinin suşlarında arabinoz fermantasyonunun bulunmaması, gen dizisine bir guanin nükleotidinin eklenmesinden kaynaklanmaktadır. evet S.
Veba patojeninin ana ve küçük alt türlerinin suşlarının bir takım farklı özelliklere göre farklı biyokimyasal aktiviteleri, onları ana alt türlerde kodlayan genlerin azalmasından ve küçük alt türlerdeki sağlamlıklarından kaynaklanır. Ana alt türlerin suşları tarafından melibiyoz fermantasyonunun bulunmaması, gene girişten kaynaklanmaktadır. MelB galaktoz permeaz ve bu alt türün suşlarında izositrat liazın yapısal sentezi, düzenleyici gen dizisine iki nükleotidin (CC) eklenmesinden kaynaklanmaktadır. iclR. Küçük alt türlerin suşları sağlam genler içerir MelB Ve iclR.
Suşların çoklu beslenme gereksinimlerinin nedeni Y. pestis Kafkas alt türleri, amino asitlerin ve vitaminlerin biyosentezi için bir dizi genin etkisizleştirilmesidir. Bu alt türün suşlarının arginine bağımlılığı, IS70O'nun gene yerleştirilmesinden kaynaklanır. argA, fenilalanin için - 10 bp ekleyin. genin içine aroG, tirozin için - ekleme IS100 genin içine aroF, tiamin için (gendeki 13 bp'nin silinmesiyle BO - bu ve tek bir ekleme
8. nükleotid MN. Kafkas ve diğer alt türlerin suşları için tanımlanmış mutasyonların tüm kompleksinin yanı sıra veba patojeninin biyovarlarına dayanarak, intraspesifik sınıflandırma için genetik bir şema oluşturmak için kullanılabilecek karakteristik genotipler belirlendi. Y. pestis.
İşin onaylanması. Tez materyalleri, BDT Üye Devletlerinin IX Eyaletlerarası Bilimsel ve Pratik Konferansında sunuldu ve tartışıldı “Bağımsız Devletler Topluluğu üye devletlerinin topraklarında bulaşıcı hastalıklarla mücadeleye yönelik küresel stratejinin uygulanmasında modern teknolojiler”, Volgograd 2008; VI Uluslararası Konferansı “Moleküler Diagnostik ve Biyogüvenlik”, M., 2009; Federal Tüketici Haklarının Korunması ve İnsan Refahının Denetlenmesi Servisi'nin genç bilim adamları ve uzmanlarından oluşan konferansın bilimsel ve pratik okulu “Biyolojik güvenliği sağlamak için modern teknolojiler”, 25 - 27 Mayıs 2010; RosNIPCI “Microbe”un yıllık final konferanslarında, Saratov 2008 - 2010.
Tez
Odinokov, Georgy Nikolayeviç
Akademik derece:
Biyolojik Bilimler Adayı
Tez savunmasının yapılacağı yer:
HAC özel kodu:
03.02.03, 03.02.07
Uzmanlık:
Mikrobiyoloji
Sayfa sayısı:
GİRİİŞ
BÖLÜM 1. LİTERATÜR TARAMA
1.1. 15. veba patojeninin genomunun organizasyonu hakkında modern fikirler
1.2. Yersinia pestis için tür içi sınıflandırma şemaları 28 KENDİ ARAŞTIRMASI
BÖLÜM 2. MATERYAL VE YÖNTEM
2.1. Çalışmada kullanılan bakteri türleri ve yetiştirme koşulları 36
2.2. Y. pestis suşlarında denitrifikasyon aktivitesinin, 46 gliserol, arabinoz, ramnoz, melibiyoz, izositralaz üretiminin fermentasyonunun incelenmesine yönelik yöntemler
2.3. Y. pestis suşlarının besin gereksinimlerinin belirlenmesi
2.4. Bakteriyel DNA izolasyonu
2.5. Polimeraz zincir reaksiyonunun gerçekleştirilmesi
2.6. Sonuçların elektroforetik kaydı
2.7. Genlerin nükleotid dizilerinin belirlenmesi
2.8. Filogenetik analizin yapılması
BÖLÜM 3. ÇEŞİTLİ DOĞAL ÜRÜNLERDEN KAYNAKLANAN BİRİNCİL VE ANA OLMAYAN SUŞLARIN Y. pestis SUŞLARININ MİKROBİYOLOJİK VE BİYOKİMYASAL ÖZELLİKLERİNİN ANALİZİ
VEBA ODAKLARI
3.1. Çeşitli doğal veba odaklarından Y. pestis suşlarının alt türlere ve biyovarlara bölünmesinin altında yatan biyokimyasal özelliklere göre özellikleri
3.2. Kafkas alttürünün K resNB suşlarının beslenme ihtiyaçlarının belirlenmesi
BÖLÜM 4. VEBA NEDENİNİN BİYOVARSININ AYRIŞTIRILMASI İÇİN KULLANILAN BİYOKİMYASAL ÖZELLİKLERİ KODLAYAN GENLERİN ORGANİZASYONUNUN YAPISAL-FONKSİYONEL 60 BELİRLENMESİ
4.1. Operonun 60 çiftine ait genlerin ve nitrat indirgemesini kodlayan diğer genlerin yapısal ve fonksiyonel organizasyonunun belirlenmesi
4.2. K. operon suşlarında arabinoz operon genlerinin nükleotid sekanslarının değişkenliğinin karşılaştırmalı analizi
BÖLÜM 5. 83 KODLAMALI GENLERDEKİ DEĞİŞİKLİKLERİN TANIMLANMASI VEBA NEDENİNİ ANA VE ANA OLMAYAN KONULARA AYIRIRKEN KULLANILAN DİĞER ÖZELLİKLER
5.1. Melibiyozun fermantasyonunu kodlayan ana ve küçük alt türlerin veba etkeni 83'ün suşlarındaki gen yapısındaki değişikliklerin belirlenmesi
5.2 U. periasus suşlarında izositrat liyaz biyosentezi genlerindeki mutasyonların belirlenmesi
bölüm 6
6.1. Arginin biyosentezinde yer alan genlerin nükleotid dizilerinin değişkenliğinin karşılaştırmalı bilgisayar analizi
6.2. Fenilalanin, tirozin ve 101 vitamin B1 (tiamin) biyosentezi için genlerdeki mutasyonların tespiti
6.3. Kafkas alt türlerinin suşlarında arginin, fenilalanin, tirozin ve B1 vitamini (tiamin) biyosentezi için genlerin yapısal ve fonksiyonel durumunun incelenmesi
7. BÖLÜM VEBA NEDENİ OLANLARIN ÖZEL İÇİ SINIFLANDIRILMASINA YÖNELİK GENETİK ŞEMA OLUŞTURULMASI İÇİN ELDE EDİLEN VERİLERİN OLASILIĞININ DEĞERLENDİRİLMESİ
Tezin tanıtımı (özetin bir kısmı) "Ana ve küçük alt türlerin Yersinia pestis suşlarının biyokimyasal özelliklerinin genetik analizi" konulu
Sorunun alaka düzeyi
Veba, bulaşıcı bir patojen bulaşma mekanizmasına sahip, zoonotik, doğal bir odak noktasıdır, özellikle tehlikeli karantina bakteriyel bulaşıcı hastalıktır [Cherkassky, 1996]. Veba, 42'si Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerde bulunan çok sayıda doğal veba odağının varlığı nedeniyle nüfus için gerçek bir tehdit oluşturmaktadır [Onischenko ve ark., 2004]. Veba patojeninin, bu hastalıktan etkilenmeyen komşu ülkelerden ve ayrıca biyoterörist eylemlerin bir sonucu olarak Rusya'ya bulaşması tehlikesi var. Dünya Sağlık Örgütü'ne göre, dünya çapında her yıl 2.000'den fazla veba vakası kaydediliyor ve bunların çoğu ölümcül. 2009 yılında Çin'in Hainan Tibet Özerk Bölgesi'nde büyük bir pnömonik veba salgını meydana geldi ve bu salgında çok sayıda ölüm de rapor edildi. Tüm bu gerçekler, vebanın etken maddesi için modern teknolojilere dayanan yeni, son derece etkili teşhis yöntemlerinin, neden olduğu özellikle tehlikeli hastalığın önlenmesi ve tedavisinin acilen geliştirilmesini gerektirmektedir.
Şimdiye kadar kullanılan Yersenia pestis sınıflandırmaları yalnızca morfolojik, kültürel, biyokimyasal ve diğer fenotipik özelliklerin yanı sıra patojen suşlarının virülansındaki farklılıkları da hesaba katmıştır [Bezsonova, 1928; Berlin A.JL ve diğerleri, 1938; Tumansky, 1959; Timofeeva, 1972; Kutyrev ve diğerleri, 1998; Devignat, 1951; Dale ve diğerleri, 2002; Cobbs ve diğerleri, 2004; Dennis ve diğerleri, 2004; Lazarus ve diğerleri, 2004]. Bu tür sınıflandırmalar elbette Y. pestis'in sistematik hale getirilmesine katkıda bulunmuştur ve genel olarak bu tür içindeki mevcut filogenetik ilişkileri yansıtmaktadır. Günümüze kadar önemlerini kaybetmemişlerdir ve pratik mikrobiyolojide hala yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Bununla birlikte, temel genetik ve moleküler mikrobiyolojideki son gelişmeler, vebaya neden olan etkenin sistematize edilmesiyle ilgili sorunların çözümünün niteliksel olarak yeni bir düzeye aktarılmasını mümkün kılmaktadır. Moleküler genetik özelliklerinin kullanımına dayalı olarak veba patojeninin mevcut sınıflandırmasının genetik temele dayalı olarak çevrilmesi, sistematikleştirmenin güvenilirliğini, güvenilirliğini ve kalitesini artıracak ve aynı zamanda klasik şemaların değişkenliğinden kaynaklanan doğal dezavantajlarından kaçınacaktır. Patojenin fenotipik özellikleri Bakteriyel genom, DNA onarım sistemleri tarafından rastgele değişikliklerden korunan oldukça konservatif bir yapıya sahiptir ve bu nedenle genetik farklılaşma şemaları, kullanılan fenotipik sınıflandırmalara göre daha güvenilir, tekrarlanabilir ve daha yüksek çözünürlüğe sahiptir.
Şu anda kabul edilen yerli sınıflandırmaya göre, veba patojeninin türleri ana ve 4 küçük (Kafkas, Altay, Gissar ve Ulegei) alt türe ayrılmıştır [Kutyrev ve diğerleri, 1998]. Yaygın yabancı sınıflandırmaya göre, bir dizi biyokimyasal özellikteki (gliserolü fermente etme, nitratları azaltma, amonyağı oksitleme yeteneği) farklılıklara ve tarihsel ve coğrafi prensibe dayalı olarak 7. paraben türleri üç biyovara bölünmüştür: anpyanaia (eski), tesNeuainz (ortaçağ) ve openianus (Doğu). Fenotipik özelliklere göre, ana alt türün türleri, yabancı sınıflandırmada kabul edilen üç biyovara (antik, ortaçağ ve doğu) karşılık gelir. Ancak veba patojeninin türleri doğal veba odaklarında dolaşmaktadır. Rusya Federasyonu ve komşu ülkeler biovar üyeliği nedeniyle sistematize edilmemiştir.
Diferansiyel olarak önemli biyokimyasal özelliklerin ifadesi açısından en aktif olanı antik biyovarın suşlarıdır. Gliserol fermente ederler ve denitrifikasyon aktivitesine sahiptirler. Ortaçağ biyovarı U. reese'in türleri nitratları indirgeme yeteneğine sahip değildir, ancak gliserol ve arabinozu fermente edebilir. Doğu biyovarının türleri gliserolü fermente etmez, ancak aktif olarak nitratları azaltır ve arabinozu kullanır.
Y. pestis suşlarının biyovarlara bölünmesinde kullanılan biyokimyasal özelliklerin farklı ifadesinin genetik nedenleri bugüne kadar yeterince araştırılmamıştır. Literatürde bu konuyla ilgili sınırlı sayıda yayın bulunmaktadır. Güvenilir bir şekilde tespit edilen tek şey, doğu biyovarının suşlarında gliserol fermantasyonu eksikliğinin nedeninin, gliserol-3-fosfat dehidrojenaz (glpD) genindeki bir mutasyon olduğudur. Doğu biyovarının tüm suşlarının bu gende 93 bp'lik bir delesyona sahip olduğu gösterilmiştir. . Biyovarların farklılaşmasında kullanılan diğer biyokimyasal özellikleri belirleyen genlerdeki değişikliklere ilişkin çelişkili veriler bulunmaktadır.
Y. pestis'in 1985 yılında Veba Mikrobunun Taksonomisine İlişkin Tüm Birlik Toplantısında kabul edilen sınıflandırmaya göre alt türlere bölünmesi, türlerin eşit olmayan biyokimyasal aktivitelerine, laboratuvar hayvanlarına göre virülans farklılıklarına ve farklı peyzaj-coğrafi konumlar [ Kutyrev, Protsenko, 1998; Anisimov ve diğerleri, 2004]. Ana alt türlerin türleri, kural olarak oldukça öldürücüdür ve yüksek salgın önemine sahiptir. Ramnoz ve melibiyozu fermente etmezler, pestisin I'e duyarlı değildirler ve yüksek düzeyde izositralaz üretimine sahiptirler. Minör alt türlerin suşları ramnoz ve melibiyozu fermente eder, pestisin I'e duyarlıdır, izositrat-liyaz aktivitesi sergilemez, laboratuvar hayvanları için seçici olarak öldürücüdür ve epidemik önemi azdır.
Farklı alt türlerin vebasına neden olan suşların farklı biyokimyasal aktivitelerinin genetik temeli pratikte araştırılmamıştır. Yurtdışında, esas olarak Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerin doğal odaklarında dağıtılan küçük alt tür türlerinin yabancı koleksiyonlarında bulunmaması nedeniyle bu konu çok az araştırılmıştır. Yerli literatürde, genlerin yapısındaki farklılıkların, ana ve küçük alt türlerin U. resI'sının belirlenmesine yönelik yalnızca birkaç çalışma bulunmaktadır; nitratların indirgenmesini ve ramnozun fermentasyonunu kodlayan [Eroshenko ve diğerleri, 2008; Kukleva ve diğerleri, 2008, 2009]. Rusya'da ve komşu ülkelerde dolaşan ana ve küçük alt türlerin veba patojeni suşları, nitratların indirgenmesinde rol oynayan genlerin yapısı, gliserol fermantasyonu, arabinoz, melibiyoz, izositrat liyaz ve sınıflandırma için önemli olan diğer özellikler açısından incelenmemiştir. Veba mikrobu suşlarının beslenme ihtiyaçları açısından heterojen olmasının nedeni belirlenmemiştir. Farklı doğal veba odaklarından gelen suşların, suş farklılaşması için genetik şemada kullanılabilen ara metabolizma genlerindeki bozukluklarla belirlenen farklı beslenme ihtiyaçları vardır ¥. çeşitli doğal veba odaklarından kaynaklanır.
Mikrobiyolojik ve biyokimyasal özelliklerin farklı ifadesinin altında yatan genlerin yapısındaki değişikliklerin tanımlanması, veba patojeninin türlerini sınıflandırmak için bir genetik şema oluşturmak ve aynı zamanda U'nun tür içi evriminin ana yönlerini belirlemek için güvenilir bir temel oluşturacaktır. Pechnia.
Çalışmanın amacı. Veba patojeni suşlarını alt türlere ve biyovarlara bölmek için kullanılan biyokimyasal özelliklerin farklı ekspresyonunun genetik temelinin belirlenmesi.
Araştırma hedefleri:
1. Çalışmada kullanılan, Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerdeki doğal veba odaklarından izole edilen G. resiz suşlarının biyokimyasal özelliklerine göre (nitrat indirgenmesi, izo-sitrat liyaz üretimi, arabinoz ve melibiyoz fermantasyonu) karakterizasyonu, alt türlere ve biyovarlara bölünmenin temelini oluşturanlar. Rusya'da ve komşu ülkelerde dolaşan suşların belirli biyovarlara ait olup olmadığını belirlemek.
2. Nitrat indirgeme ve arabinoz fermantasyonu gibi biyovarlara bölünmede kullanılan farklı özellikleri kodlayan genlerin yapısal ve işlevsel organizasyonunu inceleyin.
3. Veba patojeninin ana ve küçük alt türlerinin farklılaşmasının altında yatan melibiyozun fermantasyonunu ve izositrat liyaz üretimini belirleyen U. ribbi genlerindeki değişiklikleri belirlemek.
4. Kafkas alt türlerinin U. renyum suşlarının beslenme ihtiyaçlarını belirlemek ve oksotrofilerinin genetik temelini oluşturmak.
5. U. paratilis suşlarının tür içi sınıflandırmasına yönelik bir genetik şema oluşturmak için elde edilen sonuçları kullanma olasılığını değerlendirin ve bu patojenin tür içi evriminin ana yönlerini belirleyin.
Çalışmanın bilimsel yeniliği. Kapsamlı bir mikrobiyolojik, biyokimyasal ve genetik analizden elde edilen verilere dayanarak, Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerin doğal odaklarında dolaşan veba patojeni türlerinin eski ve ortaçağ biyovarlarına ait olduğu tespit edildi.
İlk kez, Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerde dolaşan ana alt türlerin bazı suşlarında nitrat azaltıcı aktivite eksikliğinin nedeninin, 613. pozisyonda tek bir O nükleotidinin T ile değiştirilmesinin varlığı olduğu gösterildi. periplazmik nitrat redüktaz geni - A çifti, bu suşların orta çağ biyovarına ait olduğunu kanıtlıyor. Altay ve Gissar alt türlerinin suşlarında bu özelliğin ekspresyonunun olmayışı, başka bir genin 302. pozisyonuna bir timin nükleotidinin (+T) eklenmesinden kaynaklanır; bu gen, okuma çerçevesinde bir kaymaya ve okuma yapısının bozulmasına yol açar. kodlanmış taşıma proteini -8 eA'nın yapısı, aynı zamanda nitratların indirgenmesinde de rol oynar.
İlk kez, Altay ve Hissar alt türlerinin U. resia suşlarında arabinoz fermantasyonunun yokluğunun, arabinoz operon - agaC adlı düzenleyici gende bir mutasyonun varlığıyla ilişkili olduğu tespit edildi. genin başlangıcından itibaren 773. pozisyonda bir guanin nükleotidi (+b), okuma çerçevesinde bir kaymaya ve arabinoz genlerinin transkripsiyonunun başlatılması için gerekli olan düzenleyici protein AgaC'nin yapısının bozulmasına yol açar operon.
İlk kez, ana ve küçük alt türlerin veba patojeni suşlarında izo-sitrat liazının farklı üretiminin genetik temeli oluşturulmuştur; bu, iki nükleotidin (+CC) vebaya eklenmesinin varlığıyla ilişkilidir. düzenleyici gen ShK 269-270 pozisyonunda, kendisi tarafından kodlanan asetat operon baskılayıcı protein IcIR'nin inaktivasyonuna yol açar ve ana alt türlerin suşlarında izositrat liyaz enziminin kurucu sentezinin nedenidir. Küçük alt türlerin suşları sağlam bir iIII geni içerir ve izositralazın yapısal sentezini gerçekleştiremez.
Ana alt türün 7. reçine suşlarında melibiyoz fermantasyonunun bulunmamasının, galaktoz permeaz enzimini kodlayan gen 1B'ye 18255 yerleştirme dizisinin dahil edilmesinden kaynaklandığı gösterilmiştir. Küçük alt türlerin suşlarında te1B genine 1B255 eklenmesi yoktur.
İlk kez, Kafkas alt türlerinin oksotrofisinin genetik temeli tanımlandı; bu, a^A ve agora genlerine 1$>100 yerleştirme dizilerinin, 10 bp'lik bir eklemenin eklenmesiyle ilişkilidir. agoO genine, 13 bp'nin silinmesiyle d/Ru genine bir timin nükleotidinin eklenmesiyle. gcJ geninde.
Ana ve küçük alt türlerin U. paratilis suşlarının, alt türlere ve biyovarlara bölünmenin altında yatan biyokimyasal özellikleri kodlayan genlere göre ortaya çıkan moleküler özellikleri, veba patojeninin tür içi sınıflandırması için bir genetik şemanın geliştirilmesinin temelini oluşturur.
Çalışmanın sonuçlarına göre, “Veba patojen suşlarının alt türlere bağlılığının sıralama yöntemi kullanılarak belirlenmesine yönelik yöntem” buluşu için başvurular yapıldı (No. 2009116913. Rüçhan tarihi 14 Mayıs 2009. patenti) ve “Çok lokuslu sıralama yöntemini kullanarak Yersinia pestis suşlarının alt tür farklılaşmasına yönelik yöntem - tiplendirme (No. 2009146094. Rüçhan tarihi: 12/11/2009).
