Tema: Aktiviteti katalitik i enzimave në qelizat e gjalla

Synimi: identifikojnë funksioni katalitik proteinat në qelizat e gjalla, zhvillojnë njohuri për rolin e enzimave në qeliza, konsolidojnë aftësinë për të punuar me mikroskop, kryejnë eksperimente dhe shpjegojnë rezultatet e punës. Pajisjet: patate të papërpunuara dhe të ziera, gjethe elodea (një bimë tjetër), tretësirë ​​e freskët peroksid hidrogjeni 3%, epruveta, piskatore, rërë, llaç dhe shtyp, fletore, stilolaps, laps, vizore.

Progresi:

Përgatitni dy provëza dhe vendosni pak rërë në të parën, një copë patate të papërpunuar në të dytën, një copë patate të zier në të tretën Hidhni pak peroksid hidrogjeni në secilën epruvetë. Vëzhgoni se çfarë ndodh në çdo epruvetë.

Grini një copë patate të papërpunuar në një llaç me një sasi të vogël rërë.

Transferoni patatet e shtypura së bashku me rërën në një provëz dhe hidhni pak peroksid hidrogjeni.

Krahasoni aktivitetin e indit të grimcuar dhe të tërë bimor.

Bëni një tabelë që tregon aktivitetin e secilit ind nën trajtime të ndryshme. Shpjegoni rezultatet tuaja. Përgjigju pyetjeve:

Vëzhgimet

Peroksid hidrogjeni dhe patate të papërpunuara

Oksigjeni lëshohet, proteina zbërthehet në struktura primare dhe kthehet në shkumë

Peroksid hidrogjeni dhe patate të ziera

Asnjë reagim

Përgjigjuni pyetjeve: Në cilat epruveta u shfaq aktiviteti i enzimës katalazë? Shpjegoni pse.

Katalaza është një enzimë që katalizon reaksionin e dekompozimit të peroksidit të hidrogjenit në ujë dhe oksigjen molekular: H2O2 + H2O2 = O2 + 2H2O. Roli biologjik K. konsiston në degradimin e peroksidit të hidrogjenit të formuar në qeliza si rezultat i veprimit të një numri oksidazash flavoproteinike (ksanthine oksidaza, glukozoksidaza, monoamine oksidaza, etj.) dhe sigurimi i mbrojtjes efektive të strukturave qelizore nga shkatërrimi nën ndikimin e peroksid hidrogjeni. Mungesa e K. e përcaktuar gjenetikisht është një nga shkaqet e të ashtuquajturës akatalasia, një sëmundje trashëgimore e manifestuar klinikisht me ulçera të mukozës së hundës dhe zgavrën e gojës, nganjëherë ndryshime të theksuara atrofike në septet alveolare dhe humbje dhëmbësh. Aktiviteti u shfaq në 1.3 epruveta, sepse ato përmbanin ushqime të papërpunuara që përmbajnë proteina. Dhe në epruvetat e mbetura kishte produkte me proteina të shkatërruara gjatë procesit të gatimit dhe reagimi nuk u shfaq. Prandaj, trupi thith më mirë ushqimet që përmbajnë proteina.

Si manifestohet aktiviteti i enzimës në indet e gjalla dhe të vdekura? Shpjegoni dukurinë e vëzhguar. Nuk ka aktivitet enzimë në indet e vdekura, sepse proteina në to u shkatërrua gjatë gatimit. Dhe në indet e gjalla, kur ndërveprojnë me peroksid hidrogjeni, oksigjeni u lëshua, dhe proteina, duke u zbërthyer në strukturën e saj parësore, u shndërrua në shkumë.

Si ndikon bluarja e indeve në aktivitetin e enzimës në indet e gjalla të bimëve dhe kafshëve? Gjatë bluarjes së indeve të gjalla, reagimi vazhdon më shpejt, sepse rritet zona e kontaktit midis proteinave dhe peroksidit të hidrogjenit. v=kc(a)c(b) ku v është shpejtësia e reaksionit kimik k është shpejtësia konstante c është ndryshimi i përqendrimit A mendoni se të gjithë organizmat e gjallë përmbajnë enzimën katalazë, e cila siguron zbërthimin e peroksidit të hidrogjenit?

Arsyetoni përgjigjen tuaj. Meqenëse kjo është një enzimë e klasës së oksidoreduktazës, ajo katalizon dekompozimin e peroksidit të hidrogjenit, i cili është toksik për qelizat e gjalla, në ujë dhe oksigjen. Përmbahet në lizozome. Mund të konkludojmë se ai gjendet në të gjitha qelizat e organizmave të gjallë. Shpjegoni vëzhgimet tuaja. Tregoni përfundimin tuaj.

Përfundim: proteinat përmbahen vetëm në ushqimet e gjalla, dhe në ushqimet e gatuara proteina shkatërrohet, kështu që nuk ndodh asnjë reagim me to. Nëse bluani produktet, reagimi do të vazhdojë më shpejt.

Përcaktimi i aktivitetit të katalazës

(sipas A.N. Bach dhe A.I. Oparin)

Oksidoreduktazat janë një klasë enzimash që katalizojnë reaksionet redoks. Oksidimi i monomereve të formuar gjatë katabolizmit të polimereve është një proces kompleks me shumë faza.

Oksidimi i substancave në qeliza ndodh kryesisht nga heqja e hidrogjenit (dehidrogjenizimi) ose heqja e elektroneve ose me shtimin e oksigjenit në molekulën e përbërjes së oksiduar.

Pranuesit e hidrogjenit në dehidrogjenazat janë NAD +, NADP, FAD dhe FMN, në disa flavina - oksigjen (ato quhen oksidaza), në ato që përmbajnë hem (peroksidaza dhe katalaza) - H 2 O 2 (peroksid hidrogjeni).

Pranuesit dhe bartësit e elektroneve janë citokromet (hemoproteinat) që përmbajnë hem.

Katalaza (EC 1.11.1.6) i përket hemoproteinave, katalizon procesin e shkatërrimit të peroksidit të hidrogjenit, i cili është toksik për qelizat, në ujë dhe oksigjen: 2 H 2 O 2 = 2 H 2 O + O 2.

