Enciklopedični YouTube
-
1 / 5
Genski inženiring služi pridobivanju želenih lastnosti spremenljivega ali gensko spremenjenega organizma. Za razliko od tradicionalne selekcije, pri kateri se genotip spreminja le posredno, genski inženiring omogoča neposreden poseg v genetski aparat s tehniko molekularnega kloniranja. Primeri uporabe genskega inženiringa so pridelava novih gensko spremenjenih sort žitaric, proizvodnja humanega insulina z uporabo gensko spremenjenih bakterij, proizvodnja eritropoetina v celični kulturi ali nove pasme poskusnih miši za znanstvene raziskave.
Osnova mikrobiološke, biosintetske industrije je bakterijska celica. Celice, potrebne za industrijsko proizvodnjo, so izbrane glede na določene lastnosti, med katerimi je najpomembnejša sposobnost proizvodnje, sinteze in hkrati v največji možni meri. možne količine, določena spojina - aminokislina ali antibiotik, steroidni hormon ali organska kislina. Včasih je treba imeti mikroorganizem, ki lahko na primer uporabi nafto ali odpadno vodo kot »hrano« in jo predela v biomaso ali celo beljakovine, povsem primerne za krmne dodatke. Včasih potrebujemo organizme, ki se lahko razvijejo pri povišanih temperaturah ali ob prisotnosti snovi, ki so gotovo smrtonosne za druge vrste mikroorganizmov.
Naloga pridobivanja takšnih industrijskih sevov je zelo pomembna, za njihovo modifikacijo in selekcijo so bile razvite številne metode aktivnega vpliva na celice - od zdravljenja z močnimi strupi do izpostavljenost sevanju. Cilj teh tehnik je en - doseči spremembe v dednem, genetskem aparatu celice. Njihov rezultat je proizvodnja številnih mutiranih mikrobov, izmed stotin in tisočev katerih nato znanstveniki skušajo izbrati najprimernejšega za določen namen. Ustvarjanje tehnik kemične ali radiacijske mutageneze je bil izjemen dosežek v biologiji in se pogosto uporablja v sodobni biotehnologiji.
Toda njihove zmogljivosti so omejene z naravo samih mikroorganizmov. Niso sposobni sintetizirati številnih dragocenih snovi, ki se kopičijo v rastlinah, predvsem v zdravilnih in eteričnih oljnicah. Ne morejo sintetizirati snovi, ki so zelo pomembne za življenje živali in ljudi, številnih encimov, peptidnih hormonov, imunskih proteinov, interferonov in mnogih enostavnejših spojin, ki se sintetizirajo v telesu živali in ljudi. Možnosti mikroorganizmov seveda še zdaleč niso izčrpane. Od vsega obilja mikroorganizmov pa le nepomemben delež. Za selekcijo mikroorganizmov so zelo zanimive na primer anaerobne bakterije, ki lahko živijo v odsotnosti kisika, fototrofi, ki izkoriščajo svetlobno energijo kot rastline, kemoavtotrofi, termofilne bakterije, ki lahko živijo pri temperaturah, kot so pred kratkim ugotovili, okoli 110 °C itd.
In vendar omejitve naravni material"je očitno. Omejitve so skušali in skušajo zaobiti s pomočjo celičnih in tkivnih kultur rastlin in živali. To je zelo pomembna in obetavna pot, ki se uveljavlja tudi v biotehnologiji. V zadnjih nekaj desetletjih so znanstveniki razvili metode, s katerimi lahko posamezne celice rastlinskega ali živalskega tkiva rastejo in se razmnožujejo ločeno od telesa, kot so bakterijske celice. Bilo je pomemben dosežek- dobljene celične kulture se uporabljajo za poskuse in za industrijske proizvodnje nekatere snovi, ki jih ni mogoče pridobiti z uporabo bakterijskih kultur.
Druga smer raziskovanja je odstranjevanje iz DNK genov, ki so nepotrebni za kodiranje proteinov in delovanje organizmov ter ustvarjanje genov na osnovi takšne DNK umetni organizmi z »okrnjenim naborom« genov. To omogoča dramatično povečanje odpornosti spremenjenih organizmov na viruse.