İşin pratik önemi. Çalışmanın sonuçlarına dayanarak, metodolojik öneriler hazırlandı ve onaylandı “Rhamnoz ve arabinozun fermantasyonunu kontrol eden rhaS ve agaC genlerinin dizilenmesine dayalı olarak veba patojen suşlarının alt türlerinin belirlenmesi” (RosNIPCI direktörü tarafından onaylandı) Mikrobe”. 16 Haziran 2009 tarihli Protokol No. 6) ve “Çok odaklı dizi tiplemesi kullanılarak Yersinia pestis alt türlerinin belirlenmesi (RosNIPCI “Mikrop” direktörü tarafından onaylanmıştır. 23 Şubat 2010 tarihli Protokol No. 1).
Devlet Patojenik Bakteri Koleksiyonunda üç suş kaydedilmiştir: Altay'dan Y. pestis KM 910, Gissar'dan KM 596 ve Ulegei alt türlerinden KM 1861, bu alt türlerin referans suşları olarak.
Çalışma sırasında elde edilen Y. pestis suşlarının genetik organizasyonuna ilişkin veriler, konuyla ilgili derslerin verilmesinde kullanılıyor” Veba patojeninin genetiği"RosNIPCI "Mikrop"ta özellikle tehlikeli enfeksiyonlar üzerine uzmanlık kurslarında ve RosNIPCHI "Mikrop"ta "bakteriyoloji" uzmanlığı alanında doktorlar için ileri eğitim programı için ileri eğitim kurslarında.
Savunma hükümleri:
1. Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerin doğal odaklarında dolaşan ana alt türlerin veba patojeninin suşları, bu suşların mikrobiyolojik, biyokimyasal ve genetik özelliklerinin kapsamlı bir analizinden elde edilen verilerle kanıtlandığı üzere, eski ve ortaçağ biyovarlarına aittir.
2. Y. pestis suşlarını alt türlere ve biyovarlara ayırırken kullanılan farklı belirtilerin ve biyokimyasal özelliklerin temeli, bu özellikleri kodlayan genlerdeki farklı mutasyon türleridir. Ortaçağ biyovarının ana alt türlerinin suşlarında nitratları azaltma yeteneğinin olmaması, periplazmik nitrat redüktazın paraA geninde ve Altay ve Gissar alt türlerinin suşlarında anlamsız bir mutasyonun (G T) varlığı ile ilişkilidir - ile Periplazmik taşıma proteini SsuA'nın ssuA genine tek bir nükleotidin eklenmesi. Altay ve Gissar alt türlerinin suşlarında arabinoz fermantasyonunun bulunmaması, agaC gen dizisine bir guanin nükleotidinin eklenmesinden kaynaklanmaktadır.
3. Veba patojeninin ana ve küçük alt türlerinin suşlarının bir takım farklı özelliklere göre farklı biyokimyasal aktiviteleri, onları ana alt türlerde kodlayan genlerin azalmasından ve küçük alt türlerdeki sağlamlıklarından kaynaklanır. Ana alt türlerin suşları tarafından melibioz fermantasyonunun bulunmaması, IS2S5'in melB galaktosid permeaz genine dahil edilmesinden kaynaklanmaktadır ve bu alt türün suşlarında izositrat liazın yapısal sentezi, iki nükleotidin (CC) hücre içine yerleştirilmesinden kaynaklanmaktadır. iclR düzenleyici gen dizisi. Küçük alt türlerin suşları sağlam melB ve iclR genlerini içerir.
4. Kafkas alt türünün Y. pestis suşlarının çoklu beslenme ihtiyacının nedeni, amino asitlerin ve vitaminlerin biyosentezini sağlayan bir dizi genin etkisizleştirilmesidir. Bu alt türün suşlarının arginin için bağımlılığı, argA genine 100 eklenmesinden ve fenilalanin için 10 bp'lik bir eklemeden kaynaklanır. aroG geninde, tirozin için - IS100'ün aroF genine dahil edilmesiyle, tiamin (B]) için 13 bp'nin silinmesiyle. - thiG genine ve tek bir nükleotidin thiH'ye eklenmesi. Kafkas ve diğer alt türlerin suşları için tanımlanmış mutasyonların tüm kompleksinin yanı sıra veba patojeninin biyovarlarına dayanarak, Y. pestis'in intraspesifik sınıflandırması olan genetik bir şema oluşturmak için kullanılabilecek karakteristik genotipler belirlendi.
İşin onaylanması. Tez materyalleri, BDT Üye Devletlerinin IX Eyaletlerarası Bilimsel ve Pratik Konferansında sunuldu ve tartışıldı “Bağımsız Devletler Topluluğu üye devletlerinin topraklarında bulaşıcı hastalıklarla mücadeleye yönelik küresel stratejinin uygulanmasında modern teknolojiler”, Volgograd 2008; VI Uluslararası Konferans " Moleküler teşhis ve biyogüvenlik", M., 2009; Federal Tüketici Haklarının Korunması ve İnsan Refahının Denetlenmesi Servisi'nin genç bilim adamlarının ve uzmanlarının bilimsel ve pratik okul konferansı " Biyolojik güvenliğin sağlanmasına yönelik modern teknolojiler", 25 - 27 Mayıs 2010; RosNIPCI “Microbe”un yıllık final konferanslarında, Saratov 2008 - 2010.
Yayınlar. Tez konusuyla ilgili 7 basılı eser yayınlandı, bunlardan 4'ü “Rusya Eğitim ve Bilim Bakanlığı Yüksek Tasdik Komisyonu tarafından önerilen önde gelen hakemli bilimsel dergiler listesinden” süreli yayınlarda yer aldı. Buluşlar için iki patent verildi " Sıralama yöntemini kullanarak veba patojen suşlarının alt türlerinin farklılaştırılmasına yönelik yöntem"(No. 2009116913. Rüçhan tarihi 05/14/2009. Patent verilmesine ilişkin olumlu karar alınmıştır) ve "Yersinia pestis suşlarının çok lokuslu dizi tiplemesi yöntemi kullanılarak alt tür ayrımına yönelik yöntem" (No. 2009146094. Öncelik) 12/11/2009 tarihli).
Tezin yapısı ve kapsamı. Tez, 156 sayfalık daktilo edilmiş metin üzerinde sunulmaktadır; bir giriş, bir literatür taraması bölümü, kendi araştırmasının beş bölümü, bir sonuç ve sonuçlardan oluşmaktadır. Eser 11 tablo ve 34 çizimle resimlendirilmiştir. Bibliyografik indeks 203 yerli ve yabancı kaynağı içermektedir.
Tezin sonucu "Mikrobiyoloji" konulu Odinokov, Georgy Nikolaevich
1. Çeşitli doğal veba odaklarından doğal Y pestis türlerinin biyokimyasal ve genetik özelliklerinin kapsamlı bir analizine dayanarak, Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerde dolaşan ana alt türlerin türlerinin eski ve ortaçağ biyovarlarına ait olduğu tespit edilmiştir.
2. Diferansiyel biyokimyasal özelliğin ifadesinin bulunmamasının nedeni - Rusya ve komşu ülkelerdeki doğal veba odaklarında izole edilen ana alt türlerin Y. pestis suşlarında nitrat azalması, bir mutasyonun varlığıdır - tek bir nükleotidin değiştirilmesi periplazmik nitrat redüktazın paraA geninde ve Altay ve Gissar alt türlerinde - periplazmik taşıma proteininin ssuA genine tek bir nükleotidin eklenmesi.
3. İlk kez, veba mikrobunun ana ve küçük alt türlerinin suşlarında melibiosis fermantasyon özelliklerinin ve izositrat liyaz üretiminin farklı ifadesinin genetik temeli oluşturulmuştur. Ana alt türlerin suşlarının disakkarit melibiyozu fermente etme yeteneğinin eksikliğinin, galaktoz permeazı kodlayan yapısal gen melB'nin dizisine IS2&5'in eklenmesinden kaynaklandığı gösterilmiştir. Veba mikropunun ana alt türlerinin karakteristiği olan izositrat liazın yapısal sentezinin, iclR baskılayıcı genin 269 - 270 pozisyonlarına iki nükleotidin (+CC) yerleştirilmesinden kaynaklandığı tespit edilmiştir.
4. Altay ve Gissar alt türlerinin pestis suşlarının arabino-negatifliğinin nedeni, arabinoz operon - agaC'nin düzenleyici geninde, bu genin 773 pozisyonuna tek bir guanin nükleotidinin yerleştirilmesinden kaynaklanan bir mutasyondur. .
5. İlk kez Kafkas alt türünün U. pestis suşlarının oksotrofisinin genetik temeli belirlendi. Arginin için oksotrofinin, IS 100'ün argA genine dahil edilmesinden ve fenilalanin için - 10 r.n'lik bir eklemeden kaynaklandığı tespit edildi. aroG'de, tirozin için - aro F'de IS 100'ün eklenmesiyle, Bi vitamini için - thiG'de 13 bp'nin silinmesiyle ve thiH'de timin eklenmesiyle.
6. Veba patojeninin ana (antik, ortaçağ, doğu biyovarları) ve küçük alt türlerinin karakteristik genotipleri belirlenmiştir; bunun kullanımı Y. pestis'in tür içi farklılaşmasına olanak sağlar. Elde edilen sonuçların, Y. pestis suşlarının tür içi sınıflandırmasına yönelik bir genetik şema oluşturmak amacıyla kullanılmasına yönelik umutlar gösterilmektedir.
ÇÖZÜM
A. Yersen ve S. Kitazato, 1894'teki keşfinden sonra vebaya neden olan etken üzerinde bir yüzyıldan fazla süren çalışmalar boyunca, Y. pestis için mikrobiyolojik, biyokimyasal ve diğer faktörlerin farklı belirtilerine dayanan çeşitli sınıflandırma şemalarını defalarca önerdiler. fenotipik özellikler. Önerilen sınıflandırmalar kesinlikle araştırmacıların sahip olduğu bilgi düzeyine ve metodolojik yaklaşımlara karşılık geliyordu. Yani 1928'de A.A. Bezsonova'ya göre, tüm Y. pestis suşları gliserolü fermente edebilme yeteneklerine göre gliserin negatif ve gliserin pozitif olmak üzere iki gruba ayrıldı. 1938'de A.L. Berlin ve A.K. Borzenkov veba patojeninin türlerini okyanus ve kıtasal ırklara ayırdı. 1951 yılında R. Devignat, bir dizi biyokimyasal özelliğe (denitrifikasyon ve gliserol fermantasyonu için farklı yetenekler) ve peyzaj-coğrafi köken özelliklerine dayanarak, Y. pestis suşlarının şu anda biyovarlar olarak belirlenen üç gruba bölünmesini önerdi. veba mikrobu: antik, ortaçağ ve doğuya özgü. 1985 yılında, Veba Mikrobunun Taksonomisine İlişkin Tüm Birlik Toplantısında, veba patojeni için fenotipik özelliklere, laboratuvar hayvanlarına ilişkin virülansa ve dağılım alanına dayalı olarak alt tür kategorilerinin birleşik bir sistematik şeması kabul edildi. BDT ülkeleri ve Moğolistan'da dolaşan veba mikrobunun türleri beş alt türe ayrıldı: ana, Kafkas, Altay, Gissar, Ulegey (Timofeeva 1972; Kutyrev, Protsenko, 1985).
Önerilen tüm şemalar elbette araştırmacılar için faydalıydı ve Y. pestis'in sistemleştirilmesine katkıda bulundu ve bunların çoğu (alt türlere ve biyovarlara bölünme) günümüzde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, modern moleküler biyoloji teknolojilerinin hızlı gelişimi, patojenik Yersinia'nın tam genomlarının dizilenmesi, veba patojeninin karşılaştırmalı genomiğine dayanarak veba patojeninin modern moleküler genetik düzeyde intraspesifik sınıflandırmasının iyileştirilmesi sorununu çözmeyi mümkün kılmaktadır. suşlar. Bu patojen için mevcut diferansiyel sınıflandırma şemalarının genetik seviyeye çevrilmesi, bunların çözünürlüğünü, verimliliğini ve güvenilirliğini artıracak ve aynı zamanda Y. pestis türlerinin sistematizasyon kalitesini artıracaktır.
Farklı alt türlerin veba patojen suşlarının farklı biyokimyasal aktivitelerinin genetik temeli pratikte keşfedilmemiş durumdadır. Y. pestis'in tür içi bölünmesi için kullanılan genlerde yalnızca bireysel genetik kusurlar tespit edilmiştir. Bu nedenle, ortaçağ biyovarının ana alt türlerinin suşlarında, nitratları azaltma yeteneğinin eksikliğinin, periplazmik nitrat redüktaz L çiftlerinin yapısal geninde gerekli olan bir mutasyonun varlığı ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. bu özelliğin tezahürü ve doğu biyovar suşlarının (gliserol-negatif suşlar veya okyanus ırkı) gliserol-3-fosfat dehidrojenaz geni glpD'deki bir silinmeden kaynaklanan gliserolü fermente edememesi. Ana alt türlerin incelenen tüm suşlarının ramnoz negatifliğinin nedeninin, ramnoz operonunun rhaS düzenleyici geninde tek bir nükleotidin isimsiz ikamesinin varlığı olduğuna dair kanıt elde edilmiştir [Kukleva ve diğerleri, 2008; 2009]. Önemli biyokimyasal özellikleri belirleyen diğer genlerle ilgili olarak ya oldukça çelişkili bilgiler var ya da veriler eksik. Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerin doğal odaklarında varlığını sürdüren ana ve küçük alt türlerin Y. pestis türleri, diferansiyel olarak önemli biyokimyasal özelliklere sahip genler açısından pratikte incelenmemiştir. Y. pestis'in evriminin farklı aşamalarında olan çeşitli alt türlerin suşlarının genetik organizasyonunu incelemek önemli bir görevdir, çünkü patojen genomunun son derece öldürücü olanın oluşumuna yol açan evrimsel dönüşümlerini belirlemeyi mümkün kılacaktır. bakteri Y. pestis.
Veba patojeni suşlarının alt türlere ve biyovarlara bölünmesinde kullanılan biyokimyasal özelliklerin farklı ifadelerinin genetik temelini oluşturmak için hem geleneksel mikrobiyolojik ve biyokimyasal yöntemleri hem de modern moleküler biyoloji yöntemlerini (polimeraz zincir reaksiyonu, sıralama ve ayrıca biyoinformatik yöntemler) kullandık. . İnternet kaynakları kullanıldı - NGBI GenBank, KEGG Metabolik Yollar, PF AM, Modeller veritabanları ve bilgisayar programları kullanıldı: mesafe matrisi yöntemleriyle Mega 4.0 ve PHYLIP.
Veba patojen suşlarını alt türlere ve biyovarlara bölmek için kullanılan biyokimyasal özelliklerin farklı ifadesinin genetik temelini oluşturmak için genel bir analiz algoritması kullanıldı. İlk aşamada, Y. pestis'in doğal suşlarında incelenen mikrobiyolojik veya biyokimyasal özelliğin ifadesi araştırıldı. Diferansiyel olarak önemli özelliklerin (nitrat indirgemesi, arabinoz fermantasyonu, melibiyoz, izositrat liyaz üretimi) ifadesi, çeşitli doğal veba odaklarından çok sayıda (yaklaşık yüz) Y. pestis suşunda incelenmiştir.
Eş zamanlı olarak, Y. pestis KIM (ortaçağ biyovar), C092 (doğu biyovar), Antiqua, Angola, Ne-pa1516 (antik biyovar), 91001 (microtus biovar), Pestoides F (Kafkas alt türü) ve Y. pseudotuberculosis suşlarının bilgisayar analizi kullanılarak Genomlarının tam nükleotidleri NCBI GenBank veri tabanında sunulan PB1/+, IP32953, IP31758, YPIII, ürünleri KEGG Metabolik Yollar ve PF AM veritabanlarına uygun olarak ifadeye dahil olan genlerin değişken bölgelerini belirledik. bu özelliğin. Primerler, muhtemelen özelliğin fenotipik tezahürünün bulunmamasının nedeni olan genlerin değişken bölgeleri için tasarlandı; bunun yardımıyla, vebaya neden olan ajanın çeşitli doğal suşlarında PCR'de değişken gen fragmanları çoğaltıldı. İncelenen özelliğin ekspresyonunda farklılık gösteren suşlardaki genlerin nükleotid dizilerinin karşılaştırılmasına dayanarak, bu özelliğin yokluğuna neden olan mutasyonlar belirlendi.
Bu algoritmayı kullanarak, ürünleri Y. pestis türlerinin biyovarlara (nitrat indirgemesi ve arabinoz fermantasyonu) bölünmesinin altında yatan diferansiyel özelliklerin ortaya çıkmasında rol oynayan genlerin yapısal ve işlevsel organizasyonunu inceledik. Genin karşılaştırmalı bir bilgisayar analizi. operon çiftlerinin yanı sıra pagP ve ssuA genleri - düzenleyici (NarP) ve taşıma (SsuA) proteinleri, NCBI GenBank veritabanında sunulan suşlarda ve çok sayıda (yaklaşık bir Y. pestis'in yüzlerce doğal türü ve Rusya Federasyonu'nun yakın ve uzak yurt dışındaki çeşitli doğal veba odaklarında izole edilen küçük alt türleri.
Ana alt türlerin bazı suşlarında denitrifikasyon yeteneğinin bulunmamasının nedeninin, protein - periplazmik nitrat redüktazı kodlayan A çiftinin 613. pozisyonunda G'den T'ye tek bir nükleotid ikamesinin varlığı olduğu tespit edilmiştir. Altay ve Gissar alt türlerinin suşları tarafından nitratların azaltılamamasının nedeni farklıdır ve bu suşlarda 302 pozisyonunda tek bir nükleotid eklenmesi (+T) içeren taşıma protein genindeki - ssuA mutasyonunun varlığıyla ilişkilidir. ). Türlerin biyokimyasal özelliklerinin (nitratları azaltma yeteneği, arabinoz ve gliserol fermantasyonu) yanı sıra elde edilen veriler, eski ve ortaçağ biyovarlarının türlerinin Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerde dolaşırken, doğudaki türlerin ise dolaşımda olduğu sonucuna varmamızı sağladı. biovar yalnızca yabancı ülkelerden gelen suşlar arasında tespit edilir.
Görünüşe göre, microtus biovar suşlarında nitrat azaltıcı aktivite eksikliğinin nedeni, Altay ve Gissar alt türlerinin suşlarında olduğu gibi aynı mutasyondur - ssu genine tek bir nükleotidin eklenmesi. A çifti genindeki bir mutasyonun (1021 pozisyonuna tek bir A çifti geninin eklenmesi), mikrotus suşlarında özelliğin ekspresyon eksikliğinin nedeni olamayacağını tespit ettik [D. Zhou ve diğerleri, 2004 tarafından önerildiği gibi] , çünkü onu aynı zamanda Kafkas alt türlerinin suşlarında ve nitratları azaltan psödotüberküloz suşları 7'de de tanımladık. "
İlk kez, arabinoz operonunun genlerinin yapısal ve işlevsel bir analizi, vebaya neden olan ajanın çok sayıda doğal suşunda ve veba hastalığının düzenlenmesinde yer alan düzenleyici gen agaC'nin tam nükleotid sekansında gerçekleştirildi. arabinoz fermantasyonunun ifadesi belirlendi. Altay ve Gissar alt türlerinde bu özelliğin bulunmamasının nedeninin, genin başlangıcından itibaren agaC geninde 773. pozisyonda tek bir nükleotid insersiyonunun varlığı olduğu tespit edilmiştir. Ana, Kafkas ve Ulegay alt türlerinin suşları, arabinozu fermente etme yetenekleriyle bağlantılı olan böyle bir mutasyon içermez.
Y. pestis suşlarının ana ve küçük alt türlere bölünmesinde kullanılan melibiyoz fermantasyonunu ve izositrat liyaz üretimini kodlayan genlerin yapısı üzerine bir çalışma gerçekleştirildi. Daha önce, ana ve ana olmayan alt türlerin suşlarında bu özelliklerin farklı tezahürlerinin genetik tespiti araştırılmamıştı. Literatürde bu konuyla ilgili veri bulunmamaktadır.