Për një qelizë të gjallë, peroksidi i hidrogjenit është një helm i fortë, prandaj të gjitha enzimat që formojnë dhe neutralizojnë H 2 O 2 janë të vendosura në peroksizomet - organele të mbuluara me membranë. Konsumatorët kryesorë të H 2 O 2 janë peroksidazat (EC 1.11.1.7.), të cilat oksidojnë fenolet, aminet, disa komponimet heterociklike dhe substrate të tjera me dehidrogjenim, transferoni ato të hequra nga substratet në H 2 O 2, duke e reduktuar atë në 2 H 2 O. Molekulat e peroksidit të hidrogjenit, të paprekura nga peroksidazat, neutralizohen nga katalaza.

Metoda për përcaktimin e aktivitetit të katalazës bazohet në përcaktimin e sasisë së peroksidit të hidrogjenit të zbërthyer gjatë inkubacionit me enzimën. Sasia e H 2 O 2 në përzierjen e reaksionit përcaktohet me titrim në një mjedis acid me një zgjidhje me një përqendrim të permanganatit të kaliumit prej 0.02 mol / l:

5 H 2 O 2 + 2KMnO 4 + 3H 2 SO 4 = 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + 5O 2 +8H 2 O

Bazuar në ekuacionin e mësipërm të reagimit, mund të llogaritet se 1 ml tretësirë ​​me një përqendrim të permanganatit të kaliumit prej 0,02 mol/l korrespondon me 1,7 mg (50 µmol) peroksid hidrogjeni.

PROGRESS. 2-3 g patate të papërpunuara (ose materiale të tjera të freskëta bimore) grihen tërësisht në një llaç me rërë kuarci ose xhami. Për ulje reaksion acid shtoni CaCO 3 në majë të bisturisë derisa të ndalojë lëshimi i flluskave CO 2. Gjatë procesit të bluarjes, shtoni 40-50 ml ujë në pjesë të vogla në llaç. Masa e bluar transferohet në mënyrë sasiore në një balonë vëllimore 100 ml, rregullohet në shenjë me ujë dhe përzihet. Masa lihet të qëndrojë për 10-15 minuta dhe pasi përzihet filtrohet.

Merrni dy balona konike me një kapacitet 150-200 ml dhe shtoni në to 20 ml të filtratit që rezulton. Përmbajtja e një balone zihet për 1 min dhe ftohet në temperaturën e dhomës (kontrolli). Një tjetër balonë eksperimentale përmban një enzimë aktive. Shtoni 20 ml ujë dhe 3 ml tretësirë ​​në përmbajtjen e balonave të provës dhe kontrollit. fraksioni masiv H 2 O 2 1%. Përmbajtja përzihet mirë dhe lihet në temperaturën e dhomës për 30 minuta. Në fund të inkubacionit, 5 ml tretësirë ​​me një fraksion masiv të acidit sulfurik 10% shtohet në të dy balonat, përzihet dhe teprica e H 2 O 2 në çdo balonë titrohet me një tretësirë ​​me një përqendrim të permanganatit të kaliumit 0,02 mol/l derisa të formohet një ngjyrë rozë, e cila nuk zhduket brenda 1 min.

Aktiviteti i katalazës shprehet në μmol të peroksidit të hidrogjenit të zbërthyer nga enzima për 1 g të materialit testues (ose për 1 mg ekstrakt prej tij) për 1 min. Llogaritja kryhet sipas formulës:

Ku X– aktiviteti i katalazës, E/g;

(a-b)- diferenca midis vëllimeve të një tretësire me një përqendrim të permanganatit të kaliumit prej 0,02 mol/l, i përdorur për titrimin e kontrollit (A) dhe me përvojë (b) mostra, ml;

T– titri i tretësirës së permanganatit të kaliumit që përdoret për titrim;

50 – faktori i konvertimit për µmol H 2 O 2;

100 – vëllimi i përgjithshëm i ekstraktit të përgatitur;

m – masa e materialit të marrë për analizë, g;

20 – vëllimi i filtratit të marrë për analizë, ml;

30 – koha e inkubacionit, min.

Regjistrohen parimi i përcaktimit, procedura e analizës dhe rezultati i analizës.

Aktiviteti i katalazës mund të përcaktohet gjithashtu nga vëllimi i oksigjenit të çliruar pas shtimit të H 2 O 2 në objektin e provës.

Ky parim përdoret për të përcaktuar aktivitetin e katalazës në qumësht, i shprehur me numrin e katalazës, i cili është vëllimi i oksigjenit (ml) i lëshuar në 2 orë në 25 ° C nga 5 mg një tretësirë ​​me një pjesë masive H 2 O. 2 1% shtohet në 15 ml qumësht. Qumështi i përftuar nga kafshët e shëndetshme çliron 0,7-2,5 ml oksigjen, d.m.th. Numri i katalazës së qumështit natyral nuk është më shumë se 2.5. Qumështi i përftuar nga kafshët e sëmura (mastiti, etj.) dhe kolostrumi kanë rritur numrin e katalazave, duke arritur deri në 15.

REAGENTET. Uje i distiluar; karbonat kalciumi (pluhur); tretësirë ​​me një përqendrim të permanganatit të kaliumit prej 0,02 mol/l; tretësirat me fraksione masive: peroksid hidrogjeni 1% (10 ml tretësirë ​​me një fraksion masiv H 2 O 2 30% i holluar me ujë në 300 ml), acid sulfurik 10%.

PYETJE KONTROLLIN.

1. Rrugët kryesore për oksidimin e substrateve në qelizë.

2. Karakteristikat e strukturës dhe veprimit të dehidrogjenazave të varura nga NAD + - dhe NADP.

3. Karakteristikat e strukturës dhe veprimit të dehidrogjenazave të varura nga FAD.

4. Cilat enzima quhen oksidaza? Kofaktorët e tyre.

5. Karakteristikat e strukturës dhe veprimit të peroksidazave dhe katalazave.

6. Karakteristikat e strukturës dhe veprimit të citokromeve.

7. Kimia, formimi dhe mënyrat e neutralizimit të peroksidit të hidrogjenit në qeliza.

8. Metoda për përcaktimin e aktivitetit të katalazës.

Enzimat janë katalizatorë proteinikë të reaksioneve biokimike, shumica e cila në mungesë të enzimës do të vazhdonte jashtëzakonisht ngadalë. Ndryshe nga katalizatorë kimikëçdo enzimë është e aftë të katalizojë vetëm një numër shumë të vogël reaksionesh, shpesh vetëm një.