Zgodovina razvoja in dosežena raven tehnologije
V drugi polovici 20. stoletja je prišlo do številnih pomembnih odkritij in izumov, ki so osnova genski inženiring. Večletni poskusi »branja« bioloških informacij, ki so »zapisane« v genih, so bili uspešno zaključeni. To delo sta začela angleški znanstvenik Frederick Sanger in ameriški znanstvenik Walter Gilbert (Nobelova nagrada za kemijo 1980). Kot je znano, geni vsebujejo informacije-navodila za sintezo molekul RNA in beljakovin, vključno z encimi, v telesu. Da bi celico prisilili, da sintetizira nove zanjo nenavadne snovi, je potrebno, da se v njej sintetizirajo ustrezni sklopi encimov. In za to je potrebno bodisi namensko spremeniti gene, ki se nahajajo v njem, bodisi vanj vnesti nove, prej odsotne gene. Spremembe genov v živih celicah so mutacije. Pojavijo se pod vplivom, na primer, mutagenov - kemičnih strupov ali sevanja. Toda takih sprememb ni mogoče nadzorovati ali usmerjati. Zato so znanstveniki svoja prizadevanja usmerili v poskuse razvoja metod za vnos novih, zelo specifičnih genov, ki jih potrebuje človek, v celice.
Glavne faze reševanja problema genskega inženiringa so naslednje:
- Pridobivanje izoliranega gena.
- Vnos gena v vektor za prenos v telo.
- Prenos vektorja z genom v spremenjeni organizem.
- Preoblikovanje telesnih celic.
- Genetska selekcija spremenjeni organizmi (GSO) in odstranjevanje tistih, ki niso bili uspešno spremenjeni.
Proces sinteze genov je zdaj zelo dobro razvit in celo v veliki meri avtomatiziran. Obstajajo posebne naprave, opremljene z računalniki, v pomnilniku katerih so shranjeni programi za sintezo različnih nukleotidnih zaporedij. Ta aparat sintetizira segmente DNA do dolžine 100-120 dušikovih baz (oligonukleotidi). Razširjena je postala tehnika, ki omogoča uporabo verižne reakcije s polimerazo za sintezo DNK, vključno z mutirano DNK. Uporablja se termostabilni encim DNA polimeraza matrična sinteza DNK, za katero se kot seme uporabijo umetno sintetizirani koščki nukleinska kislina- oligonukleotidi. Encim reverzna transkriptaza omogoča, da z uporabo takšnih primerjev sintetiziramo DNA na matrici RNA, izolirane iz celic. Tako sintetizirana DNA se imenuje komplementarna DNA (RNA) ali cDNA. Izoliran, "kemično čist" gen lahko pridobimo tudi iz knjižnice fagov. Tako se imenuje pripravek bakteriofaga, v genom katerega so vgrajeni naključni delci iz genoma ali cDNA, ki jih fag razmnožuje skupaj z vso svojo DNA.
Tehnika vnosa genov v bakterije se je razvila po tem, ko je Frederick Griffith odkril pojav bakterijske transformacije. Ta pojav temelji na primitivnem spolnem procesu, ki ga pri bakterijah spremlja izmenjava majhnih fragmentov nekromosomske DNK, plazmidov. Plazmidne tehnologije so bile osnova za vnos umetnih genov v bakterijske celice.
Znatne težave so bile povezane z vnosom že pripravljenega gena v dedni aparat rastlinskih in živalskih celic. Vendar pa v naravi obstajajo primeri, ko se tuja DNK (virusa ali bakteriofaga) vključi v genetski aparat celice in s pomočjo svojih presnovnih mehanizmov začne sintetizirati "svoj" protein. Znanstveniki so preučevali značilnosti vnosa tuje DNK in ga uporabili kot princip vnosa genetski material v kletko. Ta proces se imenuje transfekcija.
Če so enocelični organizmi ali večcelične celične kulture predmet modifikacije, se na tej stopnji začne kloniranje, to je selekcija tistih organizmov in njihovih potomcev (klonov), ki so bili spremenjeni. Kdaj je naloga zastavljena za pridobitev večcelični organizmi, nato celice s spremenjenim genotipom uporabimo za vegetativno razmnoževanje rastlin ali vnesemo v blastociste nadomestne matere, ko gre za živali. Posledično se skotijo mladiči s spremenjenim ali nespremenjenim genotipom, med katerimi so izbrani in medsebojno križani le tisti, ki izkazujejo pričakovane spremembe.
Uporaba v znanstvenih raziskavah
Čeprav v majhnem obsegu, se genski inženiring že uporablja, da ženskam z nekaterimi vrstami neplodnosti omogoči zanositev. V ta namen se uporabljajo jajčeca zdrave ženske. Posledično otrok podeduje genotip enega očeta in dveh mater.