NCBI GenBank veri tabanında sunulan Y. pestis ve 7. pseudotuberculosis suşlarındaki melibioz fermantasyon genlerinin (melA, melB ve melR) nükleotid sekansının karşılaştırmalı bilgisayar analizi, sentezi belirleyen melB genindeki (1232 bp) varlığı gösterdi. galaktoz permeaz, 73 bp'den sonra IS2&5 ekleme dizisinin (1322 bp) eklenmesi. veba patojeni4 suşlarında C092, KIM, Antiqua, Nepal516. 7 pestis Angola, 91001, Pestoides F'nin diğer suşlarında ve 7 pseudotuberculosis'in tüm suşlarında sağlam bir melB gen yapısı bulunmuştur. IS2SJ yerleştirme bölgesini çevreleyen hesaplanmış primerlerin kullanıldığı PCR analizinde, veba patojeninin çok sayıda doğal suşundan melB geninin spesifik fragmanları elde edildi. Ana alt tür olmayan Kafkas, Altay, Gissar ve Ulegei'nin incelenen 7 pestis suşu, PCR, melB geninin sağlam yapısına karşılık gelen, 325 bp boyutunda amplifikasyonlar üretti. Buna karşılık, ana alt türlerin suşlarında fragmanlar 1648 bp'lik daha büyük bir boyuta sahipti; bu, bu gene bir yerleştirme dizisinin dahil edildiğini gösteriyordu ve bunların melibiyoza karşı enzimatik aktivite eksikliği ile ilişkiliydi. Böylece ilk defa genetik bir sebep tespit ettik; diferansiyel bir özelliğin farklı ifadesi - ana ve küçük alt türlerin veba patojeni suşlarında melibiyozun fermantasyonu; bu, ekleme dizisinin eklenmesi nedeniyle ana alt türlerin suşlarında melB geninin yapısının ihlali ile ilişkilidir IS2&5.
Ana alt türlerin Y. pestis suşlarını ana olmayanlardan ve psödotüberkülozun etken maddesinden ayırmak için, izositrat liyaz enzimini yapısal olarak sentezleme yetenekleri kullanılır. NCBI GenBank veri tabanında sunulan G. pestis ve Y. pseudotuberculosis suşlarındaki asetat operon genlerinin (aceA, aceB, aceK, iclR) nükleotid sekanslarının karşılaştırmalı bilgisayar analizi, iclR'ye iki nükleotidin eklenmesinin varlığını gösterdi ( Y. pestis suşları C092, KIM, Antiqua, Nepal516'daki genin başlangıcından itibaren 269-270 pozisyonunda gen boyutu 843 bp) (+CC). Buna karşılık, veba mikrobu Angola, 91001, Pestoides F'nin diğer türleri ve psödotüberkülozun tüm türleri, iclR geninin sağlam bir yapısına sahiptir. Y. pestis'in doğal suşlarında tarafımızdan gerçekleştirilen iclR geninin değişken bölgesinin dizilimi, Y. pestis'in ana alt türünün suşlarında aynı mutasyonun varlığını ortaya çıkardı - iki nükleotidin eklenmesi (+CC) Bu genin yapısının sağlam olduğu küçük alt türlerin aksine, 269 - 270 pozisyonlarında. Tanımlanan mutasyon, indükleyici molekülü bağlayan alanın C-terminal ucunun (148 - 271 aa) kaybıyla ilişkili olarak, asetat operonu IclR'nin baskılayıcı proteininin yapısının (ve fonksiyonunun) gen inaktivasyonuna ve bozulmasına yol açar. . Bu, asetat operonunun genlerinin yapısal ifadesine yol açar ve Y. pestis'in ana alt türlerinin suşlarında izositrat liyaz enziminin yüksek aktivitesi ile ilişkilidir.
Daha önce veba mikrobunun en eski türlerinin Kafkas alt türlerinin türleri olduğu öne sürülmüştü [Bobrov, Fillipov, 1997; Kukleva ve diğerleri, 2002]. Çalışmaları oldukça ilgi çekicidir, çünkü genomdaki, saprofitik enteropatojenik bir bakterinin - bir psödotüberküloz mikrobunun - temelde farklı bir patojen aktarım mekanizmasına sahip oldukça öldürücü bir sistemik patojene dönüşmesine yol açan evrimsel değişikliklerin aşamalarını belirlememize olanak tanır. . Sonuçlarımız, Kafkas alt türünün diferansiyel biyokimyasal özellikler açısından en aktif alt tür olduğunu ve psödotüberküloz etkeni gibi sağlam genler (paraA, ssuA, glpD, araC, melB, iclR) içerdiğini göstermektedir. Bu, Y. pestis'in diğer alt türleriyle karşılaştırıldığında Kafkas alt türlerinin öncülü Y. pseudotuberculosis'e daha yakın olduğunu doğruluyor.
Literatürde bu konuda çelişkili bilgiler bulunması nedeniyle Kafkas alt türlerinden Y. pestis suşlarının besin ihtiyaçlarının araştırılması amacıyla mikrobiyolojik çalışmalar da yaptık. Kafkas alt türlerinin incelenen tüm suşlarının aynı şekilde davrandığı tespit edildi. İki aromatik amino asitin (fenilalanin ve tirozin) yanı sıra arginin amino asidi ve Bi vitamini (tiamin) ihtiyacını belirlediler. Arginin, fenilalanin, tirozin ve B1 vitamini gereksinimlerine ek olarak, Doğu Kafkasya'nın yüksek dağ vebası odağındaki suşlar da lösine bağımlılık gösterirken, Leninakan, Prisevan, Zangezur-Karabağ ve Kafkasya alt türlerinin suşları da lösine bağımlılık gösterdi. Araksin'in doğal odaklarında böyle bir bağımlılık yoktu.
KEGG ve PFAM veritabanlarını kullanarak Kafkas alt türlerinin oksotrofisinin genetik temelini oluşturmak, metabolik yolların analizi ve aromatik amino asitlerin - fenilalanin, tirozin, amino asit arginin ve biyosentezinde yer alan enzimatik sistemlerin tanımlanması. Bt vitamini (tiamin) çalışmaları yapıldı. Kafkas alt türlerinin suşlarında arginin (argA), fenilalanin (aroG), tirozin (aroF) ve Bl vitamini (thiH, thiG) biyosentez genlerinde önemli mutasyonlar bulundu. a^A yapısal geninde, ancak 196 bp'lik bir ekleme dizisi \S100 tespit edildi; bu, Kafkas alt türlerinin arginin için oksotrofisinin nedenidir. Önce geninde
Böylece ilk kez Kafkas alt türlerinin oksotrofisinin genetik temelini oluşturduk. Diferansiyel biyokimyasal özelliklere sahip genler ((ggarA, vvi, glpD, agaC, me1B, igSh) ve büyüme faktörlerinin biyosentez genleri (agA, agoC, agor, ¿/g) için Kafkas alt türlerinin suşlarının elde edilen genetik özellikleri /C ve ShN), U. re, M'ya'nın diğer alt türlerinden bağımsız olarak, bu alt türün en eski dönemini ve aynı zamanda uzun evrim dönemini gösterir.
Çeşitli veba odaklarından elde edilen U. resib'in doğal suşlarının ayrıntılı moleküler genetik analizine dayanarak, Rusya'da, yakın ve uzak yurt dışında dolaşan diğer alt türlerin suşlarının genetik özellikleri de belirlendi. paraA, agaC, glpD, mA ve SHR genlerinde tanımlanan genetik mutasyonların kullanılması, U. pebis suşlarının ana alt türe mi yoksa küçük alt türe mi ait olduğunu ve ana alt türe ait suşların yüksek verimlilik ve güvenilirlikle belirlenmesini mümkün kılar. üç biyovardan biri - antik, ortaçağ veya doğuya özgü. Bu taksonomik birimlerin her birinin (Y. pestis türü) karakteristik genotipleri belirlendi.
Bu çalışma sırasında oluşturulan A, ssu, araC, melB, iclR, argA, aroH, aog F, thiH ve thiG çiftlerinin genlerinin değişkenliği, glpD geninin daha önce tanımlanmış değişkenliği ile birlikte, yeniden yapılandırmak için kullanıldı. Ana ve küçük veba patojen suşlarının alt türlerinin evriminin filogenetik şeması; bu, Kafkas suşlarının ve Y. pestis'in diğer küçük alt türlerinin eskiliğini doğruladı (Şekil 34).
Bu diyagramdan da anlaşılacağı gibi, vebanın etken maddesi psödotüberküloz mikrobundan kaynaklanır ve bu enteropatojenik Yersinia'nın evriminin bir dalıdır. Y. pestis'in en eski alt türü, veba mikrobunun diğer alt türleriyle karşılaştırıldığında filogenetik olarak Y. pseudotuberculosis'e daha yakındır. Y pestis'in evriminin bir başka eski dalı, genetik olarak birbirine yakın olan ve görünüşe göre genel evrim gövdesinden tek bir gruba ayrılan ve daha sonra ayrı alt türlere ayrılan Ulega, Altay ve Gissar alt türleri tarafından temsil edilmektedir. . Görünüşe göre, aralarında en eski olanı, Altay ve Gissar alt türlerinin suşlarına kıyasla, yaşam destek genlerinde daha az sayıda mutasyon içeren (özellikle agaC geninde mutasyon bulunmayan) Ulega alt türüdür. İkincisi filogenetik olarak birbirine ve ayrıca Altay ve Gissar alt türlerinin suşları ile diferansiyel biyokimyasal özellikler için genlerde aynı mutasyonları içeren mikrotus grubunun suşlarına yakındır. Microtus suşlarının Altay-Gissar alt türü grubuna ait olduğunu öne süren ilk kişi bizdik.
С092 (oryantal)
KIM 776 (meclievalis) (meclievalis)
NepalSlö (antika) subsp. ulegeica subsp. Himmrica
91001 (microtus) subsp. altayka.
231, 680 alt bölüm. Kafkasya
Y. pseu dotu bereu losis
Şekil 34. U. rheaT^ya'nın tür içi evrim şeması
Bu çalışmada gerçekleştirilen çalışmalar, vebaya neden olan ajanın moleküler taksonomisinin geliştirilmesinin temelini oluşturmaktadır; bunun amacı, diferansiyel olarak önemli mikrobiyolojik ve biyokimyasal genlerin değişkenliğine dayalı olarak Y. pestis'in tam bir intraspesifik taksonomisini oluşturmaktır. veba mikropunun özellikleri.
Tez araştırması için referans listesi Biyolojik Bilimler Adayı Odinokov, Georgy Nikolaevich, 2010
1. Akiev A.K. Veba mikropunun fizyolojik değişkenliği üzerine // Özellikle tehlikeli enfeksiyonların sorunları. - 1969. Sayı. 6 (10). - S.22 - 25.
2. Anisimov A.P. Yersinia pestis'in veba patojeninin doğal odak ekosistemlerinde dolaşımını ve korunmasını sağlayan faktörleri. Mesaj 1 // Moleküller, genetik. 2002. - Sayı 3. - S. 3 - 23.
3. Anisimov A.P. Yersinia pestis'in veba patojeninin doğal odak ekosistemlerinde dolaşımını ve korunmasını sağlayan faktörleri. Mesaj 2 // Moleküller, genetik. 2002. - Sayı. 4. - S. 3 - 11.
4. Aparin T.P., Golubinsky E.P. Veba mikrobiyolojisi: Bir el kitabı. - Irkutsk / Irkutsk Yayınevi. Üniv., 1989. - 90 s.
5. Bazanova L.P., Innokentyeva T.I. Pirelerin - vebanın ana ve ikincil taşıyıcıları - Sibirya doğal odaklarındaki patojenin dolaşımındaki rolü hakkında // Med. paragraf. ve felç hastalıklar. 2008. - Sayı 3. - S. 54 - 60.
6. Balakhonov S.B., Tsenjaev S.N., Erdemabat A.B. Moğolistan'da izole edilen veba patojen suşlarının yeni plazmidovarları // Moleküller, genetik, mikrobiyol. ve virüsol. - 1991. - No. 11. 27 - 29.
9. Bibikova V.A., Klassovsky V.N., Vebanın pire yoluyla bulaşması. - M.: - Tıp, 1974. 188 s.
10. Bobrov A.G., Fillipov A.A. Yersinia pestis ve Yersinia pseudotuberculosis II Mol. genomlarında IS285 ve IS 100 prevalansı. genetik, mikrobiyoloji. ve virüsol. 1997. - No. 2. - S. 36 - 40.f
11. Vashchenok M.Ö. Pireler insan ve hayvan hastalıklarının patojenlerini taşır. - L.: Nauka, 1988. - 160 s.
12. Velichko L.N., Kondrashkina K.I., Ermilov A.P. ve diğerleri. Pire dışkısı, veba mikropunun uzun süreli depolanması için doğal bir ortamdır // Özellikle tehlikeli enfeksiyon sorunları. - 1978. - Sayı. (64). - S.51 - 53.
13. Volkov Yu.P., Eroshenko G.A. Mikroorganizmaların evrimsel ilişkisinin değerlendirilmesinde kullanılan filogenetik ağaçların oluşturulmasına yönelik bazı yöntemlerin etkinliğinin analizi // Özellikle tehlikeli enfeksiyon sorunları. 2009. - Sayı. 1 (99). - S.35 - 41.
14. Gusfield J. Algoritmalarda diziler, ağaçlar ve diziler: Bilgisayar bilimi ve hesaplamalı biyoloji. - St. Petersburg: Nevsky Lehçesi, BHV-Petersburg, 2003. 654 s.
15. Goldfarb L.M., Domaradskaya T.I., Japaridze M.N. Veba ve psödotüberküloz patojenlerini ayırt etmek için izositat-sıçan-liyaz testinin değerlendirilmesine doğru // Veba ve kolera patojenlerinin laboratuvar teşhisi ve biyokimyasındaki güncel konular. - 1984. S. 23 - 27.
16. Goldfarb L.M., Domaradskaya T.I., Japaridze M.N. Yersinia vebasının intraspesifik farklılaşması için izositrat-liyaz aktivite testi // Zoonotik enfeksiyonların önlenmesinin modern yönleri. - 1984. - bölüm 2.-S. 21-22.
17.Domaradsky I.V. Veba. M.: Tıp, 1998. - 173 s.
18. Ilyina T.S., Romanova Yu.M., Ginzburg A.JI. Çevrede ve konakçı organizmada bakterilerin varlığının bir yolu olarak biyofilm: fenomen, genetik kontrol ve gelişimlerini düzenleyen sistemler // Genetik. - 2004. -T. 40, Sayı 11. - S. 1 12.
19. Klassovsky L.N., Martinevsky I.L., Stepanov V.M. Transkafkasya Dağlık Bölgesi'nde tarla fareleri ve pirelerinden izole edilen veba bakteri suşlarının büyüme faktörleri üzerine // Özellikle tehlikeli enfeksiyon sorunları. 1972. - Sayı. 1. - s. 186 - 188.
20. Kozlov M.P. Veba. M.: Tıp, 1979. - 192 s.
21. Kokushkin A.M. Yabani kemirgenlerde beslenme enfeksiyonunun bazı özellikleri ve veba belirtileri // Probl. özellikle tehlikeli enfeksiyonlar. - 1994.-No.5.-S. 23-31.
22. Kokushkin A.M. Veba epidemiyolojisinin sosyal ve biyolojik yönleri: Yazarın özeti. dis. doktor. Bal. Bilim. 1995. - 46 s.
23. Kukleva L.M. Eroşenko G.A. Shavina N.Yu. ve diğerleri. Psödojenlerin dağılımının karşılaştırmalı analizi. Veba patojeninin ana ve küçük alt türlerinin suşlarının genomu // Molecular Genet., Microbiol. ve virüsol. 2009. - No.2. - S.32-36.
24. Kukleva L.M., Eroshenko-G.A., Pavlova A.I. ve diğerleri Nitrat indirgemesine, gliserol ve arabinoz fermantasyonuna dayalı farklı alt türlerin veba patojen suşlarının özellikleri // Özellikle tehlikeli enfeksiyonların sorunları. - 2007.-No.94.-P. 50-53.
25. Kukleva L.M., Eroshenko G.A., Shavina N.Yu. ve diğerleri. Veba patojeninin ana ve küçük alt türlerinin genomundaki psödojenlerin dağılımının karşılaştırmalı analizi // Molekul, genetik, mikrobiyol. ve virüsol. - 2008. -No.2.-S. 32-36.
26. Kukleva J.M., Kuzmichenko I.A., Protsenko O.A. Yersinia pestis'in farklı alt türlerinin suşlarının ve Yersinia pseudotuberculosis II suşlarının biyokimyasal özelliklerinin karşılaştırmalı özellikleri Özellikle tehlikeli enfeksiyon sorunları. - 2001.-Sayı. 1.-S. 105-110.
27. Kukleva J.M., Protsenko O.A., Kutyrev V.V. Veba patojenleri ile psödotüberküloz arasındaki ilişkiye dair modern fikirler / Moleküller, genetik, mikrobiyol. ve virusol // 2002. No. 1 - s. 3 - 7.
28. Kutyrev V.V., Eroshenko G.A., Popov N.V. ve diğerleri. Veba patojeninin omurgasız hayvanlarla etkileşiminin moleküler mekanizmaları // Molekul, genetik., mikrobiyol. ve virüsol. 2009. Sayı 4. - S. 7 - 12.
29. Kutyrev V.V., Konnov N.P., Volkov Yu.P. Vebaya neden olan ajanın alt yapısı ve vektördeki lokalizasyonu / Ed. V.V. Kutyreva. - M.: Tıp. 2007. 224 s.
30. Kutyrev V.V., Popov Yu.A., Protsenko O.A. Veba mikropunun patojenite plazmitleri // Mol. genetik., mikrobiyoloji., virüsol. 1986. - No. 6. - S.Z -11.
31. Kutyrev V.V., Protsenko O.A. Yersinia pestis II'nin sınıflandırılması ve moleküler genetik çalışmaları Özellikle tehlikeli enfeksiyon sorunları. 1998. - Sayı. 78. - S. 11 - 12.
32. Kutyrev V.V., Smirnova N.I., Veba, kolera ve şarbon patojenlerinin gen teşhisi ve moleküler tiplenmesi // Molekul, genetik., mikrobiyol. ve virüsol. - 2003 - No. 1. - S. 6 14.
33. Kutyrev V.V., Smirnova N.I. Özellikle tehlikeli veba, kolera ve şarbon enfeksiyonlarının patojen genomlarının genetik çeşitliliği ve evrimi: şimdiki zaman ve gelecek // Biyoteknoloji: gelişme durumu ve beklentileri.-M., 2005.-Böl. 1.-S. 17.
34. Özellikle tehlikeli bulaşıcı hastalıkların laboratuvar teşhisi. Pratik kılavuz / Düzenleyen: G.G. Onishchenko, V.V. Kutyrev.-M.: Tıp, Shiko, 2009. 472 s.
35. Maniatis T., Fritsch E., Sambrook J. Moleküler klonlama. M.: Mir, 1984.-480 s.
36. Martinevsky I.L. Yersinia II cinsinin taksonomisi Mat. 4. bilimsel konf. doğaya göre Ocak ve Prof. veba - Alma-Ata, 1965. S. 142 - 148.
37. Martinevsky I.L. Veba ve yakından ilişkili mikropların biyolojisi ve genetik özellikleri. M.: Tıp, 1969. - 295 s.
38. Martinevsky I.L., Stepanov V.M., Kenzhebaev A.Ya. Veba ve ilgili mikropların taksonomisi, mutasyonu ve patojenitesinin genetiği. Nukus. “Karakalpakstan”dan, 1990. - 151 s.
39. Genel bakteriyoloji yöntemleri, ed. F. Gerhardt ve diğerleri M.: Mir, 1984. -264 s.
40. Mihaylova P.S. Transkafkasya Dağlık Bölgesi'ndeki tarla fareleri arasında dolaşan veba mikrobunun taksonomisi // Konferans için materyaller, adanmıştır. Mikrop Enstitüsü'nün 50. yıl dönümü. Saratov, 1968. - S. 67 - 68.
41. Bakterilerin Anahtarı Bergey, ed. J. Hoult. N. Krieg, P. Sneath, J. Staley ve Williams. - M.: Mir, 1997. 9. baskı. (2 cilt halinde). - 799 s.
42. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., Popov N.V. ve diğerleri Kafkasya, Hazar bölgesi, Orta Asya ve Sibirya'daki doğal veba odakları / Ed. G.G.Onishchenko, V.V. Kutyreva. -M.: Tıp, 2004. 192 s.
43. Peisakhis L.A., Stepenov V.M. Vebanın etken maddesinin coğrafi bölgeleme ilkesine göre spesifik olarak sınıflandırılması // Özellikle tehlikeli enfeksiyonların sorunları. 1975. - Sayı. 2. - s. 5 - 9.
44. Popov Yu.A. Yersinia cinsinin temsilcileri üzerinde DNA problarının tasarımı ve kullanımı // Genetics, microbiol. ve laboratuvar yöntemlerinin iyileştirilmesi. teşhis özellikle tehlikelidir. enf. Saratov, 1991. - S.3-13.
45. Popov Yu.A. Plazmidlerin yapısal ve fonksiyonel organizasyonu ve bu model üzerinde genetik mühendisliğindeki gelişmeler: Doktora tezi. biyol. Bilim. Saratov, 1991. - 248 s.