Kështu, enzimat janë katalizatorë specifikë të reaksionit. Pothuajse të gjitha bio reaksionet kimike të katalizuara nga enzimat.

Shumë enzima kanë veprim katalitik në substrate vetëm në prani të një përbërjeje organike specifike termostabile me molekulare të ulët - një koenzimë.

Në raste të tilla, holoenzima (katalitikisht kompleks aktiv) përbëhet nga një apoenzimë (pjesë proteinike) dhe një koenzimë shoqëruese (Shtojca H). Një koenzimë mund të lidhet me një apoenzimë me lidhje kovalente dhe jo kovalente. Termi "grup protetik" i referohet një koenzime të lidhur në mënyrë kovalente. Reaksionet që kërkojnë praninë e një koenzime përfshijnë: reaksionet redoks, transferim grupor, izomerizimi dhe kondensimi (sipas sistemit IUB këto janë klasat 1, 2, 5, 6). Reaksionet e ndarjes ndodhin në mungesë të koenzimave (sipas sistemit IUB këto janë klasa 3 dhe 4).

^ 4.1 Puna laboratorike “Përcaktimi i aktivitetit të amilazës
malt sipas metodës Wolgemut"

Metoda e Wolgemut bazohet në përcaktimin e sasisë minimale të enzimës që mund të hidrolizojë plotësisht 1 ml tretësirë ​​niseshteje 0,1% në kushte të caktuara. Aktiviteti i amilazës së maltit shprehet me numrin e mililitrave të tretësirës 0,1% të niseshtës, e cila mund të hidrolizohet nga 1 ml ekstrakt malti në temperaturën 38 °C për 30 minuta. Aktiviteti normal i amilazës është midis 160 dhe 320 njësi aktiviteti.

Metoda Wohlgemuth përdoret gjerësisht në praktikën klinike për të përcaktuar aktivitetin e amilazës së gjakut dhe urinës, dhe në pirje për të përcaktuar aktivitetin e amilazës së maltit. Një rritje e mprehtë e aktivitetit të amilazës në gjak dhe urinë (10-30 herë) vërehet në pankreatitin akut dhe tumoret e pankreasit.

^ Materialet dhe reagentët: ekstrakt nga malti i grurit, i holluar 10 herë; 0.1% tretësirë ​​niseshteje; 0.1% tretësirë ​​jodi në tretësirë ​​0.2% jodidi kaliumi.

Pajisjet: qëndrojnë me epruveta, pipeta, pikatore, termostat.

^ Përparimi i punës. 1 ml ujë të distiluar hidhet në dhjetë epruveta. Në epruvetën e parë shtohet 1 ml ekstrakt i holluar 10 herë, përzihet, 1 ml e përzierjes kalohet në epruvetën e dytë. Përmbajtja e kësaj epruvetëje përzihet sërish dhe 1 ml kalohet në epruvetën e tretë e kështu me radhë deri në epruvetën e dhjetë. Nga epruveta e fundit merret 1 ml dhe derdhet. Kështu, në çdo epruvetë pasuese përmbajtja e enzimës është dy herë më pak se në atë të mëparshmen. Hollimi i ekstraktit në dhjetë epruveta do të jetë: 1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160; 1:320; 1:640; 1:1280; 1:2560; 1:5120; 1:10240.

Më pas, shtoni 1 ml ujë dhe 2 ml tretësirë ​​niseshteje në të gjitha epruvetat, përzieni dhe vendoseni në një termostat në temperaturë. 38°C për 30 min. Pas inkubimit, ftohni epruvetat me ujë rubineti për të ndaluar veprimin e enzimës, shtoni dy pika tretësirë ​​jodi, shkundni mirë dhe vëzhgoni ndryshimin e ngjyrës. Kur reagon me jodin, lëngu bëhet i verdhë, rozë dhe vjollcë.

Pasi të kemi vërejtur se në çfarë hollimi ka ndodhur hidroliza e plotë e niseshtës me një përmbajtje minimale enzime (një epruvetë me ngjyrë të verdhë të përmbajtjes), aktiviteti i amilazës së ekstraktit llogaritet nga sasia e ekstraktit të paholluar (A) në këtë epruvetë.
(Një ml ekstrakt zbërthen X ml tretësirë ​​niseshteje 0,1%).

Për shembull, e verdhe u shfaq në epruvetën e katërt, ku ekstrakti u hollua 160 herë. Kjo sasi ekstrakti është në gjendje të hidrolizojë 2 ml tretësirë ​​niseshteje 0,1%, dhe 1 ml ekstrakt të paholluar në të njëjtat kushte hidrolizon 320 ml: X = 2 × 160/1. Prandaj, aktiviteti i amilazës është 320.

^ 4.2 Puna laboratorike “Përcaktimi i aktivitetit të katalazës

sipas Bach"

Metoda bazohet në përcaktimin e sasisë së peroksidit të hidrogjenit që mbetet pas veprimit të katalazës mbi të duke titruar një tretësirë ​​KMnO 4 mbi të. Reaksioni vazhdon sipas ekuacionit

1 ml tretësirë ​​0,1 mol/l permanganat kaliumi korrespondon me 85 mg peroksid hidrogjeni.

^ Materialet dhe reagentët: preparati i katalazës (1 g filiz të maltit të elbit bluhet në llaç porcelani me 6 ml tampon fosfati dhe filtrohet); tretësirë ​​10% e H 2 SO 4; tretësirë ​​0,1% e peroksidit të hidrogjenit në tampon fosfat, pH=7,0 (35,0 ml 0,2 mol/l NaH 2 PO 4 në 13,6 ml 0,2 mol/l NaH 2 PO 4); 0.1 mol/l tretësirë ​​KMnO 4.