Vendar se možnost pomembnejših sprememb človeškega genoma sooča s številnimi resnimi izzivi. etični problemi. Leta 2016 je v Združenih državah Amerike skupina znanstvenikov prejela dovoljenje za klinična preskušanja metode zdravljenja raka z uporabo pacientovih lastnih imunskih celic, ki so bile podvržene genski spremembi s tehnologijo CRISPR / Cas9.
Celični inženiring
Celični inženiring temelji na gojenju rastlinskih in živalskih celic ter tkiv, ki so sposobna izven telesa proizvajati človeku potrebne snovi. Ta metoda se uporablja za klonsko (nespolno) razmnoževanje dragocenih rastlinskih oblik; za pridobivanje hibridnih celic, ki združujejo lastnosti na primer krvnih limfocitov in tumorskih celic, kar omogoča hitro pridobivanje protiteles.
Genski inženiring v Rusiji
Ugotovljeno je, da se je po uvedbi državne registracije GSO dejavnost nekaterih javne organizacije in posamezni poslanci Državna duma poskuša preprečiti uvedbo inovativnih biotehnologij v rusko kmetijstvo. Več kot 350 ruskih znanstvenikov je podpisalo odprto pismo Društva znanstvenih delavcev v podporo razvoju genskega inženiringa v Ruska federacija. IN odprto pismo Opozoriti je treba, da prepoved gensko spremenjenih organizmov v Rusiji ne bo le škodila zdravi konkurenci na kmetijskem trgu, ampak bo povzročila znatno zaostajanje na področju tehnologij proizvodnje hrane, povečalo odvisnost od uvoza hrane in bo spodkopala ugled Rusije kot stanje, v katerem je politika na inovativni razvoj [pomen dejstva? ] .
Glej tudi
Opombe
- Aleksander Pančin Premagati Boga // Popularna mehanika. - 2017. - št. 3. - Str. 32-35. - URL: http://www.popmech.ru/magazine/2017/173-issue/
- In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitega sistema TALEN (angleščina) . Narava. Pridobljeno 10. januarja 2017.
- Elements - novice znanstva: opice ozdravljene barvne slepote z gensko terapijo (nedefinirano) (18. september 2009). Pridobljeno 10. januarja 2017.
V sodobnem svetu je težko najti osebo, ki ne bi slišala ničesar o uspehih genskega inženiringa.
Danes je to eden najbolj obetavnih načinov za razvoj biotehnologije, izboljšanje kmetijske proizvodnje, medicine in številnih drugih panog.Kaj je genski inženiring?
Kot veste, so dedne lastnosti katerega koli živega bitja zapisane v vsaki celici telesa v obliki niza genov - elementov kompleksnih beljakovinskih molekul. Z vnosom tujega gena v genom živega bitja lahko spremenite lastnosti nastalega organizma in v desna stran: narediti pridelek bolj odporen proti zmrzali in boleznim, dati rastlini nove lastnosti itd.
Organizmi, pridobljeni kot posledica takšne spremembe, se imenujejo gensko spremenjeni ali transgeni in znanstvena disciplina, ki se ukvarja z raziskovanjem modifikacij in razvojem transgenih tehnologij – genetskega oziroma genskega inženiringa.
Objekti genskega inženiringa
Najpogostejši objekti raziskav genskega inženiringa so mikroorganizmi, rastlinske celice in nižje živali, potekajo pa tudi raziskave na celicah sesalcev in celo na celicah človeškega telesa. Praviloma je neposredni predmet raziskovanja molekula DNK, očiščena iz drugih celičnih snovi. S pomočjo encimov se DNK razdeli na ločene odseke, pri čemer je pomembno, da znamo želeni odsek prepoznati in izolirati, ga s pomočjo encimov prenesti in integrirati v strukturo druge DNK.
Sodobne tehnike že omogočajo povsem svobodno manipuliranje s segmenti genoma, razmnoževanje zahtevano območje dedno verigo in jo vstavite namesto drugega nukleotida v prejemnikovo DNK. Nabranih je bilo precej izkušenj in zbranih je bilo veliko informacij o zakonih strukture dedni mehanizmi. Kmetijske rastline se praviloma preoblikujejo, kar je že omogočilo znatno povečanje pridelave osnovnih živilskih rastlin.
Zakaj je potreben genski inženiring?