46. Popov Yu.A., Gorshkov O.V., Savostina E.P. ve diğerleri, Çeşitli doğal veba odaklarından Yersinia pestis suşlarının genotiplenmesi // Molekul, genetik, mikrobiyoloji ve viroloji 2000. - No. 3. - S. 12-17.
47. Popov Yu.A., Protsenko O.A., Anisimov P.I., Kokushkin A.M., Mozharov
48. T. Veba mikropunun pestisitojenite plazmitlerinin agaroz jelde elektroferez ile tespiti // Özellikle tehlikeli olanın önlenmesi. inf.- Saratov, 1980.-P. 20-25.
49. Popov N.V., Sludsky A.A. Udovikov A.I. ve diğerleri Yersinia pestis biyofilmlerinin veba enzootik mekanizmasındaki rolü // Zhurn. mikrobiyoloji, epidemiol. immünol. 2008. - Sayı 4. - S. 118 - 120.
50. Popov Yu.A., Fursov V.V., Tn1 ve Tn9 transpozonları ile etiketlenmiş pestisitojenite plazmit türevlerinin yapısal organizasyonu // Mol. biyolojik, genetik. ve immünol. veba ve kolera Saratov, 1983. - s. 34 - 39.
51. Popov Yu.A., Yashechkin Yu.I., Drozdov I.G. Çeşitli biyovarların veba patojen suşlarının pFra plazmitlerinin DNA yapısının moleküler genetik analizi // Genetik. 1998. - T. 34. - S. 198 - 205.
52. Protsenko O.A., Anisimov P.I., Mozharov O.T. ve diğerleri. Pestisin1, antijen fraksiyonu I ve ekzotoksin “fare” toksininin sentezini belirleyen veba mikropunun plazmitlerinin tanımlanması ve karakterizasyonu // Genetik. 1983. -T. 19, No. 7.-S. 1081-1090.
53. Ratner V.A. Moleküler genetik: prensipler ve mekanizmalar. Novosibirsk: Nauka, 1983. - 256 s.
54. Rozanova G.N., Serdyukova T.V., Shekhikyan M.T. ve ark. Kafkasya Bilimsel araştırmalarında saha tipi odaklardan veba etkeni. Kafkasya ve Transkafkasya Antiveba Enstitüsü. Stavropol, 1987. 17 s.
55. Savostina E.P., Popov Yu.A., Veba patojeninin ana alt türlerinin suşlarının genomik polimorfizmi // Molekul, genetik, mikrobiyoloji ve viroloji 2009. - No. 4. - S. 23 - 26.
56. Smirnov G.B. Bakteri genomları tarafından genetik bilgi edinme ve kaybetme mekanizmaları // Modern biyolojideki gelişmeler. 2008. - T. 128. - Sayı 1.-S. 52-76.
57. Smirnov I.V. Yersiniosis ve ilgili mikroorganizmaların etken maddesi // Klin, mikrobiyol. antimikrobiyal, kemoterapi. - 2004. - T. 6, No. 1. - S. 10 -21.
58. Smirnova N.I., Kutyrev V.V., Genomların moleküler genetik özelliklerinin ve bunların kolera, veba ve şarbonun etken maddelerindeki evrimsel dönüşümlerinin karşılaştırmalı analizi // Molekul, genetik., mikrobiol. ve virüsol. 2006. - Sayı. 2. - S. 9 - 19.
59. Stybaeva G.S., Atshabar B.B. Vebaya neden olan ajanın moleküler genetik özellikleri (literatür taraması) // Kazakistan'da karantina ve zoonotik enfeksiyonlar. 2003. - No.1 (7). - S.52 - 67.
60. Süleymanov B.M. Enzootik vebanın mekanizması. Almatı, 2004. - 236 s.
61. Sultanov G.V., Kozlov M.P. Veba. Mikrobiyoloji, patogenez, teşhis. Cilt 1. Mahaçkale: Acad'dan. kırsal Bilimler, 1995. 223 s.
62. Timofeeva L.A. Veba mikropunun taksonomisi üzerine // Özellikle tehlikeli enfeksiyonların sorunları. 1972. - Sayı. 1(23).- S. 15 - 22.
63. Timofeeva L.A., Aparin T.P., Trofimenko N.Z. Sibirya odaklarında izole edilen veba mikrop suşlarının amino asitleri için gereksinimler // Dokl. Irkutsk, vebayla mücadele enstitüsü. Irkutsk, 1971. - Sayı. 9. - sayfa 43 - 44.
64. Timofeeva L.A., Zhamyan Suren, Sotnikova A.N. ve diğerleri 1969 - 1971'de Moğolistan'da izole edilen veba mikrobu türlerinin biyolojik özellikleri. // Özellikle tehlikeli enfeksiyon sorunları. 1974. - No.3 (37). - S.37 - 42.
65. Timofeeva JI. A., Logachev A.I. Yersinia pestis ulegeica, Moğolistan'da izole edilen veba mikrobunun yeni bir alt türüdür. Kitapta: Moğolistan ve SSCB'de epidemiyoloji ve özellikle tehlikeli enfeksiyonların önlenmesi. - Ulaanbaatar: B.I., 1975. - S. 63 -64.
66. Tumansky V.M. Veba odağının doğal koşullarında veba mikropunun değişkenliği // Kitap: Doğa, odaklar ve epidemiyoloji. özellikle tehlikeli bilgiler - Saratov, 1959. S. 189 - 199.
67. Filippov A.A., Kutyrev V.V., Vidyayeva N.A. ve diğerleri, dış zar proteininin (BVM2) sentezini kodlayan Yersinia pestis'in (Lehmann, Neumann) kalsiyum bağımlı plazmidinin lokusunun klonlanması // Genetik. 1991. - T. 27, Sayı 4.-S. 598-606.
68. Filippov A.A., Solodovnikov N.S., Kukleva L.M. ve diğerleri. Çeşitli doğal odaklardan veba patojen suşlarının plazmit kompozisyonunun incelenmesi // JMEI. 1992. - Sayı. 3. - S. 10 - 13.
69. Tseneva G.Ya., Solodovnikova N.Yu., Voskresenskaya E.A. Yersinia virülansının moleküler yönleri // Klin, mikrobiyol. antimikrobiyal, kemoterapi. 2002. - T.4, No.3. - S.248 - 266.
71. Yashechkin Yu.I., Kirillina O.A., Popov Yu.A. ve diğerleri. 68 ppm plazmit Y pestis 231'in fiziksel haritalaması // Özellikle tehlikeli enfeksiyon sorunları. -1999. -No.1 S.26-28.
72. Achtman M., Morelli G., Zhu R. ve diğerleri. Veba basili Yersinia pestis II Proc'un mikro evrimi ve tarihçesi. Natl". Acad. Sei. ABD. 2004. - 101. - P. 17837-17842.
73. Achtman M., Zurth K., Morelli G. ve diğerleri. Vebanın nedeni olan Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis II PNAS'ın yakın zamanda ortaya çıkan bir klonudur. 1999. - V.96;N24. -P. 14043-14048.
74. Anisimov A.P.*, Lindler L.E., Pier G.B. Yersinia pestis II Kliniğinin Tür İçi Çeşitliliği. Mikrobiyol. 2004. - V.17(2). - S.434 - 464.
75. Anisimov P.I., Popov Iu.A., Kokushkin A.M. Bir veba patojeni ve veba enzootiklerinde fonksiyonel fenotipik değişkenlik // Med. Parazitol. (Moskova). 2001. - N2.-P. 35-40.
76. Bai G., Smith E., Golubov A., Pata J. ve diğerleri. Yersinia pestis'te Yersinia psödotüberküloza karşı farklı gen regülasyonu: hipoksinin etkileri ve bir plazmid düzenleyicinin potansiyel rolü // Adv. Exp. Med. Biyol. 2007. - V. 603. - S. 131 - 144.
77. Baxevanis A.D., Francis-Ouellette B.F./ Biyoinformatik. Genlerin ve proteinlerin analizine yönelik pratik bir kılavuz / John-Willey N.Y., 2001. 470 s.
78. Bearden S.W., Sexton C., Pare J. ve diğerleri. Yersinia pestis'in zayıflatılmış enzootik (pestoides) izolatları aktif aspartazı eksprese eder // Mikrobiyoloji. 2009 - V.155. -P. 198-209.
79. Beale J., Lee S.Y., Iwata S., Beis K. Escherichia coli II Acta Cryst'ten alifatik sülfonat bağlayıcı protein SsuA'nın yapısı. 2010. - V. 66. - S. 391 -396.
80. Ben-Gurion R., Hertman J., Kovalent olarak kapalı uçları olan Yersinia enterocolitica'nın bakteriyosin benzeri malzeme doğrusal plazmid profajı // Moll. Mikrobiyol. - 1958-V. 48.-P. 989-1003.
81. Bercovier H. Yersinia pestis'in DNA hibridizasyonu yoluyla tür içi ve türler arası ilişkisi ve Yersinia pseudotuberculosis II Curr ile ilişkisi. Mikrobiyol. 1980. - Sayı 4. - S. 225 - 229.
82. Bobrov A.G., Kirillina O.A., Forman S. ve diğerleri. Yersinia pestis biyofilm gelişimine bakış: ekzopolisakkarit üretiminde yer alan hms iç zar proteinlerinin topolojisi ve ortak etkileşimi // Environ.microbiol. - 2008. V.10, N 6.-P. 1419-1432.
83. Bobrov A.G., Perry R.D. Yersinia pestis lacZ, düşük enzimatik aktiviteye sahip bir beta-galaktosidaz ifade eder // FEMS Microbiol. Lett. 2006. - V. 255, N 1. - S. 43 -51.
84. Brubaker R.R. Pasteurella pestis II Infect'te pürin mononükleotidlerinin birbirine dönüşümü. Bağışıklık. 1970. - V. 1. - S. 446 - 454.
85. Brubaker R.R. Yersinia cinsi: virülansın biyokimyası ve genetiği // Microbiol ve Immunol'de Güncel Konular. 1972. -N 57. - S. 293 - 299.
86. Brubaker R.R. Vebanın son zamanlarda ortaya çıkışı: suçlu bir evrim süreci // Mikrobiyal ekoloji. 2004. - V. 47. - S. 293 - 299.
87. Burrows T.W. Pasteurella pestis'in virülansı ve vebaya karşı bağışıklık // Er-geb Mikrobiol Immunitatsforsch Exp Ther. 1963 - V. 37. - S. 59-113.
88. Buchrieser C., Prentice M., Carniel E. Yersinia pestis'in 102 kilobazlık kararsız bölgesi, iç yeniden düzenlemeye uğrayan bir pigmentasyon segmentine bağlı yüksek patojeniteli bir ada içerir // J. Bacterid. - 1998. - V. 180. - S. 2321-2329.
89. Cao Y., Huang H., Meng K. ve diğerleri. Yersinia pestis biovar Microtus str.'den bir a-galaktosidazın klonlanması ve fonksiyonel ifadesi. 91001 //Biosci. Biyoteknoloji. Biyokimya. 2008.-V. 72, N 8. - S. 2203 - 2205.
90. Chain P.S., Carniel E., Larimer F.W. ve ark. Yersinia pestis'in evrimine, Yersinia pseudotuberculosis ile tüm genom karşılaştırması yoluyla içgörüler! Ben Proc. Natl. Acad. Sei. AMERİKA. 2004. - V. 191, N38.-P. 13826-13831.
91. Chain P.S., Hu P., Malfatti S.A. ve diğerleri. Yersinia pestis suşu Antiqua ve Nepal516'nın tam genom dizisi: Ortaya çıkan bir patojende gen azalmasının kanıtı // J. Bacterid. 2006. - V. 188, N 12. - S. 4453 - 4463.
92. Chuang Peng / Filotetik ağaç yapımında mesafeye dayalı yöntemler, s. 1 -11,2007.
93. Cobbs C.G., Chansolme D.H. Veba. // Klin. Dermatol. 2004. - V.22(3). -P. 303-312f
94. Cornells G.R., Boland A., Boyd A.P. ve ark. Bir antihost genomu olan Yersinia'nın virülans plazmidi // Microbiol. Mol. Biyol. Rev. 1998. - V. 62, Sayı 4. -P. 1315-1352.
95. Cowan C. ve diğerleri, Yersinia pestis tarafından epitelyal hücrelerin istilası: Y. pestis'e özgü bir istilaya dair kanıt // Infect. Bağışıklık. 2000. - V. 68(8). - S.4523 - 4530.
96. Dale C., Wang B. ve diğerleri. Veba // Proc. Natl. Acad. Sei. AMERİKA. 2002. -Cilt.99, Sayı 19.-P. 12397-12402.
97. Darby C., Ananth S.L., Tan L., Hinnebusch B.J. Pire blokajı için gerekli gmhA a Yersinia pestis geninin Caenorhabditis elegans biyofilm// Infect.Immun.- 2005 kullanılarak tanımlanması. V.73, N11. - S.7236 - 7242.
98. Deng W., Burland V., Plunkett G. ve diğerleri. Yersinia pestis KIM'in genom dizisi // J. Bacteriol. 2002 - V. 184 - S. 4601 - 4611.
99. Dennis D.T., Chow C.C. Veba // J. Pediatr. Bulaştırmak. Dis. 2004. - V.23(1). -P. 69-71.
100. DeSalle R., Giribet G., Wheeler W. / Moleküler sistematiği ve evrim teknikleri / Birkhauser, 2002. 420 s.
101. Devignat R. Variétés de l'espèce Pasteurella pestis // WHO. - V. 4.-263.
102. Epinger M., Guo Z., Sebastian T., Song Y., Lindl er L.E., Yang R., Ravel J. Cine // J. Bacteril'deki endemik vebanın doğal odaklarından Yersinia pestis izolatlarının taslak genom dizileri. 2009. - V. 191. - S. 7628 - 7629.
103.Epinger M., Rosovitz M.J., Fricke W.F. ve ark. Uzak Doğu Kızıl Benzeri Ateşin etken maddesi olan Yersinia pseudotuberculosis IP31758'in tam genom dizisi // Plos Genetics 2007. - V. 3 - S. 1508 - 1522.
104. Eppinger M., Worsham P.L., Nikolich M.P. ve ark. Köklü Yersinia pestis suşu Angola'nın genom dizisi, veba bakterisinin evrimi ve pangenomu hakkında yeni bilgiler ortaya koyuyor // J. Bacteriol. 2010. - V. 192, N 6. - P.i1685-1699.
105. Felek S., Tsang T.M., Krukonis E.S. Üç Yersinia pestis adezini, Yop'un ökaryotik hücrelere dağıtımını kolaylaştırır ve veba virülansına katkıda bulunur // Infect. Bağışıklık. V.77(2). - S.825 - 836.
106. Felsenstein J., PHYLIP-Filogeni Çıkarım Paketi (versiyon 3.2). Kladistik, 1989, cilt. 5, s. 164 -166, http://evolution.genetics.washington.edu/philip.html.
107. Fetherston J.D., Perry R.D. Yersinia pestis KIM6+'nın pigmentasyon lokusu bir ekleme sekansı ile çevrelenmiştir ve pestisin duyarlılığı ve HMWP2 // Mol için yapısal genleri içerir. Mikrobiyol. 1994. - V. 13, Sayı 4. - S.697 - 708.
108. Forman S., Wulff C.R., Myers-Morales T. ve diğerleri. Yersinia pestis'in yadBC'si, hıyarcıklı veba için yeni bir virülans belirleyicisi // Infect Immun. - 2008. V.76(2). -P. 578-587.
109. Garcia E., Worsham P., Bearden S. ve diğerleri. Eski Sovyetler Birliği'nden atipik bir Yersinia pestis türü olan Pestoides F // Adv Exp Med Biol. 2007. - V. 603. -P. 17-22.
110. Gascuel O. / Evrim ve filogeninin matematiği. / Clarendon tuşuna basın. Oxford. 2004.-33 s.
111. Gintsburg A.L., Shovadaeva G.A., Shubin F.N. ve ark. Kromozomla entegrasyon - Yersinia'da kalsiyuma bağımlı plazmitlerin alternatif bir durumu // Mol. Gen. mikrobiyol. Virüsol. 1989. -N 5. -P. 7 - 11.
112. Guiyoule A., Gerbaud G., Buchriester C. ve diğerleri. Yersinia pestis II Emerg'in klinik bir izolatında streptomisine karşı aktarılabilir plazmit aracılı direnç. Bulaştırmak. Dis. 2001. - Cilt. 7, No. 1. - S. 43 - 48.
113. Guo Y., Zhang L., Xia L. ve diğerleri. Çin'in Yunnan Eyaletinin Yulong İlçesinden izole edilen Yersinia pestis'in biyokimyasal karakterleri // Endem. Dis. Boğa. -2008.-V. 23.-P. 12-14.
114. Hall-Stoodley L., Costerton J.W., Stoodley P. Bakteriyel biyofilmler: doğal ortamdan bulaşıcı hastalıklara. Nat. Rev. Mikrobiyol. 2004, N2. - P 95 -108.
115. Hare J.M., McDonough K.A. Yersinia pestis'te Kongo kırmızısı bağlanma mutasyonlarının yüksek frekanslı RecA'ya bağımlı ve bağımsız mekanizmaları. HJ Bakteriol. 1999.-V. 181(16). - S.4896-4904.
116. Hillier S.L., Charnetzky W.T. Yersinia pestis II J.Clin.Microbiol'un tanımlanması için izositrat liyaz aktivitesini kullanan hızlı teşhis testi. - 1981. V.13, N4. -P. 661-665.
117. Hinnebusch B.J. Yersinia pestis II Curr'da pire kaynaklı bulaşmanın evrimi. Sorunlar Mol. Biyol. 2005. - V.7, N2. - S.197 - 212.
118. Hinnebusch B.J., Fisher E.R., Schwan T.G. Yersinia pestis plazminojen aktivatörü ve diğer plazmid kodlu faktörlerin pire // Infect'in ılıman bağımlı tıkanmasındaki rolünün değerlendirilmesi. Bağışıklık. 1998. - V. 178. - S. 1406 -1415.
119. Hinnebusch B.J., Perry R.D., Schwan T.G. Vebanın pire yoluyla bulaşmasında Yersinia pestis hemin depolama (hms) lokusunun rolü // Bilim. 1996. - V 273, N5273-P. 367-370.
120. Hinnebusch B.J., Rudolf A.E., Cherepanov P. ve diğerleri. Pire vektörünün orta bağırsağında Yersinia pestis'in hayatta kalmasında Yersinia fare toksininin rolü // Bilim. - 2002.-V. 296.-P. 733-735.
121. Hoiczyk E., Roggenkamp A., Reichenbecher M. ve diğerleri. Yersinia YadA ve Moraxella UspA'ların yapı ve dizi analizi, yeni bir adezin sınıfını ortaya koyuyor // J. EMBO 2000. - V. 19(22). - S.5989 - 5999.
122.Iriarte M., Cornelis G.R. Yersinia patogenezinin moleküler belirleyicileri // Microbiologia. 1996.-V. 12(2). - S.267-280.
123.Jackson S., Burrows T.W. Demirin, Pasteurella pestis'in öldürücü suşlarının pigmentli olmayan mutantları üzerindeki virülans arttırıcı etkisi // Br. J. Exp. Pathol. - 1956. -Y. 37.- S.577-583.
124. Joshua G.W.P., Karlyshev A.V., Smith M.P. ve ark. Yersinia enfeksiyonunun bir Caenorhabditis elegans modeli: biyotik yüzeylerde biyofilm oluşumu // Mikrobiyoloji. 2003. - V. 149. - S. 3221 - 3229.
125. Kienle Z., Emody L., Svanborg C., O"Toole P.W. Yersinia pestis'in plazminojen aktivatörü tarafından sağlanan yapışkan özellikler. II J. Gen. Microbiol. 1992. -V. 138.-1679-1687.
126. Kitching I.J., Forey P.L., Humphries C.J., Williams D.M. / Kladistik. Tutumluluk analizinin teorisi ve uygulaması. - Oxford bilim yayınları, 1998. - 223 s.
127. Kutyrev V.V., Boolgakova E.G., Yidyaeva N.A. ve ark. Yersinia // Natural Infect cinsinin farklı bakteri gruplarının karşılaştırmalı özellikleri. Dis.: Özet. Scient. Konf. 6 Aralık. Ulanbator, 2001. - S. 39 - 40.
128. Kutyrev V.V., Filippov A.A., Oparina O.S. ve ark. Yersinia pestis kromozomal belirleyicileri Pgm+ ve virülansla ilişkili Pst'lerin analizi // Microb. Pa-tog. 1992.-V. 12.- S.177-186.
129. Kutyrev V.Y., Vidyaeva N.A., Bobrov A.G. ve ark. Fare toksini geni, salgılanan bir fosfolipaz D // Bakteriyel protein toksinlerini kodlar. Jena-Stuttgart. - 1997.-P. 59-60.