Pajisjet: Balonat 100 ml, pipeta, byreta, termostat.

^ Përparimi i punës. Shtoni 2 ml preparat katalazë në dy balona, ​​shtoni 1 ml tretësirë ​​10% H2SO4 në njërën prej tyre (kampion), më pas hidhni 2 ml tretësirë ​​të peroksidit të hidrogjenit në secilën balonë, vendoseni në një termostat për 40 minuta në 38°C. . Pasi të ketë kaluar koha e inkubacionit, 1 ml tretësirë ​​10% H 2 SO 4 i shtohet balonës së dytë (kontrolli) dhe të dy tretësirat titrohen me një tretësirë ​​0,1 mol/L KMnO 4 derisa të shfaqet një ngjyrë rozë e qëndrueshme nga kaliumi i tepërt. permanganat.

Aktiviteti i katalazës përcaktohet nga sasia e peroksidit të hidrogjenit të dekompozuar (ml) dhe llogaritet duke përdorur formulën:

,

Ku
– dallimi në rezultatet e titrimit të mostrave të kontrollit dhe testimit me tretësirë ​​0,001 N KMnO 4, ml;

Q – sasia e peroksidit të hidrogjenit (85 mg), përkatëse
1 ml tretësirë ​​0,1 mol/l KMnO 4.

^ 4.3 Puna laboratorike “Metoda me pika
(sipas Klimovsky dhe Rodzevich)"

Aktiviteti amilolitik, kryesisht për shkak të pranisë së α-amilazës në preparat, karakterizon aftësinë e enzimës për të katalizuar hidrolizën e niseshtës në produkte që nuk janë të ngjyrosura me jod. Nëse α-amilaza dhe glukoamilaza janë të pranishme në preparat, kjo metodë përcakton efektin total të të gjitha enzimave amilolitike.

Në këtë metodë, një njësi e aktivitetit amilolitik merret si sasia e enzimës që katalizon zbërthimin e 1 g niseshteje të tretshme në produkte që nuk janë ngjyrosur me jod për 1 orë në një temperaturë prej 30 ºC në kushte të përcaktuara rreptësisht. Aktiviteti amilolitik i AS shprehet me numrin e njësive të treguara për 1 g bar, kulturë ose 1 cm 3 tretësirë. Vlera AC tregon se sa gramë niseshte mund të hidrolizohen në komponime të pangjyrosura me jod nga 1 g bar, kulturë ose 1 cm 3 tretësirë ​​në 1 orë në kushte përcaktimi. Përfundimi i reaksionit monitorohet vizualisht duke përdorur një test jodi.

Ndjeshmëria e metodës përcaktohet sasi minimale koha gjatë së cilës mund të zbulohet vizualisht një ndryshim në ngjyrën e jodit. Supozohet se shpejtësia reaksion enzimatikështë drejtpërdrejt proporcionale me sasinë e enzimës së përdorur dhe mbetet konstante për 5 minuta deri në 1 orë, domethënë reaksioni i bindet ligjit të reaksionit të rendit zero. Përveç kësaj, ndikimi i vlerës së pH dhe natyra kimike tampon nga sasia e AC. Me një tampon acetati (pH=4.7), vlera e AC në preparatet e kërpudhave është mesatarisht 1.5 herë më e lartë se kur përcaktohet me një tampon fosfati (pH=6.0). Prandaj, gjatë përcaktimit të vlerës së AC të kulturave kërpudhore, rekomandohet përdorimi i një tampon acetati.

Disavantazhi i metodës është paqartësia përkufizimi vizual fundi i reaksionit.

^ Materialet dhe reagentët: pufer acetati me pH=4,7 për enzimat me origjinë mykotike; pufer fosfat me pH=6.0 për enzimat me origjinë bakteriale; Tretësirë ​​niseshteje 1% (tretësira e niseshtës së përdorur për analizën e preparateve mykotike duhet të ketë pH = 4,7, për analizën e preparateve bakteriale - 6,0); tretësirat e jodit. Për të përgatitur një tretësirë ​​bazë të jodit, 4,4 g jodur kaliumi, 1,4 g jod metalik peshohen në një gotë të grirë me kapak të bluar dhe shtohen rreth 2 cm 3 ujë të distiluar. Gota mbyllet me kapak, përzihet përmbajtja dhe pasi tretet jodi, tretësira kalohet në një balonë vëllimore 100 cm 3 me tapë të bluar. Mbushni vëllimin me ujë të distiluar deri në shenjë. Përmbajtja e balonës ruhet në një vend të freskët dhe të errët. Tretësira bazë e jodit mund të përdoret brenda 30 ditëve nga data e përgatitjes së saj. Nga solucioni kryesor përgatitet një tretësirë ​​pune e jodit. Për ta bërë këtë, 20 cm 3 të një solucioni bazë të jodit derdhen në një balonë vëllimore me një kapacitet 100 cm 3, shtohen 4,4 g jodur kaliumi dhe vëllimi i përgjithshëm i tretësirës rregullohet në 100 cm 3. Tretësira e punës me jod mund të konsumohet brenda gjashtë ditëve pas përgatitjes së saj.

Pajisjet: epruveta te gjera, shufra qelqi, pipeta, gota 50 ml, ene Petri, termostat.

^ Përparimi i punës. Për të përcaktuar vlerën AC, është e rëndësishme të respektohen rreptësisht kushtet e reagimit. Për ta bërë këtë, të gjitha zgjidhjet - substrati (tretësirë ​​1% niseshte), tretësira enzimë dhe uji i distiluar duhet së pari të nxehen në një temperaturë prej 30 ° C.

Nënshtresa në një sasi prej 25 cm 3 (12,5 ml) vendoset në një provëz të gjerë në të cilën futet një shufër qelqi. 30 cm 3 (15 ml) ekstrakt dhe 30 cm 3 (15 ml) ujë derdhen në provëza të veçanta, vendosen në një termostat dhe mbahen në temperaturën 30 ºС për
10 minuta.