Do sredine dvajsetega stoletja tradicionalne metode niso več ustrezale znanstvenikom, saj ima ta smer številne resne omejitve:
- nemogoče je križati nesorodne vrste živih bitij;
- proces rekombinacije genetskih lastnosti ostaja neobvladljiv in potrebne lastnosti pojavijo se v potomcih kot posledica naključnih kombinacij, medtem ko se zelo velik odstotek potomcev šteje za neuspešne in se pri selekciji zavržejo;
- Nemogoče je natančno določiti želene lastnosti pri križanju;
- Postopek vzreje traja leta in celo desetletja.
Naravni mehanizem za ohranjanje dednih lastnosti je izjemno stabilen in tudi pojav potomcev z želenimi lastnostmi ne zagotavlja ohranitve teh lastnosti v naslednjih generacijah.Genski inženiring nam omogoča premagovanje vseh zgoraj naštetih težav. S pomočjo transgenih tehnologij je mogoče ustvariti organizme z določenimi lastnostmi z zamenjavo posameznih delov genoma z drugimi, vzetimi iz živih bitij, ki pripadajo drugim vrstam. Hkrati se bistveno zmanjša čas, potreben za ustvarjanje novih organizmov. Ni potrebe po pripenjanju potrebni znaki, zaradi česar so dedni, saj je vedno mogoče gensko spremeniti naslednje serije, s čimer se proces dobesedno zažene.
Faze nastanka transgenega organizma
- Izolacija izoliranega gena z potrebne lastnosti. Danes za to obstajajo precej zanesljive tehnologije, obstajajo celo posebej pripravljene genske knjižnice.
- Vstavljanje gena v vektor za prenos. Za to se ustvari poseben konstrukt - transgen z enim ali več segmenti DNA in regulatornimi elementi, ki se vstavi v vektorski genom in podvrže kloniranju z uporabo ligaz in restrikcijskih encimov. Kot vektor se običajno uporablja krožna bakterijska DNA – plazmidi.
- Vgradnja vektorja v telo prejemnika. Ta proces je prepisan iz podobnega naravnega procesa vstavljanja virusne ali bakterijske DNK v gostiteljske celice in deluje na enak način.
- Molekularno kloniranje. V tem primeru se celica, ki je bila spremenjena, uspešno deli, pri čemer nastane veliko novih hčerinskih celic, ki vsebujejo spremenjen genom in sintetizirajo beljakovinske molekule z določenimi lastnostmi.
- GSO izbor. Zadnja stopnja se ne razlikuje od običajnega vzrejnega dela.
Je genski inženiring varen?
Vprašanje, kako varne so transgene tehnologije, se občasno postavlja tako v znanstveni skupnosti kot v medijih, ki so daleč od znanosti. Na to še vedno ni dokončnega odgovora.
Prvič, genski inženiring ostaja dokaj novo področje biotehnologije in statistični podatki, ki bi nam omogočili objektivne zaključke o tem problemu, se še niso nabrali.
Drugič, ogromne investicije v genski inženiring s strani multinacionalnih živilskih korporacij so lahko dodaten razlog za pomanjkanje resnih raziskav.
Vendar pa je zakonodaja mnogih držav uvedla predpise, ki obvezujejo proizvajalce, da na embalaži izdelkov skupine živil navedejo prisotnost GSO proizvodov. Vsekakor je genski inženiring že dokazal visoko učinkovitost svojih tehnologij in nadaljnji razvoj ljudem obljublja še več uspehov in dosežkov.Uvod
Pri svojem delu raziskujem tematiko genskega inženiringa. Priložnosti, ki jih je genski inženiring odprl človeštvu, tako na terenu temeljna znanost, in na mnogih drugih področjih, so zelo velike in pogosto celo revolucionarne.
Tako omogoča industrijsko množično proizvodnjo potrebne beljakovine, naredi veliko lažje tehnološki procesi za pridobivanje produktov fermentacije - encimov in aminokislin, v prihodnosti se lahko uporablja za izboljšanje rastlin in živali, pa tudi za zdravljenje dednih bolezni ljudi.
Tako je genski inženiring ena glavnih smeri znanstveni in tehnološki napredek, aktivno prispeva k pospešenemu reševanju številnih problemov, kot so prehranska, kmetijska, energetska in okoljska vprašanja.
Ampak predvsem velike priložnosti Genski inženiring odpira medicino in farmacijo, saj lahko uporaba genskega inženiringa povzroči korenite preobrazbe v medicini.