130. Lahteenmaki K., Virkola R., Saren A. ve diğerleri. Yersinia pestis'in plazminojen aktivatör pla'sının ekspresyonu, memeli hücre dışı matrisine bakteri bağlanmasını arttırır // Infect Immun. 1998. - V.66(12). - S.5755 - 5762.
131. Lathem W.W., Price P.A., Miller V.L., Goldman W.E. Plazminojen aktive edici bir proteaz, özellikle birincil pnömonik vebanın gelişimini kontrol eder // Bilim. 2007. - V.315 (5811). - S.509 - 513.
132. Lazarus A.A., Decker C.F. Veba // Solunum Bakım Kliniği. N Am. 2004.-V. 10(1).-S. 83-98.
133. Li Y., Hauck Y., Platonov M.E. ve diğerleri, Yersinia pestis'in ML VA ile genotiplenmesi ve analizi: Orta Asya veba odaklarının dünya çapında yayılmasına ilişkin bilgiler // PLoS ONE. 2009.-V. 4 (6)., e6000.j
134. Liang Y., Hou X., Wang Y. ve diğerleri. Tamamen sıralanmış Yersinia pestis II suşlarının genom yeniden düzenlemeleri J. Clin. Mikrobiyol. - 2010. - V.48 (5). - S.1619-1623.
135. Lillard J.W., Fetherston J.D., Pedersen L. ve diğerleri. Yersinia pestis II Geninin hemin depolama (hms) sisteminin dizisi ve genetik analizi. - 1997. V. 193. - S. 13-21.
136. Lindler LE. Veba patojeni Yersinia pestis II J. AOAC Int. için tipleme yöntemleri. 2009. - V.92(4). - S.1174 - 1183.
137. Lindler L.E. Yersinia pestis'e özgü plazmidler pFra ve pPla // Yersinia moleküler ve hücresel biyoloji / Ed.: E. Carniel, B.J. Yinnebusch. Horison Bio-science, 2004. - Bölüm.
138. Matsumoto H., Young G.M. Yersinia'nın yer değiştirmiş efektörleri // Curr. Görüş. Mikrobiyol. 2009. - V.12(1). - S.94 - 100.
139. McDonough K.A., Barnes A.M., Quan T.J. ve ark. Yersinia pestis'in pla genindeki mutasyon, veba basili-pire (Siphonaptera: Cerato-phyllidae) etkileşiminin seyrini değiştiriyor I I J.Med. Entomil. 1993. - V. 30. - V. 772 - 780.
140. Mollaret H., Mollaret C. Yersina cinsinde Melibiose fermantasyonu ve Y. pestis II Bull Soc Pathol Exot Filiales çeşitlerinin teşhisinde önemi. 1965.-V. 58(2).-S. 154-156.
141. D.W. Dağı / Biyoinformatik. Dizi ve genom analizi. Gold Spring Harbor laboratuvar yayını, 2003. - 50 s.
142. Naumov A.V., Kuz"michenko I.A., Taranenko T.M. ve diğerleri. Vebanın etken maddesinin patojenitesinin biyokimyasal yönleri // Med. Parazitol. (Mosk). 1995. - N 4 - P. 17-22.
143. Navid A., Almaas E. Yersinia pestis'teki metabolik ağın genom ölçeğinde yeniden inşası, suş 91001 // Mol. Biyosist. 2009. - V.5(4). - S.368 -375.
144. Odaert M., Berche P., Simonet M. IS200 benzeri bir element kullanılarak Yersinia psödotüberkülozun moleküler tiplenmesi // J. Clin. Mikrobiyol. 1996. - V.34(9). -P. 2231-2235.
145. Paerregaard A., Espersen F., Skurnik M. Yersinia dış membran proteini YadA'nın tavşan bağırsak dokusuna ve tavşan bağırsak fırça kenar membran keseciklerine yapışmasındaki rolü // APMIS. 1991. - V.99(3). - S.226 - 232.
146. Paiva Nunes M., Suassuna I., Rocco Suassuna I. Brezilya'da izole edilen Yersinia pestis örneklerinin biyokimyasal özellikleri // Rev. Latinoam. Mikrobiyol. 1977. -V. 19(4).-S. 189-197.
147. Pan N.J., Brady M.J., Leong J.M., Goguen J.D. Yersinia pestis II Antimicrob'da tip III salgısının hedeflenmesi. Ajan Kemother. 2009. - V.53(2). - S.385 -392.
148. Panina E.M., Vitreschak A.G., Mironov A.A., Gelfand M.S. Gama-proteobakterilerde aromatik amino asit biyosentezinin düzenlenmesi // J. Mol. Mikrobiyol. Biyoteknoloji. 2001. - V.3, N 4. - S.529 - 543.
149. Parhill J., Wren B:W., Thomson N.R. ve ark. Vebanın etken maddesi olan Yersinia pestis'in genom dizisi // Doğa. 2001. - V. 413. - S. 523 - 527.
150. Patel C.N., Wortham B.W., Lines J.L. ve ark. Poliaminler veba biyofilminin oluşumu için gereklidir // J. Bacteriol. 2006.-V. 188, N 7. - S. 2355 - 2363.
151. Pendrak M.L., Perry R.D. Yersinia pestis I I Biol'un hemin depolama yerinin karakterizasyonu. Metaller 1991. - V. 4. - S. 41 - 47.
152. Pendrak M.L., Perry R.D. Yersinia pestis II Mol'ün Hms+ fenotipinin ifadesi için gerekli proteinler. Mikrobiyol. 1993. - V.8. - S.857 - 864.
153. Perry R.D., Pendrak M., Schuetze P. Yersinia pestis II J. Bacteriol'un pigmentasyon fenotipinde yer alan bir hemin depolama lokusunun tanımlanması ve klonlanması. 1990. - V. 172. - S. 5929 - 5937.
154. Perry R.D., Balbo P.B., Jones H.A. ve ark. Yersinia pestis'ten Yersiniabactin." sideroforun biyokimyasal karakterizasyonu ve demir taşınması ve düzenlenmesindeki rolü // Mikrobiyoloji. 1999. - V. 145, Bölüm. 5. - P. 1181 - 1190.
155.Perry R.D., Fetherston J.D. Yersinia pestis vebanın etiyolojik ajanı // Clin. mikrobiyol. Rev. 1997. - V. 10. - S. 35.
156. Perry R.D., Lucier T.S., Sikkema D.J. ve diğerleri, Yersinia pestis II Infect'te hemin ve inorganik demirin depolama rezervuarları. Bağışıklık. - 1993. V. 61. - S. 32 - 39.
157. Perry R.D., Straley S.C., Fetherston J.D. ve ark. Yersinia pestis KIM5'in düşük Ca2+ yanıtlı plazmidi pCDl'nin DNA dizilimi ve analizi // Infect. Bağışıklık. 1998. - V.6, N 10. - S.4611 - 4623.
158.Perry R.D. Bir pire vebası: Yersinia pestis II'nin hayatta kalması ve bulaşması ASM Haberleri. 2003. - V.69, N 7. - S. 385 - 389.
159. Veba. Bilgi notları N267. Dünya Sağlık Örgütü, Erişim adresi: http//www.who.int/mediacentre/factssheets/fs267/en/index.htm. Erişim tarihi: 18 Nisan 2006.
160. Portnoy D.A., Moseley S.L., Falkow S. Plazmidlerin karakterizasyonu ve Yersinia enterocolitica patogenezinin plazmid ile ilişkili belirleyicileri // Infect. Bağışıklık. 1981. - V. 31. - S. 775 - 782.
161. Pouillot F., Fayolle C., Camiel E. Yersinia pseudotuberculosis'te korunan ve Yersinia pestis I I Infect tarafından kaybedilen kromozomal bölgelerin karakterizasyonu. Bağışıklık. 2008. - V.76(10). - S.4592 - 4599.
162. Prasad Maharjan R., Yu P.L., Seeto S., Ferenci T. Glikoz sınırlaması altında büyüyen Escherichia coli'de izositrat liyazın ve glioksilat döngüsünün rolü // Res. Mikrobiyol. 2005. - V. 156(2). - S.178 - 183.
163. Prentice MB, Rahalison L. Plague // Lancet. 2007. - V. 369, N 9568. - S. 1196-1207.
164. Price S.B., Cowan C., Perry R.D., Straley S.C. Yersiniapestis V antijeni, Ca2(+)'ya bağımlı büyüme ve düşük Ca2+ yanıtlı virülans genlerinin maksimum ekspresyonu için gerekli olan düzenleyici bir proteindir // J. Bacterid. 1991. - V. 173(8). - S.2649 - 2657.
165. Rakin A., Boolgakowa E., Heesemann J. Yersinia pestis bakteriyosin pestisin gen kümesinin yapısal ve fonksiyonel organizasyonu // J. Microbiol. 1996.-V. 142.-P. 3415-3424.
166. Richardson D.J., Berks B.C., Russell D.A. ve ark. Prokaryotik nitrat redüktazların fonksiyonel, biyokimyasal ve genetik çeşitliliği // CMLS. 2001. - V. 58. - S. 165-178.
167. Sneath P.H., Sosyal R.R. Sayısal taksonomi II Doğa. 1962. - N 193. - S. 855 - 860.
168. Quan T., Van der Linden J., Tsuchiya K. Yersinia pestis II J. Clin'in hızlı varsayımsal tanımlanması için kalitatif izositrat liyaz tahlilinin değerlendirilmesi. Mikrobiyol. 1982.-V. 15,N16.-P. 1178-1179.
169. Sanger F., Nicklen L., Coulson A. Zincir sonlandırıcı inhibitörlerle DNA dizilimi // Proc. Natl. Acad. Bilim. AMERİKA. 1977. - Cilt. 74. - S.5463 -5467.
170. Savostina E.P., Popov Iu.A., Kashtanova T.N. ve ark. Veba ajanı suşlarının ana alt türlerinin genomik polimorfizmi // Mol. Gen. mikrobiyol. Virüsol. -2009-N4. S.23-27.
171. Sebbane F., Jarrett C.O., Gardner D. ve diğerleri. Yersinia pestis plazminojen aktivatörünün, pire kaynaklı vebanın farklı septisemik ve hıyarcıklı formlarının görülme sıklığındaki rolü // Proc.Natl. AcadlSci.USA. 2006. - V.103, N 14 - P.5526 - 5530.
172. Sebbane F., Jarrett G.O., Linkenhoker J.R., Hinnebusch B.J. Pire vektörünün ve "memeli konakçının" Yersinia pestis enfeksiyonunda kurucu izositrat liyaz aktivitesinin rolünün değerlendirilmesi // Infect ve Immun. - 2004. V. 72, N 12. - P. 7334-7337.
173. Örnek C., Çelik M. / Filogenetik. Oxford University Press, 2003. - 256 P
174. Simonet M., Riot B., Fortineau N., Berche P. Yersinia pestis'in invasin üretimi, inv geni // Infect Immun'a IS200 benzeri bir elementin eklenmesiyle ortadan kaldırılır. 1996. - V.64(1). - S.375 - 379.
175. Skrzypek E., Straley S.C. lcrV'deki delesyonların V antijeninin salgılanması, düşük Ca2+ yanıtının düzenlenmesi ve Yersinia pestis II J. Bacteriol'un virülansı üzerindeki farklı etkileri. 1995. - V. 177(9). - S.2530 - 2542.
176. Song Y., Tong Z., Wang J. ve diğerleri, İnsanlara karşı avirülent bir izolat olan Yersinia pestis suşu 91001'in tam genom dizisi // DNA Res. 2004. - V.11 (3). -P. 179-197.
177. Stenseth N.C., Atshabar B.B., Begon M. ve diğerleri. Veba: geçmiş, bugün ve gelecek // PLoS Med. 2008. - V.5(1)., e3.
178. Straley ve diğerleri, Yersinia'da gen ekspresyonunun ve patogenezinin çevresel modülasyonu // Trends Microbiol. 1995. - V.3(8). - S.310 - 317.
179. Sun Y.C., Hinnebusch B.J., Darby C. Yersinia pestis psödogeninin evriminde negatif seçilimin deneysel kanıtı // Proc. Natl. Acad. Sei. AMERİKA. 2008. V.105, N 2. - S.8097 - 8101.tyf
180. Surgalla M.J., Beesley E.D. Pasteurella pestis'te pigmentasyonu tespit etmek için Kongo kırmızı-agar kaplama ortamı // Appl. Mikrobiyol. - 1969. V. 18(5). - S.834-837.
181. Tahir Y., Skurnik M. YadA, Çok Yönlü Yersinia Adhesin // Int. J. Med. Mikrobiyol. 2001. - V. 291(3). - S.209 - 218.
182. Takahashi H., Watanabe H. Veba // Nippon Rinsho. 2007. - V. 65. - S. 54-59.
183. Tiball R.W., Hill J., Lawton D.J., Brown K.A. Yersinia pestis ve veba I I Biochem. Sos. Trans. 2003. - V. 31. - S. 104 - 107.
184. Weerasingle J.P., Dong T., Schertzberg M.R. ve ark. Escherichia coli II BMC Mikrobiyolojisinde arginin biyosentetik operonu argCBH'nin sabit faz ifadesi. 2006. - V. 6. - S. 14 - 26.
185.Williamson ED. Veba. // Aşı. 2009. - V. 4. - S. 56 - 60.
186.Wren B.W. Mikrobiyal genom analizi: virülansa dair içgörüler. Konak adaptasyonu ve evrimi // Nature Rev. Genet. 2000. - V. 1. - S. 30 - 39.
187.Wren B.W. Yersinia, bakteriyel patojenin hızlı evrimini incelemek için model bir cins//Doğa incelemeleri. Mikrobiyoloji. 2003.-V.l. - S.55-64.
188. Worsham P.L., Roy C. Plazminojen aktivatörü içermeyen bir Yersinia pestis suşu olan Pestoides F, aerosol yoluyla öldürücüdür // Adv. Exp. Med. Biyol. 2003. - V. 529. -P. 129-131.
189. Xiong Jin / Temel biyoenformatik. Cambridge Üniv. basmak. 2006. 361 s.
190. Zhou D., Han Y., Song Y. ve diğerleri. Yersinia pestis II Microbes Infect'in karşılaştırmalı ve evrimsel genomiği. 2004. - V.6(13). - S.1226 - 1234.
191. Zhou D., Tong Z., Song Y. ve diğerleri. Yersinia pestis biyovarları arasındaki metabolik varyasyonların genetiği ve yeni bir biyovar önerisi, microtus // J. Bacteriol. -2004. V. 186. - S. 5147 - 5152.
Yukarıda sunulan bilimsel metinlerin yalnızca bilgilendirme amaçlı olarak yayınlandığını ve orijinal tez metni tanıma (OCR) yoluyla elde edildiğini lütfen unutmayın. Bu nedenle kusurlu tanıma algoritmalarıyla ilişkili hatalar içerebilirler.
Teslim ettiğimiz tez ve özetlerin PDF dosyalarında bu tür hatalar bulunmamaktadır.
Yersinia pestis'in ana ve küçük alt türleri
02/03/03 – mikrobiyoloji
akademik derece için tezler
biyolojik bilimler adayı
Saratov – 2010 2
Çalışma, Federal Devlet Kurumu “Tüketici Haklarının Korunması ve İnsan Refahının Denetlenmesi Federal Servisi'nin Rusya Veba Karşıtı Araştırma Enstitüsü “Mikrop”ta gerçekleştirildi.
Bilimsel denetçiler:
Rusya Tıp Bilimleri Akademisi Sorumlu Üyesi, Tıp Bilimleri Doktoru, Profesör Vladimir Viktorovich Kutyrev Biyolojik Bilimler Doktoru, Kıdemli Araştırmacı Galina Aleksandrovna Eroshenko
Resmi rakipler:
Biyolojik Bilimler Doktoru, Profesör Lidiya Vladimirovna Karpunina Tıp Bilimleri Doktoru Natalya Ivanovna Mikshis
Lider organizasyon: Rusya Tıp Bilimleri Akademisi'nin kurulması “Fahri Akademisyen N.F.'nin adını taşıyan Epidemiyoloji ve Mikrobiyoloji Araştırma Enstitüsü. Gamaleya RAMS"
Savunma, Federal Devlet Kurumu “Rusya Veba Karşıtı Araştırma Enstitüsü “Mikrop”ta (410005, Saratov, Universitetskaya) doktora ve aday tezlerinin savunması için tez konseyinin D 208.078.01 toplantısında “_”2010_hours yapılacaktır. St., 46).
Tez, Federal Devlet Kurumu “Rusya Veba Karşıtı Araştırma Enstitüsü “Mikrop” bilimsel kütüphanesinde bulunabilir.
Tez konseyinin bilimsel sekreteri, Biyolojik Bilimler Doktoru, kıdemli araştırmacı A.A. Sludsky
İŞİN GENEL ÖZELLİKLERİ
Alaka düzeyi sorunlar. Veba, bulaşıcı bir patojen bulaşma mekanizmasına sahip, zoonotik, doğal bir odak noktasıdır, özellikle tehlikeli karantina bakteriyel bulaşıcı hastalıktır [Cherkassky, 1996]. Veba, bazıları Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerde bulunan çok sayıda doğal veba odağının varlığı nedeniyle nüfus için gerçek bir tehdit oluşturmaktadır [Onishchenko ve diğerleri, 2004]. Veba patojeninin, bu hastalıktan etkilenmeyen komşu ülkelerden ve ayrıca biyoterörist eylemlerin bir sonucu olarak Rusya'ya girme olasılığı yüksek. Dünya Sağlık Örgütü'ne göre, dünya çapında her yıl 2.000'den fazla veba vakası kaydediliyor ve bunların çoğu ölümcül. 2009 yılında Çin'in Hainan Tibet Özerk Bölgesi'nde büyük bir pnömonik veba salgını meydana geldi ve bu salgında çok sayıda ölüm de rapor edildi. Tüm bu gerçekler, veba patojenini teşhis etmek için modern teknolojilere dayanan yeni, son derece etkili yöntemlerin ve neden olduğu özellikle tehlikeli hastalığın önlenmesi ve tedavisine yönelik araçların acilen geliştirilmesini gerektirmektedir.Şu ana kadar kullanılan Yersinia pestis sınıflandırmalarında yalnızca morfolojik, kültürel, biyokimyasal ve diğer fenotipik özellikler dikkate alınmıştır [Bezsonova, 1928; Borzenkov, 1938; Tumansky, 1957; Timofeeva, 1968; Kutyrev, Protsenko, 1998; Devignat, 1951] ve bu özelliklerin değişkenliğiyle ilgili dezavantajlar da vardı. Bununla birlikte, temel genetik ve moleküler mikrobiyolojideki son gelişmeler, vebaya neden olan ajanın sistematik hale getirilmesi sorunlarının çözümünün, moleküler genetik özelliklerinin kullanımına dayalı olarak niteliksel olarak yeni bir düzeye taşınmasını mümkün kılmaktadır.
Şu anda kabul edilen yerli sınıflandırmaya göre, veba patojeninin türleri ana ve 4 küçük (Kafkas, Altay, Gissar ve Ulegey) alt türe ayrılmıştır [Timofeeva, 1985; Kutyrev, Protsenko, 1998]. Yaygın yabancı sınıflandırmaya göre, Y. pestis türleri, bir takım biyokimyasal özelliklerdeki (gliserolü fermente etme, nitratları azaltma ve amonyağı oksitleme yeteneği) farklılıklara ve tarihsel ve coğrafi temele dayalı olarak üç biyovara bölünmüştür: antiqua (antik), ortaçağ (ortaçağ) ve orientalis (Doğu). Fenotipik özelliklere göre, ana alt türün türleri, yabancı sınıflandırmada kabul edilen üç biyovara (antik, ortaçağ ve doğu) karşılık gelir. Ancak Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerdeki doğal veba odaklarında dolaşan Y. pestis suşları, spesifik biyovarlara ait olmalarına göre sistematize edilmemiştir.
Diferansiyel olarak önemli biyokimyasal özelliklerin ifadesi açısından en aktif olanı antik biyovarın suşlarıdır. Gliserol fermente ederler ve denitrifikasyon aktivitesine sahiptirler. Ortaçağ biyovarı Y suşları.
pestis nitratları indirgeme yeteneğine sahip değildir, ancak gliserol ve arabinozu fermente edebilir.
Doğu biyovarının türleri gliserolü fermente etmez, ancak aktif olarak nitratları azaltır ve arabinozu kullanır.
Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerde dolaşan ana alt türlerin türleri, kural olarak oldukça öldürücüdür ve yüksek salgın önemine sahiptir. Ramnoz ve melibiyozu fermente etmezler, pestisin I'e duyarlı değildirler ve yüksek düzeyde izositralaz üretimine sahiptirler. Minör alt türlerin suşları ramnoz ve melibiyozu fermente eder, pestisin I'e duyarlıdır, izositrat-liyaz aktivitesi sergilemez, laboratuvar hayvanları için seçici olarak öldürücüdür ve epidemik önemi azdır.