Më pas, duke përdorur pipeta, shtoni nga 1 deri në 25 cm 3 tretësirë ​​të enzimës origjinale dhe sasinë përkatëse të ujit në tretësirën e niseshtës në një provëz të gjerë, pa i hequr epruvetat nga termostati, në mënyrë që vëllimi i përgjithshëm i reaksionit. përzierja është 50 cm3. Nëse ekstrakti i enzimës është joaktiv, atëherë mund të shtoni vetëm 25 cm 3 të tij dhe të mos shtoni fare ujë.

Përmbajtja e epruvetës përzihet me shkop dhe shënohet koha me kronometër kur ekstrakti është shtuar në tretësirën e niseshtës. Çdo 60 sekonda, një pikë kampion merret nga provëza pa e hequr atë nga termostati. Një pikë vendoset në një pjatë porcelani të bardhë, kjo pikë bashkohet me një pikë tretësirë ​​pune të jodit dhe vërehet ngjyra. Reaksioni i zbërthimit të niseshtës konsiderohet i plotë kur jodi nuk prodhon më një ndryshim ngjyre kur kombinohet me një pikë të tretësirës testuese brenda 10 sekondave të para. Ndryshimi i ngjyrës është qartë i dukshëm në kufirin e kontaktit midis dy pikave - jodit dhe përzierjes së reagimit.

Koha që duhet që niseshteja të shpërbëhet në produkte që nuk janë të njollosura me jod duhet të jetë në intervalin nga 10 në
20 minuta.

Nëse koha e hidrolizës është më pak se 10 minuta, përcaktimi përsëritet, duke përdorur më pak ekstrakt për hidrolizë dhe më shumë ujë. Nëse hidroliza nuk përfundon brenda 20 minutave, atëherë analiza përsëritet gjithashtu, duke marrë më shumë ekstrakt enzimë dhe më pak ujë për përcaktim. Sasia e ekstraktit enzimë që duhet të merret për ri-analizë llogaritet duke marrë parasysh kohën e hidrolizës së fituar.

Nëse ekstrakti i enzimës ka pak ose shumë aktivitet i lartë, dhe sasia e tretësirës enzimë nga 1 deri në 25 cm 3 nuk siguron kohëzgjatjen e hidrolizës së niseshtës për 10...20 minuta, pastaj për analizë marrin jo 25 cm 3 tretësirë ​​niseshteje, por një sasi më të madhe ose më të vogël, për. shembull, 10 ose 40 cm 3, duke shtuar ndryshimin përkatës në formula e llogaritjes(0,1 ose 0,4, respektivisht, në vend të 0,25 të zakonshëm).

Vlera e aktivitetit amilolitik të AS (njësi/g) llogaritet duke përdorur formulën:

Ku 0,25 është sasia e niseshtës që është në 25 cm 3 të një tretësire 1%, g;

60 – faktori i konvertimit për 1 orë;

N është sasia e enzimës që merr pjesë në reaksion, g ose cm 3 (kjo vlerë përcaktohet duke marrë parasysh përqendrimin e ekstraktit fillestar dhe hollimin pasues);

T – koha gjatë së cilës niseshteja zbërthehet në produkte të pa ngjyrosura me jod, min.

Shembull. Një ekstrakt enzimatik i një kulture ajrore të kërpudhave u mor për analizë. Tretësira bazë u përgatit në masën 5 g kulturë në 100 cm 3 ujë të puferuar. Dihet se këtë kulturëështë shumë aktiv, prandaj është bërë një hollim shtesë i tretësirës origjinale: 20 cm 3 është sjellë në një balonë vëllimore në 50 cm 3 me ujë të distiluar dhe prej andej është marrë 2 cm 3 për analizë, d.m.th. Është marrë sekuenca e mëposhtme e hollimit:

5 g → 100 cm 3 → 20 cm 3 → 50 cm 3 → 2 cm 3.

U deshën 12 minuta për të hidrolizuar 0,25 niseshte (25 cm 3 nga një tretësirë ​​niseshteje 1%) me tretësirën enzimë të hollimit të fundit (2 cm 3). Atëherë AC e kulturës së tharë në ajër (njësi/g) do të jetë:

Gjatë rillogaritjes së aktivitetit enzimatik, duhet të merret parasysh jo substanca absolutisht e thatë e përgatitjes së enzimës, por duke marrë parasysh lagështinë. Llogaritja duhet të bëhet duke përdorur formulën:

,

Ku W është përmbajtja e lagështisë së kulturës ose përgatitjes.

^ 4.4 Puna laboratorike “Metoda Willstetter
dhe përkufizimi i Waldschmidt-Leitz për proteolitik
aktiviteti i enzimës në modifikim"

Metoda bazohet në përcaktimin e grupeve të lira karboksil në tretësirat alkoolike të aminoacideve dhe polipeptideve.

Aktiviteti (PA) shprehet me numrin e miligramëve të azotit amin që krijohet gjatë hidrolizës së një sasie të caktuar të tretësirës së xhelatinës 5% me një vlerë pH nga 7,3 në 7,5 1 g të barit ose 1 cm 3 tretësirë ​​enzimë në 1 orë në temperaturë 40 ºC.

Një njësi e aktivitetit proteolitik merret si sasia e enzimës që prodhon 1 mg azot amine në 1 orë në kushtet e pranuara eksperimentale.

^ Materialet dhe reagentët: 96% alkool etilik; 1% zgjidhje e timolftaleinës; tretësirë ​​NaOH 0,1 N; substrati - 5% zgjidhje xhelatine; ekstrakt nga bima e analizuar.

Përgatitja e një ekstrakti për përcaktimin e aktivitetit proteolitik: një kampion prej 0,25 g material bimor vendoset në një llaç porcelani dhe bluhet për 2,5 minuta me 2,5 ml bufer fosfati (pH = 7,3), më pas masa filtrohet.