1. Esenca genski inženiring.
1.1. Zgodovina genskega inženiringa.
Genski inženiring se je pojavil zahvaljujoč delu številnih raziskovalcev v različne industrije biokemija in molekularna genetika.
Dolga leta so beljakovine veljale za glavni razred makromolekul. Obstajala je celo domneva, da so geni beljakovinske narave.
Šele leta 1944 so Avery, McLeod in McCarthy dokazali, da je DNK nosilec dednih informacij.
Od tega časa se je začelo intenzivno preučevanje nukleinskih kislin. Desetletje kasneje, leta 1953, sta J. Watson in F. Crick ustvarila model dvoverižne DNK. Letošnje leto velja za rojstno leto molekularne biologije.
Na prelomu 50. in 60. let prejšnjega stoletja so bile pojasnjene lastnosti genetske kode, do konca 60. let pa je bila njegova univerzalnost eksperimentalno potrjena.
Prišlo je do intenzivnega razvoja molekularne genetike, katere objekti so bili Escherichia coli (E. Coli), njeni virusi in plazmidi.
Razvite so bile metode za izolacijo visoko prečiščenih pripravkov intaktnih molekul DNK, plazmidov in virusov.
DNK virusov in plazmidov smo v celice vnesli biološko aktivna oblika, ki zagotavlja njegovo replikacijo in izražanje ustreznih genov.
V 70. letih so odkrili številne encime, ki katalizirajo reakcije pretvorbe DNA. Posebna vloga pri razvoju metod genskega inženiringa sodi restrikcijskim encimom in DNA ligazam.
Zgodovino razvoja genskega inženiringa lahko razdelimo na tri faze:
Prva stopnja je povezana z dokazovanjem temeljne možnosti pridobivanja rekombinantnih molekul DNA in vitro. Ta dela se nanašajo na proizvodnjo hibridov med različnimi plazmidi. Možnost ustvarjanja rekombinantnih molekul z uporabo originalnih molekul DNK iz različne vrste in bakterijskih sevov, njihovo sposobnost preživetja, stabilnost in delovanje.
Druga faza je povezana z začetkom dela na pridobivanju molekul rekombinantne DNA med kromosomski geni prokariontov in različnih plazmidov, dokaz njihove stabilnosti in sposobnosti preživetja.
Tretja faza je začetek dela na vključevanju evkariontskih genov, predvsem živali, v vektorske DNK molekule (DNK, ki se uporablja za prenos genov in se lahko vgradi v genetski aparat prejemne celice).
Formalno je treba datum rojstva genskega inženiringa šteti za leto 1972, ko sta na univerzi Stanford P. Berg in S. Cohen s sodelavci ustvarila prvo rekombinantno DNK, ki je vsebovala fragmente DNK virusa SV40, bakteriofaga in E. coli.
1.2. Koncept genskega inženiringa
Ena od vej molekularne genetike in molekularne biologije, ki je našla največjo praktična uporaba, je genski inženiring.
Gensko inženirstvo je skupek metod, ki omogočajo prenos genov iz enega organizma v drugega, oziroma je tehnologija za ciljno gradnjo novih bioloških objektov.
Rojena v začetku 70. let prejšnjega stoletja je danes dosegla velik uspeh. Tehnike genskega inženiringa spreminjajo celice bakterij, kvasovk in sesalcev v »tovarne« za obsežno proizvodnjo katere koli beljakovine.
To omogoča podrobno analizo strukture in funkcij beljakovin ter njihovo uporabo kot zdravila.
Trenutno je Escherichia coli (E. coli) postala dobavitelj tako pomembnih hormonov, kot sta insulin in somatotropin.
Prej je bil insulin pridobljen iz živalskih celic trebušne slinavke, zato je bil njegov strošek zelo visok. Za pridobitev 100 g kristalnega insulina je potrebnih 800-1000 kg trebušne slinavke, ena žleza krave pa tehta 200-250 gramov. Zaradi tega je bil insulin drag in težko dostopen. širok razpon diabetiki.
Insulin je sestavljen iz dveh polipeptidnih verig A in B, dolgih 20 in 30 aminokislin. Ko se povežejo z disulfidnimi vezmi, nastane nativni dvoverižni insulin.
Dokazano je, da ne vsebuje proteinov E. coli, endotoksinov in drugih nečistoč, ne povzroča stranskih učinkov kot živalski inzulin in se od njega ne razlikuje po biološkem delovanju.