Y. pestis suşlarının biyovarlara ve alt türlere bölünmesinde kullanılan biyokimyasal özelliklerin farklı ifadesinin genetik nedenleri bugüne kadar yeterince araştırılmamıştır. Güvenilir bir şekilde tespit edilen tek şey, doğu biyovarının suşlarında gliserol fermantasyonu eksikliğinin nedeninin, gliserol-3-fosfat dehidrojenaz (glpD) genindeki bir mutasyon olduğudur. Doğu biyovarının tüm suşlarının bu gende 93 bp'lik bir delesyona sahip olduğu gösterilmiştir. . Literatürde nitratların indirgenmesini ve ramnoz fermantasyonunu kodlayan ana ve minör alttürlerin Y. pestis genlerinin yapısındaki farklılıkların belirlenmesine yönelik sadece birkaç çalışma bulunmaktadır [Kukleva ve ark., 2008;
2009; Anisimov ve diğerleri, 2004; Zhou ve diğerleri, 2004].
Veba mikrobu türlerinin beslenme ihtiyaçları açısından heterojen olmasının nedenleri bilinmemektedir. Farklı doğal veba odaklarından gelen suşlar, Y. pestis suşlarını farklı doğal veba odaklarından ayırmak için bir genetik şemada kullanılabilen, ara metabolizma genlerindeki bozukluklarla belirlenen beslenme ihtiyaçları bakımından farklılık gösterir.
Mikrobiyolojik ve biyokimyasal özelliklerin farklı ifadesinin altında yatan genlerin yapısındaki değişikliklerin tanımlanması, veba patojeninin suşlarını sınıflandırmak için bir genetik şema oluşturmak ve ayrıca Y'nin tür içi evriminin ana yönlerini belirlemek için güvenilir bir temel oluşturacaktır. pestis.
İşin amacı. Veba patojeni suşlarını alt türlere ve biyovarlara bölmek için kullanılan biyokimyasal özelliklerin farklı ekspresyonunun genetik temelinin belirlenmesi.
Araştırma hedefleri:
Çalışmada kullanılan, Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerdeki doğal veba odaklarından izole edilen Y. pestis suşlarının, ikiye bölünmesinin altında yatan biyokimyasal özelliklerine (nitrat indirgemesi, izositrat liyaz üretimi, arabinoz ve melibiyozun fermantasyonu) göre karakterize edilmesi. alt türler ve biyovarlar. Rusya'da ve komşu ülkelerde dolaşan suşların belirli biyovarlara ait olup olmadığını belirlemek.
Nitrat indirgemesi ve arabinoz fermantasyonu gibi biyovarlara bölünmede kullanılan diferansiyel özellikleri kodlayan genlerin yapısal ve fonksiyonel organizasyonunu incelemek.
Veba patojeninin ana ve küçük alt türlerinin farklılaşmasının altında yatan melibiyoz fermantasyonunu ve izositrat liyaz üretimini belirleyen Y. pestis genlerindeki değişiklikleri tanımlamak.
Kafkas alt türlerinin Y. pestis suşlarının beslenme ihtiyaçlarını belirlemek ve oksotrofilerinin genetik temelini oluşturmak.
Y. pestis suşlarının tür içi sınıflandırmasına yönelik bir genetik şema oluşturmak ve bu patojenin tür içi evriminin ana yönlerini belirlemek için elde edilen sonuçları kullanma olasılığını değerlendirmek.
Bilimsel yenilik iş. Karmaşık mikrobiyolojik, biyokimyasal ve genetik analizlerden elde edilen verilere dayanarak, Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerin doğal odaklarında dolaşan veba patojeni türlerinin eski ve ortaçağ biyovarlarına ait olduğu tespit edildi.
Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerde dolaşan ana alt türlerin bazı suşlarında nitrat azaltıcı aktivite eksikliğinin nedeninin, periplazmik nitrat redüktaz pozisyonunda tek bir nükleotid ikamesi GT'nin varlığı olduğu ilk kez gösterildi. gen - napA, bu suşların ortaçağ biyovarına ait olduğunu kanıtlıyor. Altay ve Gissar alt türlerinin suşlarında bu özelliğin ekspresyonunun olmayışı, başka bir gen olan ssuA'nın 302. pozisyonuna bir timin nükleotidinin (+T) eklenmesinden kaynaklanır, bu da okuma çerçevesinde bir kaymaya ve veri iletiminin bozulmasına yol açar. Nitratların indirgenmesinde de yer alan kodlanmış taşıma proteini SsuA'nın yapısı.
Y'de arabinoz fermantasyonunun bulunmadığı ilk kez tespit edildi.
Altay ve Gissar alt türlerinin Pestis'i, genin başlangıcından itibaren 773 pozisyonuna bir guanin nükleotidinin (+G) eklenmesini içeren arabinoz operon - araC'nin düzenleyici geninde bir mutasyonun varlığıyla ilişkilidir. gen transkripsiyon arabinoz operonunun başlatılması için gerekli olan, okuma çerçevesindeki bir değişiklik ve düzenleyici protein AraC'nin yapısının bozulması.
İlk kez, ana ve küçük alt türlerin veba patojeni suşlarında izositrat liazının farklı üretiminin genetik temeli, düzenleyici gen iclR'ye iki nükleotidin (+CC) eklenmesinin varlığıyla ilişkilendirildi. 269. pozisyonda, bu, kendisi tarafından kodlanan asetat operonu IclR'nin baskılayıcı proteininin inaktivasyonuna yol açar ve ana alt türlerin suşlarında izositrat liyaz enziminin kurucu sentezinin nedenidir. Küçük alt türlerin suşları sağlam bir iclR geni içerir ve izositrat liyazın yapısal sentezini gerçekleştiremez.
Ana alt türün Y. pestis suşlarında melibiyoz fermantasyonunun bulunmamasının, galaktosid permeaz enzimini kodlayan melB genine IS285 yerleştirme dizisinin dahil edilmesinden kaynaklandığı gösterilmiştir. Küçük alt türlerin suşlarında, melB genine IS285 girişi yoktur.
İlk defa, Kafkas alt türlerinin oksotrofisinin genetik temeli tanımlandı; bu, IS100 yerleştirme dizilerinin argA ve aroF genlerine 10 bp'lik bir yerleştirme ile dahil edilmesiyle ilişkilidir. aroG genine bir timin nükleotidinin thiH genine eklenmesi ve 13 bp'nin silinmesi. thiG geninde.
Ana ve küçük alt türlerin Y. pestis suşlarının, alt türlere ve biyovarlara bölünmenin altında yatan biyokimyasal özellikleri kodlayan genler tarafından elde edilen moleküler özellikleri, veba patojeninin intraspesifik sınıflandırması için bir genetik şemanın geliştirilmesinin temelini oluşturur.
Çalışmanın sonuçlarına göre “Veba patojen suşlarının alt türlerinin dizileme yoluyla belirlenmesine yönelik yöntem” (No. 2009116913. Rüçhan tarihi 14 Mayıs 2009. Patent verilmesi kararı alınmıştır) ve “Yöntem için yöntem” buluşu için başvurular yapılmıştır. çok lokuslu dizi tiplemesi kullanılarak Yersinia pestis suşlarının alt tür farklılaşması (No. 2009146094) 12/11/2009 tarihli öncelik).
Pratik önemi iş. Çalışmanın sonuçlarına dayanarak metodolojik öneriler hazırlandı ve onaylandı: “Rhamnoz ve arabinozun fermantasyonunu kontrol eden rhaS ve araC genlerinin dizilenmesine dayalı olarak veba patojen suşlarının alt türlerinin belirlenmesi” (RosNIPCI direktörü tarafından onaylandı) “Mikrop”. 16 Haziran 2009 tarihli Protokol No. 6) ve “Çok odaklı dizi tiplemesi kullanılarak Yersinia pestis alt türlerinin belirlenmesi (RosNIPCI “Mikrop” direktörü tarafından onaylanmıştır. 23 Şubat 2010 tarihli Protokol No. 1).
Devlet Patojenik Bakteri Koleksiyonunda üç suş kaydedilmiştir: Altay'dan Y. pestis KM 910, Gissar'dan KM 596 ve Ulegey alt türlerinden KM 1861, bu alt türlerin referans suşları olarak.
Çalışma sırasında elde edilen Y. pestis suşlarının genetik organizasyonuna ilişkin veriler, RosNIPCI "Mikrop"ta uzmanlık ve ileri eğitim kurslarında "Vebaya Neden Olan Ajanın Genetiği" konulu dersler verilirken kullanıldı.
Savunma hükümleri:
1. Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerin doğal odaklarında dolaşan ana alt türlerin veba patojeninin suşları, bu suşların mikrobiyolojik, biyokimyasal ve genetik özelliklerinin kapsamlı bir analizinden elde edilen verilerle kanıtlandığı üzere, eski ve ortaçağ biyovarlarına aittir.
2. Y. pestis suşlarının alt türlere ve biyovarlara bölünmesinde kullanılan biyokimyasal özelliklerin farklı tezahürlerinin temeli, bu özellikleri kodlayan genlerdeki farklı mutasyon türleridir. Ortaçağ biyovarının ana alt türlerinin suşlarında nitratları azaltma yeteneğinin olmaması, periplazmik nitrat redüktazın napA geninde ve Altay ve Gissar alt türlerinin suşlarında anlamsız mutasyonun (G T) varlığıyla ilişkilidir. Periplazmik taşıma proteini SsuA'nın ssuA genine tek bir nükleotidin eklenmesi. Altay ve Gissar alt türlerinin suşlarında arabinoz fermantasyonunun bulunmaması, araC gen dizisine bir guanin nükleotidinin eklenmesinden kaynaklanmaktadır.
3. Veba patojeninin ana ve küçük alt türlerinin suşlarının bir takım farklı özelliklere göre farklı biyokimyasal aktiviteleri, onları ana alt türlerde kodlayan genlerin azalmasından ve küçük alt türlerdeki sağlamlıklarından kaynaklanır.
Ana alt türlerin suşları tarafından melibiyoz fermantasyonunun bulunmaması, IS285'in melB galaktosid permeaz genine dahil edilmesinden kaynaklanmaktadır ve bu alt türün suşlarında izositrat liazın yapısal sentezi, iki nükleotidin (CC) hücre içine yerleştirilmesinden kaynaklanmaktadır. iclR düzenleyici gen dizisi. Küçük alt türlerin suşları sağlam melB ve iclR genlerini içerir.
4. Kafkas alt türünün Y. pestis suşlarının çoklu beslenme ihtiyacının nedeni, amino asitlerin ve vitaminlerin biyosentezini sağlayan bir dizi genin etkisizleştirilmesidir. Bu alt türün suşlarının arginin bağımlılığı, argA genine bir IS eklenmesinden kaynaklanır; fenilalanin için ise 10 bp'lik bir eklemeden kaynaklanır. aroG geninde, tirozin için - IS100'ün aroF genine dahil edilmesiyle, tiamin (B1) için 13 bp'nin silinmesiyle. - thiG genine ve tek bir nükleotidin thiH'ye eklenmesi. Kafkas ve diğer alt türlerin suşları için tanımlanmış mutasyonların tüm kompleksinin yanı sıra veba patojeninin biyovarlarına dayanarak, Y. pestis'in tür içi sınıflandırması için bir genetik şema oluşturmak için kullanılabilecek karakteristik genotipler belirlendi.
İşin onaylanması. Tez materyalleri, BDT Üye Devletlerinin IX Eyaletlerarası Bilimsel ve Pratik Konferansında sunuldu ve tartışıldı “Bağımsız Devletler Topluluğu üye devletlerinin topraklarında bulaşıcı hastalıklarla mücadeleye yönelik küresel stratejinin uygulanmasında modern teknolojiler”, Volgograd 2008; VI Uluslararası Konferansı “Moleküler Diagnostik ve Biyogüvenlik”, M., 2009; Federal Tüketici Haklarının Korunması ve İnsan Refahının Denetlenmesi Servisi'nin genç bilim adamları ve uzmanlarından oluşan bilimsel ve pratik okul konferansı “Biyolojik güvenliği sağlamak için modern teknolojiler”, 25 - 27 Mayıs 2010; RosNIPCI “Microbe”un yıllık final konferanslarında, Saratov 2008 - 2010.
Tezin yapısı ve kapsamı. Tez, daktiloyla yazılmış 157 sayfalık bir metin üzerinde sunulmaktadır; bir giriş, bir literatür taraması bölümü, kendi araştırmasının beş bölümü, bir sonuç ve sonuçlardan oluşmaktadır. Eser 11 tablo ve 34 çizimle resimlendirilmiştir. Bibliyografik indeks 203 yerli ve yabancı kaynağı içermektedir.
TEMEL İŞİN İÇERİĞİ
Malzemeler ve yöntemler Bu çalışmada, ana veba patojeni suşu ve Rusya Federasyonu'nda yakın ve uzak yurt dışında izole edilen 50 küçük alt tür suşu da dahil olmak üzere 111 Y. pestis ve Y. pseudotuberculosis suşu kullanıldı. Çeşitli kökenlerden 10 Y. pseudotuberculosis suşu da incelenmiştir. Suşların kültürel, morfolojik ve biyokimyasal özelliklerinin incelenmesi, geleneksel olarak kullanılan yöntemler kullanılarak gerçekleştirildi [Tehlikeli Bulaşıcı Hastalıkların Laboratuvar Teşhislerine Yönelik Pratik Kılavuz, 2009]. Y. pestis suşlarından DNA izolasyonu, M.U.'da verilen prosedüre uygun olarak standart bir yöntem kullanılarak gerçekleştirildi.1.3.2569-09 “Patojenite grubu I - IV'ün mikroorganizmalarını içeren materyalle çalışırken nükleik asit amplifikasyon yöntemlerini kullanan laboratuvarların çalışmalarının organizasyonu.” PCR ile elde edilen ürünlerin analizi %0,8 – 2 agaroz jelde T. Maniatis ve ark. . Genlerin nükleotid dizilerinin belirlenmesi, F. Sanger'in yöntemine göre bir genetik analizör modeli “CEQ 8000” (Beckman Coulter) üzerinde gerçekleştirildi. Y. pestis ve Y. pseudotuberculosis genomlarının ve büyüme faktörlerinin biyosentezine yönelik metabolik yolların karşılaştırmalı analizi, NCBI GenBank ve KEGG Metabolik Yollar veritabanlarının BLAST algoritması kullanılarak gerçekleştirildi. Suşların filogenetik analizi Mega 4.0, PHYLIP ve SplitsTree4 programları ve uzaklık matrisi yöntemleri kullanılarak yapıldı: UPGMA, FITCH, Kitch, Neighbor-Joining, Minimum Evolution.
ARAŞTIRMA SONUÇLARI
1. Çeşitli doğal veba odaklarından ana ve küçük alt türlerin Y. pestis suşlarının mikrobiyolojik ve biyokimyasal özelliklerinin analizi. Çalışmada kullanılan tüm Y. pestis suşları, biyokimyasal aktiviteleri açısından incelenmiştir: nitratları azaltma yeteneği, fermantasyon. Gliserol, arabinoz, melibiyoz, ramnoz, izasitrat liyaz üretimi – alt türlere ve biyovarlara bölünmede kullanılan özellikler. Ana alt türün incelenen tüm suşlarının - Y. pestis ssp. pestis ramnoz ve melibiyozu fermente etmedi ancak izositrat liyazı üretti. Buna karşılık, küçük alt türlerin tüm Y. pestis suşları, ramnoz ve melibiyozu fermente etti, ancak izositrat liyaz üretmedi. Elde edilen bilgiler, veba patojeninin ana ve küçük alt türlerini ayırt etmek için kullanılan Y. pestis suşlarının biyokimyasal özelliklerine ilişkin literatür verileriyle ilişkilendirildi.Y. pestis suşlarının biyovarlara bölünmesinde kullanılan biyokimyasal özellikleri incelerken - nitratların azaltılması, arabinoz ve gliserolün fermantasyonu, ana ve küçük alt türlerin suşlarında bu özelliklerde heterojenlik tespit edilmiştir. Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerde izole edilen ana alt türlerin bazı türleri nitratları azaltmadı, bu da bunların bir ortaçağ biyovarına ait olduklarını gösterdi. Altay, Gissar ve Ulegei gibi küçük alt türlerin türleri de nitratları azaltmazken, Kafkas türleri bu özellik açısından pozitif sonuç verdi.
İkinci ayırıcı özelliğe göre - arabinozun fermantasyonu, çalışmada incelenen ana, Kafkas ve Ulega alt türlerinin tüm Y. pestis suşları homojendi ve bu monosakkaritten yararlandı. Altay ve Gissar alt türlerinin türleri arabinozu fermente etmedi ve bu özelliğin farklı ifadesinin genetik temeli bilinmiyordu.
Gliserol fermente etme yeteneğinin olmayışı (başka bir diferansiyel biyokimyasal özellik), biovar orientalis suşlarının karakteristik bir özelliğidir. Bununla birlikte, Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerde bu tür suşların sürekli dolaşımına sahip hiçbir odak tespit edilmemiştir. Literatürde Y. pestis'in izole gliserin negatif suşlarının bu bölgelerde izolasyonu hakkında sadece izole raporlar bulunmaktadır [Sagymbek ve ark., 2003; Onishchenko ve diğerleri, 2004].
Biovar orientalis suşlarının karakteristik bir genetik işareti 93 bp'lik bir delesyondur. glpD geninde – gliserol-3-fosfat dehidrojenaz.
Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerdeki doğal veba odaklarından elde edilen tüm Y. pestis suşlarının, glpD geninde oryantal biovarın 93-bp'lik delesyon özelliğini içermediğini bulduk; bu da aralarında orientalis biovar suşlarının bulunmadığını doğruluyor (Şekil 1). ). Bu tür suşlar yalnızca yabancı ülkelerden elde edilen izolatlar arasında tespit edildi.
Şekil 1. Y. pestis suşlarının glpD genine yönelik primerlerle PCR analizi: 1 – 16 – Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerdeki doğal veba odaklarından ana alt türlerin suşları; 17 – 19 – yabancı ülkelerden gelen doğu biyovarının türleri; 20 – negatif kontrol.
Oklar, oluşturulan amplifikatörlerin boyutlarını gösterir.
Bu nedenle, Rusya Federasyonu topraklarında ve komşu ülkelerde izole edilen, biyokimyasal özellikler kompleksine (gliserol fermantasyonu, nitrat indirgemesi) göre incelediğimiz Y. pestis suşları, genel kabul görmüş görüşle tutarlı olan eski ve ortaçağ biyovarlarına aittir. Bu biyovar türlerinin kıtasal veba odaklarıyla sınırlı olduğu ve doğu biyovar türlerinin ise okyanus kıyıları boyunca yer alan sıçan türü odaklarla sınırlı olduğu ortaya çıktı.
Bu çalışma sırasında, Kafkasya alt türlerinin veba patojeni türlerinin incelenmesine çok dikkat edildi, çünkü bir dizi araştırmacıya göre [Bobrov, Filippov, 1997], bunlar vebanın hayatta kalan türlerinin en eskileriydi. patojendir ve selefi Y'ye en yakın olanıdır.
psödotüberküloz. Biyokimyasal özellikler açısından bu alt türün suşlarının Y. pestis'in tüm alt türleri arasında en aktif olduğu ortaya çıktı. Nitrat azaltıcı aktiviteye ve fermente gliserol, arabinoz, ramnoz ve melibiyoza sahiplerdi. Literatürde bu alt türe ait türlerin beslenme ihtiyaçları konusunda çelişkili veriler bulunduğundan [Martinevsky, 1969; Aparin, Golubinsky, 1989], Kafkas alt türlerinin beslenme ihtiyaçlarını açıklığa kavuşturmak için araştırma yaptık.
Kafkas alt türlerinin incelenen tüm suşlarının oldukça düzgün davrandığı tespit edildi. Amino asitlere (fenilalanin, tirozin, arginin ve B1 vitamini (tiamin)) ihtiyaç olduğunu belirlediler. Bu büyüme faktörlerine yönelik gereksinimlere ek olarak, Doğu Kafkasya yüksek dağ vebası odağındaki suşlar da lösine bağımlılık gösterirken, Leninakan, Prisevan, Zengezur-Karabağ ve Araksin doğal odaklarındaki Kafkas alt türlerinin suşlarında lösine bağımlılık görülmedi. böyle bir bağımlılık.
Kafkas alt türü suşlarının amino asitler ve B1 vitamini (tiamin) içindeki oksotrofisinin nedenleri bilinmediğinden, daha sonra bu alt tür suşlarının oksotrofisinin genetik temeli üzerine bir çalışma yaptık.