Përgatitja e tretësirës (substrati) xhelatine 5%: 5 g xhelatinë njomet paraprakisht në një filxhan qelqi në 15...20 cm 3 ujë të distiluar për 20...30 minuta. Proteina e fryrë derdhet në 20...25 cm 3 të një solucioni buferik në një temperaturë prej 70 deri në 80 ° C dhe përzihet plotësisht me një shufër qelqi. Pjesa e tretur hidhet në një balonë vëllimore 100 cm 3, pjesës së patretur i shtohen edhe 20...25 cm 3 tretësirë ​​buferike dhe tretësira që rezulton transferohet sërish në të njëjtën balonë. Një tretësirë ​​xhelatine e ftohur në 40 °C sillet në shenjë me një zgjidhje tampon të së njëjtës temperaturë. Tretësira e përgatitur e xhelatinës ruhet në frigorifer në një temperaturë prej 2 deri në 5 °C dhe përdoret për analizë brenda dy ditësh. Para analizës, tretësira e xhelatinës nxehet në një temperaturë prej 40 °C në një banjë uji.

Pajisjet: balona konike me vëllim 200 deri në 250 ml, balona volumetrike me vëllim 50 ml, shufra qelqi, pipeta, byreta, termostat.

^ Përparimi i punës. Në 10 cm 3 të një solucioni 5% të xhelatinës me një vlerë pH nga 7,3 në 7,5, shtoni 2 cm 3 të tretësirës së enzimës së provës dhe merrni menjëherë 1 cm 3 të përzierjes së reaksionit në një balonë konike me një kapacitet 50 deri në 100. cm 3, ku derdhet 20 cm 3 96% alkool etilik dhe 0,2 cm 3 1% timolftaleinë. Mostra titrohet me tretësirë ​​0,1 N NaOH derisa të shfaqet një ngjyrë blu.

Përzierja e mbetur e xhelatinës me tretësirën e enzimës vendoset në një termostat me temperaturë 40 ºC për hidrolizë. Pas 3 orësh, 1 cm 3 e përzierjes së reaksionit futet në një balonë të dytë me kapacitet 50 deri në 100 cm 3, në të cilën fillimisht derdhen 20 cm 3 alkool etilik 96% dhe 0,2 cm 3 timolftaleinë 1%. Mostra është e titruar si në rastin e variantit të kontrollit.

Llogaritja e aktivitetit proteolitik të PS kryhet duke përdorur formulën:

,

Ku A është sasia e azotit amin të akumuluar gjatë eksperimentit nga mjedisi i reaksionit, ml;

T – kohëzgjatja e proteolizës, h;

P është një koeficient që merr parasysh hollimin dhe shndërrimin në 1 g bar ose 1 cm 3 tretësirë ​​të lëngshme enzimë.

Vlera A llogaritet duke përdorur formulën:

,

Ku a është sasia e tretësirës 0,1 N NaOH e përdorur për titrimin e 1 cm 3 të kampionit eksperimental, cm 3;

Dhe për - e njëjta gjë për mostrën e kontrollit;

1.4 – faktori i shndërrimit të sasisë së tretësirës së alkalit 0.1 N në miligramë azoti të aminoacideve dhe polipeptideve;

K – korrigjimi i titrit të alkalit.

Puna laboratorike nr.1

ROLI I ENZIMËVE NË PËRXHIMIN E REAGJEVE NË QELIZË

(Zbulimi I AKTIVITETIT TË KATALAZËS)

Synimi: zbuloni veprimin e enzimës katalazë në qelizat bimore dhe shtazore, krahasoni aktivitetin enzimatik të qelizave natyrore dhe të dëmtuara nga zierja.

Pajisjet: tretësirë ​​peroksid hidrogjeni 3%, copa patate të papërpunuara dhe të ziera dhe mish (mëlçi, mushkëri), epruveta.

Zbulimi i aktivitetit të katalazës

Katalaza është një enzimë që katalizon dekompozimin e peroksidit të hidrogjenit në formim oksigjen molekular, të lëshuara në formën e flluskave të gazit:

katalaza

2 H 2 O 2 _ → 2H 2 O + O 2

Peroksidi i hidrogjenit prodhohet në disa qeliza bimore dhe shtazore si një nënprodukt i reaksioneve redoks. Ky përbërës është toksik për qelizat dhe katalaza siguron heqjen e saj efektive. Katalaza është një nga enzimat që funksionon më shpejt: një molekulë katalaze dekompozon deri në 200,000 molekula peroksid hidrogjeni në një sekondë. Katalaza lokalizohet në vezikulat membranore të qelizave - mikrotrupat dhe peroksizomet.

Përparim

Merrni 4 epruveta të pastra dhe vendosni në të parën një sasi të vogël patate të grira imët, në të dytën - disa patate të ziera, në të tretën - copa mishi të grira imët (mëlçi, mushkëri), në të katërtën - pak të prera. mish i zier. Shtoni 3-4 ml në çdo epruvetë. 3% zgjidhje peroksid hidrogjeni. Vëzhgoni se çfarë ndodh në epruvetat. Regjistroni rezultatet e vëzhgimit në tabelë.

Aktiviteti enzimatik i qelizave natyrore dhe të dëmtuara

Shpjegoni rezultatet tuaja. Nxirrni një përfundim në lidhje me aktivitetin katalitik të katalazës në qelizat e gjalla dhe të vdekura.

përfundimi: ________

_______________

_______________

_____________

Pyetje kontrolli:

1. Çfarë janë enzimat? Cila strukturë e proteinave krijon aktivitetin e tyre?___________

2. Çfarë veti kanë enzimat?______

3. Çfarë quhet qendër aktive enzimë? Sa qendra të tilla mund të ketë një enzimë?_

4. Si i shpejtojnë enzimat reaksionet kimike?____________

5. *Alkooli, fenoli, kloramina dhe antiseptikët e tjerë përdoren në mjekësi për trajtimin e zonave të trupit të kontaminuara me florë patogjene. Shpjegoni pse._____

Gr.___3

Puna laboratorike nr.2

ZBULIMI I SUBSTANCAVE ORGANIKE

Synimi: të identifikojë substancat organike në inde (niseshte, proteina, yndyrna) dhe të studiojë vetitë e tyre.

Pajisjet: qese me garzë, kokrra gruri të bluara (miell gruri), tretësirë ​​jod 5%, fara luledielli (ose çdo kulturë tjetër vajore: pambuk, li, kikirikë, sojë, etj.).

Komponimet organike– substancat që përmbajnë karbon, karakteristikë e natyrës së gjallë, përbëjnë mesatarisht 20-30% të masës së qelizave të organizmave të gjallë. Vetitë kryesore të qelizave dhe organizmave përcaktohen nga polimere organike: proteinat, karbohidratet, acidet nukleike, si dhe lidhje komplekse– yndyrna dhe një sërë molekulash të hormoneve, pigmenteve, nukleotideve individuale, në veçanti ATP. Përveç kësaj çështje organike qelizat përmbajnë minerale dhe uji, por përmbajtja e substancave organike është gjithmonë më e lartë. Sasia e lëndës organike mund të ndryshojë.

Proteinat - polimere të parregullta ose informuese, monomerët e të cilëve janë aminoacide.

Në bazë të përbërjes së tyre, proteinat ndahen në:

- thjeshtë– përbëhet vetëm nga aminoacide. Për shembull, proteinat bimore janë prolamina, ato përmbahen në glutenin e farave të drithërave dhe nuk treten në ujë;

- komplekse– përveç aminoacideve, ato përmbajnë komponime të tjera organike (acidet nukleike, lipide, karbohidrate), komponime fosfori dhe metale. Prandaj, ato quhen: nukleoproteina, lipoproteina, glikoproteina, fosfo- dhe metaloproteina.

Karbohidratet - komponimet që përmbajnë karbon, hidrogjen dhe oksigjen. Ato ndahen në mono-, di- dhe polisaharide. Polisakaridet janë karbohidrate me peshë të lartë molekulare që përbëhen nga numer i madh monosakaridet, të tyre masë molekulareështë e madhe, molekulat kanë një strukturë lineare ose të degëzuar. Në aspektin funksional, dallohen polisaharidet për qëllime rezervë dhe strukturore. I pazgjidhshëm në ujë niseshte– polisaharid rezervë kryesor qelizat bimore(polimeri ά - glukozë); kur ekspozohet ndaj jodit bëhet blu; të përfshira në sasi të mëdha në zhardhokët, frutat, farat e patates. Glikogjeni- një polisaharid që gjendet në indet e trupit të njeriut dhe kafshëve, si dhe në kërpudha dhe maja, - luan rol i rendesishem në transformimin e karbohidrateve në qeliza. Fibra (celulozë)– polisaharid strukturor kryesor membranat qelizore bimët.

Lipidet dhe lipidet– yndyrna dhe substanca të ngjashme me yndyrat – komponimet organike me strukturë të ndryshme. Ata nuk treten në ujë, por treten mirë komponimet organike: eter, benzinë, kloroform etj.

Nga struktura kimike lipidet - komponimet e glicerinës - alkoolit trihidrik - me acide organike me peshë të lartë molekulare (yndyrore), nuk kanë strukturë polimer.

Përbërja e farës

(Sipas A.N. Bach dhe A.I. Oparin)

Të gjitha transformimet e ndryshme që formojnë bazën e funksioneve jetësore të trupit ndodhin me pjesëmarrjen e katalizatorëve biologjikë - enzimave, të cilat janë proteina specifike.

Falë enzimave, shfaqet një nga karakteristikat e jashtëzakonshme të qelizave të gjalla - aftësia për të kryer reaksionet më komplekse në shumë një kohë të shkurtër dhe në temperaturë trupore relativisht të ulët. Rëndësia biologjike ky fenomen është shumë i madh.

Për të studiuar veprimin e enzimave, është e nevojshme që ato të izolohen nga indet e gjalla. Në mënyrë tipike, për këtë zgjidhet një burim lehtësisht i disponueshëm i pasur me këtë enzimë. Për të transferuar enzimën në tretësirë, është e nevojshme të shkatërrohen muret qelizore, gjë që arrihet duke përdorur një homogjenizues, bluarje në llaç, ngrirje dhe shkrirje, autolizë, etj. Zakonisht, bëhet shkatërrimi i mureve qelizore. në një temperaturë të ulët, për shkak të së cilës të gjitha proceset enzimatike pezullohen në inde.

Grupi i enzimave redoks përfshin enzimën që përmban hem katalaza, i cili katalizon reaksionin e dekompozimit të peroksidit të hidrogjenit me çlirimin e oksigjenit molekular:

2 H 2 O 2 -- > 2 H 2 O + O 2

Katalaza gjendet në shumicën e indeve të një organizmi të gjallë.

Parimi i metodës.

Peroksidi i hidrogjenit zbërthehet nga katalaza. Teprica e peroksidit të hidrogjenit titrohet me permanganat kaliumi në një mjedis acid. Reagimi po vjen sipas ekuacionit:

2 KMnO 4 + 5 H 2 O 2 + 3 H 2 SO 4 -- > 2 MnSO 4 + K 2 SO 4 + 8 H 2 O + 5 O 2

Në eksperiment, përcaktohet sasia e peroksidit të hidrogjenit të pashkatërruar të mbetur, në kontroll - totalështë marrë peroksid hidrogjeni (katalaza në kampionin e kontrollit është inaktivizuar me zierje).

Duke zbritur rezultatet eksperimentale nga rezultatet e kontrollit, zbulojmë sasinë e peroksidit të hidrogjenit të shkatërruar në një periudhë të caktuar kohore, gjë që na lejon të gjykojmë aktivitetin e katalazës.

Pajisjet: 1. Bureta të drejta për 50 dhe 100 ml (1 copë secila)

2. Cilindri 10 ml

3. Llaç dhe shtyp

4. Balona konike 200-250 ml (2 copë)

5. Peshore teknike me pesha

6. 10 ml pipetë "ekstrakt enzimë"

7. Pipeta "H 2 SO 4"

8. Banja me ujë të vluar

9. Spatula

10. Balonë vëllimore 100 ml

11. Gyp

12. Letër filtri

Materiale: 1. Material i freskët bimor (karrota ose patate)

2. Tretësirë ​​0,1 N e H 2 O 2

3. Tretësirë ​​0,1 N e KMnO4

4. Tretësirë ​​10% e H 2 SO 4

5. CaCO 3 (kristal)

6. Rërë kuarci

Progresi:

2 g patate të papërpunuara (ose karota) grihen me rërë kuarci në llaç, duke shtuar gradualisht 2-3 ml ujë. Për të reduktuar reaksionin e acidit, shtoni karbonat kalciumi në majë të shpatullës derisa flluska të ndalojë. dioksid karboni. Masa e bluar transferohet në mënyrë sasiore në një balonë vëllimore dhe rregullohet në 100 ml me ujë. Përzierja lihet të qëndrojë për 30-60 minuta dhe më pas filtrohet.