2. Veba patojeninin biyovarlarını ayırt etmek için kullanılan biyokimyasal özellikleri kodlayan genlerin yapısal ve fonksiyonel organizasyonunun belirlenmesi Nitratları azaltma yeteneğinin bulunmaması, onları suşlardan ayıran, ortaçağ biyovarının Y. pestis suşlarının karakteristik bir özelliğidir. antik ve doğu biyovarlarının Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerde doğal odaklarda dolaşan veba mikrobunun küçük alt türlerinin türleri de nitrifikasyon aktivitelerinde farklılık göstermektedir. Ancak bu özelliğin onlarda farklı şekilde ortaya çıkmasının genetik nedenleri bilinmemektedir.
Y. genomunun karşılaştırmalı bilgisayar analizine dayanmaktadır.
NCBI GenBank veri tabanında sunulan pestis ve Y. pseudotuberculosis türlerinin incelenmesinde, nitrat indirgemesinde rol oynayan genlerin, aynı yapıya sahip olan ve napA-F ve napP olmak üzere altı genden oluşan nap operonunda birleştirildiği bulunmuştur (Şekil 2). .
Nitratların indirgenmesinde rol oynayan diğer genler de incelenmiştir: sırasıyla düzenleyici protein NarP'yi ve taşıma proteini SsuA'yı kodlayan narP ve ssuA Şekil 2. Y. pestis suşlarındaki nap operonunun yapısı Bir bilgisayar analizi sonucunda, nap operon genleri, bu operonun tüm genlerinde tek nükleotid ikamelerinin varlığı, ancak en önemlisi, daha önce tanımlanan bir periplazmik nitrat redüktaz olan napA geninin başlangıcından itibaren 613. pozisyondaki GT nükleotidinin ikamesiydi. Y. pestis KIM ve ortaçağ biovarının diğer türleri. MEGA 4.0 programı kullanılarak yapılan bilgisayar analizine göre, bu mutasyonun, bir durdurma kodonu olan ve polipeptit zincirinin (204. amino asit kalıntısından sonra) translasyonunun erken sonlandırılmasına neden olan GAA TAA üçlüsünde bir değişikliğe yol açtığı tespit edildi. Bu enzimin molekülü.
Mikrotus biovarın (NCBI GenBank) 91001 suşunda 302 pozisyonunda bir timin nükleotidinin eklenmesini içeren kromozomal gen ssuA'da (gen boyutu - 1123 bp) denitrifikasyon aktivitesinin tezahürü için önemli olan başka bir mutasyon belirledik. Mega 4.0 programı kullanılarak yapılan bilgisayar analizine göre bu mutasyon, okuma çerçevesinin kaymasına ve SsuA proteininin yapısının bozulmasına yol açıyor.
NapA ve ssuA genlerinin değişken bölgeleri için primerler tasarlandı, bu genlerin fragmanlarının yardımıyla PCR'de çoğaltıldı ve ardından nükleotid dizileri belirlendi. Y. pestis suşlarındaki farklı nitrifikasyon aktivitesinin nedenlerini belirlemek için, çeşitli doğal veba odaklarından ana ve küçük alt türlerden 90 Y. pestis suşu ve ayrıca çeşitli kökenlerden 10 Y. pseudotuberculosis suşu üzerinde çalıştık. Analiz sonucunda, Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerde izole edilen ana alt türlerin nitratları azaltamayan suşlarının, biovar ortaçağ suşlarının karakteristiği olan 613 pozisyonunda tek bir nükleotid ikamesi GT'ye sahip olduğu tespit edildi. bir kodon değişikliği (GAA TAA) ve periplazmik nitrat redüktaz molekülünün translasyon polipeptit zincirinin erken sonlanması. Ana alt türlerin incelenen bazı suşlarında, ortaçağ biyovarının genetik bir işareti olan 613 pozisyonunda karakteristik bir nükleotid ikamesinin varlığı, denitrifikasyon aktivitesinin eksikliği ile birlikte, onları bir ortaçağ biyovarı olarak sınıflandırmak için bir temel oluşturur. biyovar.
Aynı zamanda nitratları indirgeyemeyen Altay ve Gissar alt türleri suşlarında napA geninde bu mutasyonun varlığını tespit edemedik. Bu suşlarda denitrifikasyon aktivitesinin bulunmamasının nedeninin, periplazmik taşıma proteini SsuA'nın ssuA geninin 302 pozisyonuna bir timin nükleotidinin yerleştirilmesinden kaynaklanan başka bir mutasyon olduğu bulunmuştur. Bu mutasyon yalnızca Altay ve Gissar alt türlerinin suşlarında değil, aynı zamanda nitratları azaltamayan microtus biovar'ın 91001 suşunda da bulundu.
Veba patojen suşlarının tür içi farklılaşması için kullanılan bir diğer önemli biyokimyasal özellik, arabinoz fermantasyonudur. Ana, Kafkas ve Ulega alt türlerinin tüm suşları bu karbonhidratı kullanabilirken, Altay ve Gissar alt türlerinin suşları ile microtus biovarı bunu kullanamaz. Bununla birlikte, veba patojeninin Altay ve Gissar alt türlerinin suşlarında bu özelliğin ortaya çıkmamasının genetik nedenleri tanımlanamamıştır.
Y. pestis ve Y. pestis genomlarının karşılaştırmalı bilgisayar analizine dayanmaktadır.
psödotüberküloz (NCBI GenBank), veba ve psödotüberküloz mikroplarının tüm suşlarında arabinoz operonunun aynı yapıya sahip olduğu ve altı genden oluştuğu tespit edilmiştir. Beş yapısal gen içerir: araA, araB, araH, araF, araG ve bir düzenleyici gen araC (Şekil 3).
Şekil 3. Y. pestis arabinoz operonunun yapısı Arabinoz operon genlerinin yanı sıra Y. pestis ve Y. pseudotuberculosis (NCBI GenBank) suşlarındaki araD geninin karşılaştırmalı bilgisayar analizi sonucunda, 112 bp'de bir delesyon içeren düzenleyici gen araC'de önemli bir mutasyon olduğunu tespit etti (26 – 137) ve daha önce D. Zhou ve ark. .
Bu genin tam nükleotid dizisini çevreleyen iki örtüşen primer çifti, araC geninin değişken bölgeleri için tasarlandı ve amplifikasyonları PCR ile elde edildi.
Y. pestis'in doğal suşlarında ve Y. pseudotuberculosis'in 10 suşunda gerçekleştirdiğimiz araC geninin tam sekansının dizilenmesi, yalnızca Altay ve Gissar alt türlerinin suşlarının araC geninde bir mutasyona sahip olduğunu ortaya çıkardı. 773 pozisyona bir guanin nükleotidinin eklenmesiyle, diğer alt türlerin suşları ve psödotüberküloz mikroplarının suşları bu genin sağlam bir yapısına sahipti. Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerde izole edilen, incelenen Y. pestis suşlarında microtus biovar suşlarının karakteristiği olan 112 bp'lik bir delesyonun varlığı tespit edilmemiştir.
Böylece, Altay ve Gissar alt türlerinin suşlarında arabinozdan yararlanma yeteneğinin eksikliğinin, araC genine tek bir nükleotidin yerleştirilmesiyle ilişkili olduğunu ilk kez tespit ettik.
3. Vebaya neden olan ajanı, küçük alt türlerin vebaya neden olan ajanın ana ve küçük alt türlerine ayırmada kullanılan diferansiyel özellikleri kodlayan genlerdeki değişikliklerin yanı sıra Y. suşlarının tanımlanması.
psödotüberküloz disakkarit melibiyoza karşı enzimatik aktiviteye sahiptir. Melibiosisten yararlanma yeteneği aynı zamanda Y. pestis biovar microtus suşlarında da bulunmuştur. Buna karşılık, ana alt türlerin son derece öldürücü Y. pestis suşlarının tümü melibiyozu fermente etmez. Bu biyokimyasal aktivitenin eksikliğinin genetik nedenleri hala bilinmemektedir.
NCBI GenBank veritabanında sunulan Y. pestis ve Y. pseudotuberculosis suşlarının genomlarının karşılaştırmalı bilgisayar analizine dayanarak, veba ve psödotüberküloz patojenlerinin melibiyoz operonunun aynı yapıya sahip olduğunu ve üç harfle temsil edildiğini tespit ettik. genler – melA (YP_1469), melB (YP_1470) ve melR (YP_1471) (Şekil 4).
Bu genlerin yapısının analizi sonucunda, MelB taşıyıcı proteini galaktosid permeazı kodlayan yapısal gen melB'de incelenen özelliğin ortaya çıkması için önemli bir mutasyonun olduğu tespit edilmiştir. Ana alt türlerin - CO92, KIM, Antiqua ve Nepal516 (NCBI GenBank) suşlarındaki bu genin nükleotid dizisinde, 73 nükleotidden sonra IS285 adlı bir yerleştirme dizisinin eklenmesi tespit edildi. Buna karşılık, Y. pestis Pestoides F suşu (Kafkas alt türü) ve tüm Y. pseudotuberculosis suşları sağlam bir melB gen yapısına sahiptir.
melB geninin değişken bölgeleri için IS285 ekleme bölgesini çevreleyen bir çift primer tasarlandı ve bu genin bir fragmanı PCR ile amplifiye edildi. Çalışmada kullanılan ana alt türlerin tüm Y. pestis suşlarında (51 suş), bu primer çifti kullanılarak elde edilen amplifikasyonların boyutu 1648 bp idi; bu, IS285'in (1324 bp) melB gen dizisine dahil edildiğini gösterdi. bu suşların melibiyoza karşı enzimatik aktivite eksikliği ile ilişkili olduğu görülmüştür. Ana alt türlerin aksine PCR, ana alt tip olmayan suşlarda daha küçük boyutlu (325 bp) amplifikatörler ortaya çıkardı; bu, melB geninin sağlam yapısını gösterir ve bu disakkariti fermente etme yeteneklerine karşılık gelir (Şekil 5).
Böylece, ana alt türün Y. pestis suşlarının melibiyozu fermente edememesinin nedeninin, IS285 yerleştirmesinden kaynaklanan melB geninin yapısının ihlali olduğunu tespit ettik. Küçük alt türlerin suşları sağlam bir melB geni içerir.
Veba patojeninin ana alt türlerinin suşlarını küçük alt türlerin ve psödotüberküloz mikroplarının suşlarından ayırmak için, ilkinin izositrat liyaz enzimini yapısal olarak sentezleme yeteneği de kullanılır.
Şekil 5. Patojen suşlarında melB geninin PCR analizi: 1 – 3 – Kafkas alt türleri;
4 – 5 Gissar alt türü; 6 – 7 – Altay alt türleri; 8 – Ulegai alt türleri; 9 – 17 – ana alt türler; 18 – negatif kontrol. Solda X174/HincII moleküler ağırlık işaretleri bulunmaktadır.
Ana alt türlerin suşlarının aksine, ana alt tür olmayan Y. pseudotuberculosis ve Y. pestis suşlarının, bu enzimin yapısal sentezini yapamadığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, ana ve ana olmayan alt türlerin suşlarında bu özelliğin ifadesindeki farklılıkların genetik nedenleri şu anda bilinmemektedir.
NCBI GenBank veri tabanında sunulan suşlardaki veba ve psödotüberküloz etkeninin genomları üzerinde yaptığımız analize göre, veba etkeninin tüm suşlarındaki asetat operonunun yapısının aynı olduğu ve üç yapısal gen içerdiği tespit edilmiştir. - iclR geninin negatif regülasyonu altında olan aceA, aceB, aceK (Şekil 6).
Şekil 6. Y. pestis suşlarındaki asetat operonunun yapısı Asetat operon genlerinin karşılaştırmalı bilgisayar analizi, düzenleyici gen iclR'de (843 bp) incelenen özelliğin fenotipik tezahürü için önemli olan bir mutasyonun varlığını göstermiştir. . Y. pestis suşları CO92, KIM, Antiqua, Nepal516'da (ana alt tür), iclR geninin, genin başlangıcından itibaren 269-270 pozisyonlarına iki nükleotidin (+CC) eklenmesiyle etkisiz hale getirildiği bulunmuştur ve bu suşlardaki boyutu 845 bp idi. iclR geninin 269-270 pozisyonlarında tanımladığımız ekleme (+CC), IclR baskılayıcı proteinin polipeptit zincirinin translasyonunun erken sonlandırılmasına yol açar; bu, asetat operonunun genlerinin kurucu ekspresyonunu gerektirir ve sonuç olarak, yüksek düzeyde izositrat liyaz sentezi.
iclR geninin değişken bölgesi için bir çift primer tasarlandı ve bu genin yapısı Y'nin 95 doğal suşunda incelendi.
pestis'in ana ve küçük alt türlerinde ve psödotüberküloza neden olan ajanın 10 suşunda. Kafkas, Altay, Gissar ve Ulega alttürlerine ait Y. pestis'in tüm suşlarında icR gen fragmanlarının nükleotid sekanslarının aynı olduğu ve 370 bp tutarında olduğu bulunmuştur. ve psödotüberküloz mikrop suşlarının benzer sekansına ve ayrıca iclR geninin sıralı bölgesinin sağlamlığını gösteren ve içlerindeki izositrat liyaz enziminin düşük aktivitesi ile ilişkili olan Pestoides F suşuna (NCBI GenBank) tamamen karşılık gelir. Veba patojeninin ana alt türlerinin suşlarında farklı bir tablo bulundu. iclR geninde bir ekleme tanımlandı - 269 - 270 pozisyonlarına iki nükleotidin (+CC) eklenmesi, bu, iclR düzenleyici genin okuma çerçevesinde bir kaymaya ve sonuç olarak yapısal sentezine yol açar. ana alt türün Y. pestis suşlarında izositrat liyaz enzimi.
4. Kafkas alt türlerinin Y. pestis suşlarının oksotrofisinin genetik temelinin oluşturulması Yukarıda gösterdiğimiz gibi, Kafkas alt türlerinin tüm suşları, büyümeleri için amino asitlere ihtiyaç duyar: arginin, tirozin, fenilalanyum ve B1 vitamini - tiamin. Ancak Y. pestis ssp.caucasica suşlarının oksotrofisinin genetik nedenleri henüz araştırılmamıştır.
İlk aşamada, KEGG Metabolik Yollar veri tabanında yer alan Y. pestis ve Y. pseudotuberculosis suşlarında arginin, tirozin, fenilalan ve B1 vitamini (tiamin) biyosentez yolunun bilgisayar analizini gerçekleştirdik ve anahtar enzimleri belirledik. bu büyüme faktörlerinin biyosentezi ve genlerin kodlanması. BLAST algoritması kullanılarak, Y. pestis ve Y. pseudotuberculosis suşlarında (NCBI GenBank) arginin, tirozin, fenilalan ve B1 vitamini (tiamin) biyosentezi için genlerin nükleotid dizilerinin karşılaştırmalı bir analizi gerçekleştirildi. Bilgisayar analizi sonuçlarına göre, Nacetilglutamat sentaz - argA'nın yapısal genindeki Pestoides F suşunda keşfettiğimiz, genin başlangıcından itibaren 196. nükleotidden sonra IS100 ekleme dizisinin eklenmesi olan mutasyon ortaya çıktı. arginin bağımlılığının ortaya çıkması açısından anlamlıdır.
IS100'ün girişini çevreleyen bir çift primer kullanılarak yapılan PCR analizinde, psödotüberkülozun yanı sıra ana, Altay ve Ulega alt türlerinin vebaya neden olan ajanının tüm suşlarında argA geninin üretilen fragmanının boyutunun, 215 bp idi, bu da sağlam bir gen yapısına karşılık geliyordu. Kafkas alt türünün Y. pestis suşlarındaki argA geninin parçaları, IS100 eklemesinin varlığına bağlı olarak büyük bir moleküler ağırlığa (2143 bp) sahipti ve bu da genin inaktivasyonuna yol açtı.
Aromatik amino asitlerin biyosentezinde yer alan genlerin analizi, Pestoides F suşunda DAGPS izoenzimini (3-deoksi-Darabinoheptulosonat-7-fosfat sentaz) kodlayan aroG geninin (1053 bp) 10'luk bir eklemeyle etkisiz hale getirildiğini gösterdi. nükleotidler (820 – 829 pozisyonlarında), okuma çerçevesinde bir kaymaya ve fenilalanin sentezinin bozulmasına yol açar.
Ana ve küçük alt türlerin 95 doğal suşunda aroG fragmanı dizilirken, ana, Altay, Gissar ve Ulegey alt türlerinin veba mikrobu suşlarında bu genin sağlam bir yapıya sahip olduğu ve işlevsel olarak aktif DAGPS proteinini kodladığı bulunmuştur. -. Buna karşılık, Y. pestis'in Kafkas alt türünün suşlarında, aroG geninde 10 bp'lik bir ekleme bulundu. 820-829 pozisyonlarında, okuma çerçevesinde bir kaymaya ve enzim yapısının bozulmasına yol açar.
Kafkas alt türlerinin tüm suşlarında bu mutasyonun varlığı, bunların fenilalanin sentezleme yeteneğinin eksikliği ile ilişkilidir.
Pestoides F suşunda DAGPSTyr izoenzimini kodlayan başka bir yapısal gen olan aroF (1071 bp), genin başlangıcından itibaren 888 nükleotidden sonra IS100 yerleştirme dizisinin eklenmesiyle etkisiz hale getirilir ve bu, tirozin sentezleme yeteneğinin kaybına neden olur. PCR analizinde ana, Altai, Gissar ve Ulegei alt türlerinin suşları, genin sağlam yapısına karşılık gelen 563 bp boyutunda aroF geninin amplifikatörlerini üretti. Kafkas alt türlerinin suşlarında, PCR'de aroF geninin spesifik bir amplifikasyonu oluşmadı; bu, IS100 yerleştirme dizisinin dahil edilmesinden sonra fragmanının kaybına işaret etti ve metabolik yol için genlerin yapısal analizi ile korele oldu. B vitamini (tiamin) biyosentezinin incelenmesi, Pestoides F suşunda 13 bp'lik bir delesyonla etkisiz hale getirilen tiyazol sentaz - thiG ve thiH enzimlerini kodlayan genlerde önemli mutasyonların varlığını gösterdi.
384 – 396 pozisyonlarına ve 552 pozisyonuna bir timin nükleotidinin (+T) eklenmesi.
Y. pestis'in doğal suşlarındaki thiG ve thiH fragmanlarının dizilimi, ana Altay, Gissar ve Ulegei alt türlerinin suşlarında bu genlerin sağlam yapısını ortaya çıkardı; bu da onların B1 vitamini sentezleme yetenekleriyle ilişkiliydi. Diğer alt türlerden farklı olarak Kafkas alt türlerinin suşları, thiH geninin 552. pozisyonuna bir timin nükleotidinin eklenmesini ve 13 bp'lik bir delesyonu sergiledi. thiG geninin 384-396 pozisyonlarında, bu onların tiamin sentezleme yeteneklerindeki eksiklikle çakıştı.
Böylece Kafkas alt türünün Y. pestis suşlarının oksotrofisinin genetik temelini ilk kez belirledik. Arginin için oksotrofinin, IS100'ün argA genine eklenmesiyle, fenilalanin için - nükleotidlerin aroG'ye eklenmesiyle, tirozin için - IS100'ün aroF'ye eklenmesiyle, B1 vitamini için - 13 bp'lik bir delesyonla kaynaklandığı tespit edilmiştir. thiG'de ve thiH'de bir timin nükleotidinin eklenmesiyle. Bu tür mutasyonlar diğer alt türlerin (ana, Altay, Gissar ve Ulegei) Y. pestis suşlarında meydana gelmez ve bu nedenle Kafkas suşlarının karakteristik genetik işaretleri olarak kullanılabilir.
5. Veba patojeninin tür içi sınıflandırmasına yönelik bir genetik şema oluşturmak için elde edilen verileri kullanma olasılıklarının değerlendirilmesi Araştırmamızın sonucunda, Y. pestis'in bölünmesinde kullanılan biyokimyasal özelliklerin farklı ifadelerinin genetik temelini oluşturduk. suşlar alt türlere ve biyovarlara ayrılır. Bu çalışma sırasında tanımlanan napA, ssuA, araC, melB, iclR, argA, aroH, aroF, thiH ve thiG genlerinin değişkenliği, glpD geninin önceden belirlenmiş değişkenliği ve rhaS düzenleyici genin değişkenliği Ramnoz operonunun analizi [Kukleva ve diğerleri, 2008] veba patojen suşlarını biyovarlar ve alt türler halinde sınıflandırmak için bir genetik şemanın temeli olarak kullanılabilir. Bu genlerin dizilerinin karşılaştırmalı analizine dayanarak, Y. pestis'in ana (antik, ortaçağ, doğu biyovarları) ve küçük alt türlerinin karakteristik genetik özelliklerini belirledik (tablo). Y. pestis türlerinin evrimsel ilişkilerini belirlemek ve uzaklık matrisi kullanan Mega 4.0, PHYLIP, SplitsTree 4 bilgisayar programlarını kullanarak filogenetik ağaçlar oluşturmak için diferansiyel biyokimyasal özellikleri kodlayan genlerin nükleotid sekanslarının değişkenliğini ve ayrıca çeşitli büyüme faktörlerinin biyosentezini kullandık. yöntemler: UPGMA, FitchMargulis ağırlıklı ortalama kareler, Kitch, Komşu-Birleştirme.