Në një balonë konike 200 ml, merrni 25 ml tretësirë ​​peroksid hidrogjeni 0,1 N nga një biretë dhe shtoni 20 ml ekstrakt enzimë me një pipetë. Pas 30 minutash, veprimi i enzimës ndërpritet duke shtuar 5 ml tretësirë ​​10% të acidit sulfurik dhe përzierja titrohet me një tretësirë ​​0,1 N të permanganatit të kaliumit (derisa një ngjyrë rozë zgjat rreth 1 minutë). Vërehet numri i mililitrave të tretësirës së permanganatit të kaliumit të përdorur për të titruar peroksidin e mbetur të hidrogjenit.

Në të njëjtën kohë, vendoset një kontroll me ngrohje të inaktivizuar në një banjë me ujë të vluar për 5 minuta me një zgjidhje enzimë (20 ml), pas ftohjes, në këtë tretësirë ​​shtohen 25 ml një zgjidhje peroksidi hidrogjeni 0.1 N. Përzierja lihet të qëndrojë për 30 minuta, pas së cilës shtohen 5 ml tretësirë ​​të acidit sulfurik 10% dhe titrohet me një tretësirë ​​0,1 N të permanganatit të kaliumit. Vërehet numri i mililitrave të permanganatit të kaliumit të përdorur për të titruar sasinë totale të peroksidit të hidrogjenit.

Nga diferenca midis titrimit eksperimental dhe atij të kontrollit, gjendet sasia e permanganatit ekuivalente me sasinë e peroksidit të hidrogjenit të dekompozuar. Sipas ekuacionit të reaksionit ndërmjet KMnO 4 dhe H 2 O 2, 1 ml tretësirë ​​0,1 N të permanganatit të kaliumit korrespondon me 1,7 mg peroksid hidrogjeni.

Shembull i llogaritjes.

Një ekstrakt katalazë prej 100 ml u përgatit nga 1,25 g karota. Titrimi i kampionit eksperimental kërkoi 15,5 ml, dhe kampionit të kontrollit - 30,2 ml të një zgjidhjeje 0,1 N të permanganatit të kaliumit. Sasia e peroksidit të hidrogjenit të dekompozuar në mostër është e barabartë me 30,2-15,5 = 14,7 ml tretësirë ​​0,1 N të permanganatit të kaliumit dhe, për rrjedhojë, e barabartë me 14,7 * 1,7 = 24,99 mg.

1 g karrota të papërpunuara përmban një sasi katalaze të aftë për të dekompozuar (24,99*100)/(20*1,25)=99,96 mg peroksid hidrogjeni në 30 minuta dhe 99,96/30=3,33 mg në 1 minutë. Sepse

1 μmol peroksid hidrogjeni është 0,034 mg, pastaj në 1 g karrota ka 33,3/0,034 = 100 U katalazë.

Puna laboratorike nr.4

Përgatitja e saharazës nga qelizat e majave. Specifikimi i veprimit të enzimës.

Të gjitha të ndryshme transformimet kimike, të cilat formojnë bazën e funksioneve jetësore të trupit, ndodhin me pjesëmarrjen e katalizatorëve biologjikë - enzimave, të cilat janë proteina specifike.

Falë enzimave, shfaqet një nga veçoritë e jashtëzakonshme të qelizave të gjalla - aftësia për të kryer reaksione komplekse në një kohë shumë të shkurtër dhe në një temperaturë relativisht të ulët të trupit.

Studimi i vetive të enzimave, kushtet e veprimit të tyre, përcaktimi i përmbajtjes së enzimave në organe dhe inde të ndryshme ka rëndësi të madhe Për të kuptuarit e saktë procese komplekse aktiviteti jetësor i trupit.

Nje nga vetitë më të rëndësishme enzimat është specifika e veprimit të tyre në lidhje me një substrat të caktuar. Specifikimi i vetive katalitike të enzimave manifestohet në faktin se enzima, si rregull, vepron vetëm në substancë të caktuar. Specifikimi i rreptë i enzimave tregohet edhe nga fakti se në rastet e stereoizomerizmit, një enzimë e veçantë katalizon ndarjen e vetëm një stereoizomeri. Specifikimi i enzimave është më i rëndësishmi i tyre veti biologjike, pa të cilin metabolizmi i rregullt është i pamundur.

Ky punim shqyrton proceset e ndarjes nga enzima sukraza e substratit - saharoza dhe zbërthimi i niseshtës nga enzima - amilaza, e cila gjendet në pështymën e njeriut.

Nxjerrja e saharazës nga qelizat e majave

Materialet dhe reagentët:

· Maja e shtypur – 10 g

Homogjenizues (llaç dhe shtypës)

· Rërë kuarci

· Uje i distiluar

Përparim

Vendosni 10 gram maja të thatë në një llaç, shtoni 10 ml ujë të distiluar dhe homogjenizoni në një llaç porcelani me një sasi të vogël. rërë kuarci për të shkatërruar muret e qelizave. Më pas vendosim llaçin e porcelanit me homogjenatin në një kabinet tharjeje në temperaturë 60 0 C për 30-40 minuta.

Pas kohës së caktuar, hiqni llaçin, ftohni, shtoni 30 ml ujë të distiluar dhe bluajeni përmbajtjen e llaçit derisa të jetë e qetë.

Më pas homogjenizimi, për të sedimentuar masën qelizore, centrifugohet me 3000 rpm për 15 minuta. Supernatanti që rezulton është ekstrakt i saharazës.