Masa. Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerin doğal odaklarından gelen ana ve küçük alt türlerin Y. pestis suşlarının genetik özellikleri.
Ana p/v Şekil 7'de belirtildiği gibi, seçilen DNA hedeflerinin kullanılması, veba ve psödotüberküloz patojenlerinin suşlarının tamamen ayırt edilmesini ve ayrıca Y. pestis suşlarının yalnızca biyovarlara ve ana ve küçük alt türlere ayrılmasının yanı sıra intraspesifik bölünmesini de mümkün kılar. ama aynı zamanda bu patojenin ayrı alt türlerine de ayrılır.
Filogenetik verilerin analizi, veba mikropunun evriminin en eski dalının, selefi psödotüberküloz mikrobuyla en büyük genetik benzerliğe sahip olan Kafkas alt türlerinin türleri olduğu yönünde daha önce belirtilen varsayımı doğrulamaktadır (Şekil 8).
Diğer küçük alt türler - Altay, Gissar ve Ulega filogenetik olarak birbirine yakındır ve Y. pestis'in evriminin bir başka eski dalını oluşturur.
Verilerimiz, Çinli araştırmacıların yakın zamanda ayrı bir biyovar olarak tanımlamayı önerdiği microtus suşlarının, Altay ve Gissar alt türlerinin suş grubuna ait olduğunu ve bunların çeşidi olduğunu gösteriyor.
Şekil 7. Ana (antik, ortaçağ, doğu biyovarları) ve minör (Kafkas, Altay, Gissar, Ulegey) alt türlerinin Y. pestis suşlarının dendrogramları (Mega 4.0 programı, yöntemler: A - UPGMA ve B -Komşu Birleşmesi) Y. pseudotuberculosis suşlarının yanı sıra.
Şekil 8. Y. pestis'in tür içi evrim şeması Bu çalışmada yürütülen çalışmalar, veba patojeninin moleküler taksonomisinin geliştirilmesinin temelini oluşturmaktadır; bunun amacı, Y. pestis'in tam bir tür içi tür içi taksonomisini oluşturmaktır. veba mikropunun diferansiyel olarak önemli mikrobiyolojik ve biyokimyasal özelliklerine ilişkin genlerin değişkenliği.
SONUÇLAR
1. Çeşitli doğal veba odaklarından doğal Y. pestis suşlarının biyokimyasal ve genetik özelliklerinin kapsamlı bir analizine dayanarak, Rusya Federasyonu ve komşu ülkelerde dolaşan ana alt türlerin suşlarının eski ve ortaçağ biyovarlarına ait olduğu tespit edilmiştir.2. Diferansiyel bir biyokimyasal özelliğin ifadesinin bulunmamasının nedeni - Rusya ve komşu ülkelerdeki doğal veba odaklarında izole edilen ana alt türlerin Y. pestis suşlarında nitrat azalması, bir mutasyonun varlığıdır - tek bir nükleotidin değiştirilmesi periplazmik nitrat redüktazın napA geninde ve Altay ve Gissar alt türlerinin suşlarında - periplazmik taşıma proteininin ssuA genine tek bir nükleotidin eklenmesi.
3. İlk kez, veba mikrobunun ana ve küçük alt türlerinin suşlarında melibiosis fermantasyon özelliklerinin ve izositrat liyaz üretiminin farklı ifadesinin genetik temeli oluşturulmuştur. Ana alt türlerin suşlarının disakkarit melibiyozu fermente etme yeteneğinin eksikliğinin, galaktoz permeazı kodlayan melB yapısal gen dizisine IS285'in eklenmesinden kaynaklandığı gösterilmiştir. Veba mikropunun ana alt türlerinin karakteristiği olan izositrat liazın yapısal sentezinin, iclR baskılayıcı genin 269 – 270 pozisyonlarına iki nükleotidin (+CC) yerleştirilmesinden kaynaklandığı tespit edilmiştir.
4. Altay ve Gissar alt türlerinin Y. pestis suşlarının arabino-negatifliğinin nedeni, arabinoz operon - araC'nin düzenleyici geninde, bu genin 773 pozisyonuna tek bir guanin nükleotidinin yerleştirilmesinden kaynaklanan bir mutasyondur. .
5. İlk kez Kafkas alt türlerinden Y. pestis suşlarının oksotrofisinin genetik temeli belirlendi. Arginin için oksotrofinin, IS100'ün argA genine dahil edilmesinden ve fenilalanin için - 10 r.n. eklenmesinden kaynaklandığı tespit edilmiştir. aroG'de, tirozin için - aro F'ye IS100 eklenmesiyle, B1 vitamini için - thiG'de 13 bp'lik bir delesyonla ve thiH'de bir timin eklenmesiyle.
6. Veba patojeninin ana (antik, ortaçağ, doğu biyovarları) ve küçük alt türlerinin karakteristik genotipleri belirlenmiştir; bunun kullanımı Y. pestis'in tür içi farklılaşmasına olanak sağlar. Elde edilen sonuçların, Y. pestis suşlarının tür içi sınıflandırmasına yönelik bir genetik şema oluşturmak amacıyla kullanılmasına yönelik umutlar gösterilmektedir.
LİSTE TEZ MATERYALLERİNE GÖRE YAYINLANAN ÇALIŞMALAR
1. Kukleva L.M., Eroshenko G.A., Kuklev V.E., Krasnov Ya.M., Guseva N.P., Odinokov G.N., Kutyrev V.V. Ana ve küçük alt türlerin veba patojeni suşlarında rhaS geninin tam nükleotid dizisinin karşılaştırılması // Özellikle tehlikeli inf sorunları. – 2008. – Sayı. 3 (97). – S.38 – 42.2. Odinokov G.N., Eroshenko G.A., Vidyayeva N.A., Krasnov Ya.M., Guseva N.P., Kutyrev V.V. Farklı alt türlerin Yersinia pestis'inde nap operon genlerinin yapısal ve fonksiyonel analizi // Özellikle tehlikeli inf sorunları. – 2008. – Sayı. 4 (98). – S.12 – 16.
3. Eroshenko G.A., Kukleva L.M., Vidyayeva N.A., Odinokov G.N., Shavina N.Yu., Kutyrev V.V. Veba patojeninin küçük alt türlerinin genetik özellikleri // Bağımsız Devletler Topluluğu üye devletlerinin topraklarında bulaşıcı hastalıklarla mücadeleye yönelik küresel stratejinin uygulanmasında modern teknolojiler. BDT Üye Devletlerinin IX Eyaletlerarası Bilimsel ve Pratik Konferansı Materyalleri. – Volgograd, 2008. – S. 71 – 73.
4. Eroshenko G.A., Vidyayeva N.A., Odinokov G.N., Kukleva L.M., Krasnov Ya.M., Guseva N.M., Kutyrev V.V. Çeşitli kökenlerden Yersinia pestis suşlarında araC geninin yapısal ve fonksiyonel analizi // Molekul. genetik, mikrobiyoloji. ve virüsol. – 2009. – Sayı 3. – S.36 – 40.
5. Kukleva L.M., Odinokov G.N., Eroshenko G.A., Kutyrev V.V. RhaS ve araC genlerinin değişkenliğine dayalı olarak ana ve küçük alt türlerin Yersinia pestis suşlarının farklılaşması // VI Uluslararası Konferansı “Moleküler Teşhis ve Biyogüvenlik” materyallerinin toplanması. M., 2009. – S.124.
6. Eroshenko G.A., Odinokov G.N., Kukleva L.M., Shavina N.Yu., Krasnov Ya.M., Guseva N.P., Kutyrev V.V. Yersinia pestis suşlarının genotiplenmesinde etkili DNA hedefleri olarak napA, aspA, rhaS, zwf ve tcaB genlerinin değişken lokusları // Özellikle tehlikeli inf. – 2010. – Sayı. 2 (104). – S.57 – 59.
7. Odinokov G.N., Eroshenko G.A. Ana ve küçük alt türlerin Yersinia pestis suşlarının biyokimyasal farklılaşmasının genetik özellikleri // Mat.
bilimsel - pratik okul - konf. genç bilim adamları ve uzmanlar Fed. tüketici haklarının korunması ve insan refahı alanında denetim hizmeti “Biyolojik güvenliğin sağlanması için modern teknolojiler”, 25 – 27 Mayıs 2010, s. 289 – 291.
Format 60 x 84 1/16 Lazer baskı Ofis kağıdı Federal Devlet Kurumu RosNIPCHI'nin fiziksel ve matematik bilimleri "Mikrop" baskı ekipmanı üzerine basılmıştır Saratov 2012 1 Çalışma, Orenburg Eyaleti yüksek mesleki eğitim federal eyalet bütçe eğitim kurumunda gerçekleştirildi. Nanosistemlerin Biyokimyasal Fiziği Bilimsel ve Eğitim Merkezi Üniversitesi. Bilimsel danışman: Berdinsky Vitaly Lvovich...”
« RUSYA'NIN AVRUPA BÖLÜMÜNDE BAZI SPAGNUM BATAKLIKLARININ KULIKOVSKY MAXIM SERGEEVICH DIATOM YOSUNLARI 03.00.05 – Botanik Yarışma tezinin özeti Biyolojik Bilimler Adayı bilimsel derecesi St. Petersburg 2007 2 Çalışma, adını taşıyan İç Sular Biyoloji Enstitüsü'nde gerçekleştirildi. İD. Papanin RAS Bilimsel danışmanı, Biyolojik Bilimler Doktoru Genkal Sergey Ivanovich Resmi rakipler: Biyolojik Bilimler Doktoru, Profesör, Trifonova Irina Sergeevna Biyolojik Bilimler Doktoru...”
« SILACHEV DENIS NIKOLAEVICH BİR ODAK BEYİN İSKEMİ MODELİ ÜZERİNDE YENİ NÖROKORUYUCULAR ÜZERİNDE ÇALIŞMA 03.00.13 – fizyoloji Yarışma için tezin özeti biyolojik bilimler adayı bilimsel derecesi Moskova - 2009 Çalışma, A.N.'nin adını taşıyan Fiziksel ve Kimyasal Biyoloji Araştırma Enstitüsü'nün mitokondri yapısı ve işlevi laboratuvarında gerçekleştirildi. Belozersky Moskova Devlet Üniversitesi. M.V. Lomonosov (başkan - Biyolojik Bilimler Doktoru, Profesör D.B. Zorov), Moskova Devlet Üniversitesi Biyomühendislik ve Biyoinformatik Fakültesi'nde. M.V. Lomonosov (dekan -..."
“Biyolojik Bilimler Doktoru bilimsel derecesi için tezin özeti St. Petersburg - 2012 2 Çalışma, Rusya Bilimler Akademisi Federal Devlet Bütçe Bilim Enstitüsü Zooloji Enstitüsü'nde gerçekleştirildi. Resmi rakipler: Biyolojik Bilimler Doktoru, Profesör Medvedev Sergey Glebovich Doktor...”
« KHALIEVA Anna Sergeevna SÜREKLİ MANYETİK ALAN VE UV RADYASYONUNUN YÜKSEK BİTKİLERİN BÜYÜME SÜREÇLERİ ÜZERİNDEKİ ETKİSİ VE AĞIR KOŞULLARDAN TOPRAKLARIN FİTOR ıslahı METALLER VE PETROL ÜRÜNLERİ Uzmanlık Alanı 03.02.08 – ekoloji (biyoloji) Biyolojik bilimler adayı derecesi için tez özeti Penza - 2013 Çalışma, Federal Devlet Bütçe Yüksek Eğitim Kurumu Engels Teknoloji Enstitüsü'nde (şubesi) gerçekleştirildi. Mesleki Eğitim Gagarin Yu.A.'nın adını taşıyan Saratov Devlet Teknik Üniversitesi. Açık..."
« Kalmykova Olga Gennadievna BURTINSKAYA STEP'İNİN (ORENBURG DEVLET REZERVİ) STOK BİTKİSEL BİTKİSEL DAĞITIM ÖRNEKLERİ 03.00.16 - Ekoloji Özeti Biyolojik Bilimler Adayı bilimsel derecesi için tez St. Petersburg - 2008 Çalışma, Rusya Bilimler Akademisi Ural Şubesi Bozkır Enstitüsü'nün biyocoğrafya ve biyolojik çeşitliliğin izlenmesi laboratuvarında gerçekleştirildi. Bilimsel danışman: Biyolojik Bilimler Doktoru Safronova Irina Nikolaevna Resmi..."
« Astafieva Oksana Vitalievna GLYCYRRHIZA GLABRA L., ACHILLEA MICRANTHA WILLD'IN KULLANIMI. VE HELICHRYSUM ARENARIUM L. BİYOLOJİK ÜRÜNLERİN GELİŞTİRİLMESİNE YÖNELİK ANTİBAKTERİYEL ÖZELLİKLER 01/03/06 - biyoteknoloji (biyonanoteknoloji dahil) Biyolojik bilimler adayının bilimsel derecesi için tezin ÖZETİ Stavropol - 2013 Çalışma Federal Devlet Bütçe Yüksek Mesleki Eğitim Kurumu Astrakhan'da gerçekleştirildi...”
« HOANG THI MINH NGUET Beyaz soya fasulyesi yaprağından protein ve karbonhidrat ürünleri elde etme prosesinin incelenmesi Uzmanlık 03.00.23 – biyoteknoloji Teknik bilimler adayı derecesi için tezin ÖZETİ Moskova 2009 Çalışma, Rusya Kimya-Teknoloji Üniversitesi Biyoteknoloji Bölümü'nde gerçekleştirildi. DI. Mendeleev. Bilimsel danışman: Kimya Bilimleri Adayı, Doçent Alla Albertovna Krasnoshtanova Resmi rakipler: Doktor...”
« NOVOSELOV Sergey Vladimirovich Tiyoredoksin ve glutaredoksin sistemlerinin yeni tiyol oksidoredüktazları. Redoks dengesinin düzenlenmesindeki rolleri hücreler 03.00.04 – biyokimya 03.00.03 – moleküler biyoloji Pushchino Biyolojik Bilimler Doktoru derecesi için tezin ÖZETİ, 2008 1 Pushchino Rusya Bilimler Akademisi Hücre Biyofiziği Enstitüsü'nde ve Nebraska Üniversitesi'nde gerçekleştirilen çalışma Lincoln (UNL), Biyokimya Bölümü, Lincoln, Nebraska, ABD Resmi...”
« Vinogradova Galina Yurievna ALLIUM RAMOSUM L. VE ALLIUM SCHOENOPRASUM L.'DE (ALLIACEAE AİLESİ) POLEMBRYONİ 03.00.05 – Botanik Tez Özeti Biyolojik Bilimler Adayı bilimsel derecesi için yarışma St. Petersburg 2009 2 Çalışma, Rusya Bilimler Akademisi Botanik Enstitüsü'nün Embriyoloji ve Üreme Biyolojisi Laboratuvarı'nda gerçekleştirildi. V.L. Komarova RAS Bilimsel süpervizörü Biyolojik Bilimler Doktoru, RAS Sorumlu Üyesi Batygina T.B. Resmi..."
« Volkovich Mark Gabrielevich ALT AİLE POLYCESTINAE (COLEOPTERA, BUPRESTIDAE) BÖCEKLERİ: MORFOLOJİ, FİLOJENİ, SINIFLANDIRMA 02/03/05 – entomoloji Biyolojik Bilimler Doktoru derecesi için tezin özeti St. Petersburg - 2012 2 Çalışma, Rusya Bilimler Akademisi Federal Devlet Bütçe Bilim Enstitüsü Zooloji Enstitüsü'nün böcek taksonomisi laboratuvarında gerçekleştirildi. Resmi rakipler: Doktor Biyoloji Bilimleri, Profesör,...”
« Torgashina Irina Gennadievna EKOLOJİK BİYOLÜMİNESAN TESTLERİ İÇİN İMMOBİLİZE BİR ENZİMATİF REAKTİFİN HASSASİYETİNİN ÇALIŞMASI 03.00.16 – ekoloji Biyolojik Bilimler Adayı Krasnoyarsk'ın bilimsel derecesi için tez ÖZETİ - 2007 Çalışma, Sibirya Federal Üniversitesi Bilimsel Federal Devlet Yüksek Mesleki Eğitim Kurumu Doğa Bilimleri ve Beşeri Bilimler Enstitüsü Biyofizik Bölümü'nde gerçekleştirildi. danışman: Biyolojik Bilimler Doktoru, Profesör Kratasyuk Valentina Aleksandrovna...”
« MAYER NIKOLAY KONSTATINOVICH TRİTİFİK ÖZELLİKTE KÖK ÜZERİNDE TAHIL ÇIKMASINA DİRENÇ İÇİN MOLEKÜLER GENETİK MARKERLERİN UYGULANMASI: 02/03/07 – genetik, 01/03/06 – biyoteknoloji (biyonanoteknoloji dahil) Biyolojik bilimler adayının bilimsel derecesi için tezin ÖZETİ Moskova 2011 Çalışma genetik ve biyoteknoloji bölümünde ve moleküler biyoteknoloji bilim ve eğitim merkezinde gerçekleştirildi. Rusya Devlet Tarımcısının ... "
« Bilimsel danışman: Biyolojik Bilimler Doktoru, Profesör Boris Ivanovich Kolupaev Resmi rakipler: Biyolojik Bilimler Doktoru, ELENA PUZATKINA ALEXANDROVNA Profesör Sokolina Flyura Mukhametgaleevna; Biyolojik Bilimler Doktoru, Profesör Roza Yakhievna Dyganova Lider kuruluş: Nijniy Novgorod Devlet Üniversitesi adını almıştır. N.I. Lobaçevski'nin Etkisi...”
« Smirnova Lyudmila Olegovna FOTOPERİYOD HASSASİYETİ VE ERKEN OLGUNLUK İLE YULAFIN GENETİK ÇEŞİTLİLİĞİ: 01/06/05 – seçim ve tarımsal bitkilerin tohum üretimi, 01/03/05 – bitkilerin fizyolojisi ve biyokimyası Biyoloji bilimleri adayı derecesi için tezin ÖZETİ St. Petersburg 2011 Tez çalışması yulaf, çavdar, arpa ve Tüm Rusya Bitki Fizyolojisi Bölümü...”
« Bezhonova Oksana Vladimirovna Rusya ve komşu ülkelerdeki Anopheles (Diptera, Culicidae) cinsinin kan emen sivrisinek türlerinin kompleksleri Uzmanlık Alanları 02/03/05 – entomoloji ve 02/03/07 - genetik Biyolojik Bilimler Adayı bilimsel derecesi için tezin ÖZETİ MOSKOVA - 2011 Çalışma, M.V. Moskova Devlet Üniversitesi Biyoloji Fakültesi Entomoloji Bölümü'nde gerçekleştirildi. Lomonosov ve Kurumun Karşılaştırmalı Hayvan Genetiği Laboratuarında...”
« DOĞAL PEYZAJIN ANTROPOJENİK DÖNÜŞÜMÜ KOŞULLARINDA ORTA VOLGA BÖLGESİNİN RAKHIMOV Ilgizar İlyasovich AVIFAUNA Uzmanlığı 03.00.16 - ekoloji Biyolojik Bilimler Doktoru derecesi için tez ÖZETİ Moskova - 2002 Çalışma, Moskova Pedagoji Devlet Üniversitesi Biyoloji ve Kimya Fakültesi Zooloji ve Ekoloji Bölümü'nde gerçekleştirildi. Bilimsel danışman: Biyolojik Bilimler Doktoru, Profesör V.M.Konstantinov..."
« SALAKHOVA GULNARA MIRZALIFOVNA PETROL KİRLİLİĞİ VE ıslahı KOŞULLARI ALTINDA BİTKİLERİN VE RİZOSFERİK MİKROBİYOTALARIN EKOLOJİK VE FİZYOLOJİK PARAMETRELERİNDEKİ DEĞİŞİKLİKLER TOPRAK Uzmanlık Alanı 03.00.16 - Ekoloji 03.00.12 - Bitkilerin fizyolojisi ve biyokimyası Biyolojik bilimler adayı derecesi için tez özeti Ufa - 2007 Çalışma, Devlet Yüksek Eğitim Kurumu Biyokimya ve Biyoteknoloji Bölümü'nde gerçekleştirildi. Mesleki Eğitim Başkurt...”