Somatotropin je človeški rastni hormon, ki ga izloča hipofiza. Pomanjkanje tega hormona vodi do hipofizne pritlikavosti. Če se somatotropin daje v odmerkih 10 mg na 1 kg teže trikrat na teden, lahko v enem letu otrok, ki trpi zaradi njegovega pomanjkanja, zraste za 6 cm.
Prej je bil pridobljen iz kadveričnega materiala, iz enega trupla: 4 - 6 mg somatotropina glede na končni farmacevtski pripravek. Tako so bile razpoložljive količine hormona omejene, poleg tega pa je bil s to metodo pridobljen hormon heterogen in je lahko vseboval počasi rastoče viruse.
Leta 1980 je podjetje Genentec razvilo tehnologijo za proizvodnjo somatotropina z uporabo bakterij, ki je bila brez teh pomanjkljivosti. Leta 1982 so na Pasteurjevem inštitutu v Franciji pridobili človeški rastni hormon v kulturi E. coli in živalskih celic, leta 1984 pa se je v ZSSR začela industrijska proizvodnja insulina.
1.3. Cilji in cilji genskega inženiringa
Cilj uporabnega genskega inženiringa je oblikovati takšne rekombinantne molekule DNA, ki bi ob vnosu v genetski aparat dale telesu uporabne lastnosti za človeka.
Tehnologija rekombinantne DNK temelji na izdelavi visoko specifičnih DNK sond, s pomočjo katerih proučujejo izražanje genov v tkivih, lokalizacijo genov v kromosomih in identificirajo gene, ki imajo povezane funkcije(na primer pri ljudeh in kokoših). V diagnostiki se uporabljajo tudi DNK sonde razne bolezni.
Tehnologija rekombinantne DNK je omogočila nekonvencionalen pristop protein-gen, imenovan reverzna genetika. Pri tem pristopu se protein izolira iz celice, gen za ta protein se klonira in se spremeni, tako da nastane mutantni gen, ki kodira spremenjeno obliko proteina. Nastali gen se vnese v celico. Na ta način lahko popravimo okvarjene gene in zdravimo dedne bolezni.
Če hibridno DNK vnesemo v oplojeno jajčece, lahko dobimo transgene organizme, ki prenašajo mutirani gen na svoje potomce.
Genetska transformacija živali omogoča ugotavljanje vloge posameznih genov in njihovih beljakovinskih produktov tako pri uravnavanju delovanja drugih genov kot pri različnih patoloških procesih.
Uporablja tehnologijo rekombinantne DNK naslednje metode:
·specifična cepitev DNA z restrikcijskimi nukleazami, pospešitev izolacije in manipulacije posameznih genov;
·hitro sekvenciranje vseh nukleotidov v prečiščenem fragmentu DNA, ki omogoča določitev meja gena in aminokislinskega zaporedja, ki ga kodira;
·gradnja rekombinantne DNA;
·hibridizacija nukleinskih kislin, ki omogoča identifikacijo specifičnih zaporedij RNA ali DNA z večjo natančnostjo in občutljivostjo;
Kloniranje DNA: pomnoževanje in vitro z verižno reakcijo s polimerazo ali vnos fragmenta DNA v bakterijsko celico, ki po takšni transformaciji ta fragment razmnoži v milijonih kopij;
·Vnos rekombinantne DNA v celice ali organizme.
2.
2.1. Izolacija genov, ki vsebujejo potrebne informacije.
Gene lahko pridobimo na več načinov: z izolacijo iz DNK, kemično-encimsko sintezo in encimsko sintezo.
Izolacija genov iz DNK poteka z uporabo restrikcijskih encimov, ki katalizirajo cepitev DNK na področjih, ki imajo določena nukleotidna zaporedja (4–7 nukleotidnih parov). Cepitev se lahko izvede na sredini prepoznavne regije nukleotidnih parov; v tem primeru sta obe verigi DNK "prerezani" na isti ravni. Nastali fragmenti DNK imajo tako imenovane "tope" konce. Cepitev DNA je možna s premikom, pri čemer ena od verig štrli za več nukleotidov. "Lepljivi" konci, ki nastanejo v tem primeru, zaradi svoje komplementarnosti medsebojno delujejo. Nukleotidno zaporedje z lepljivimi konci je mogoče pritrditi na vektor (predhodno obdelan z istim restrikcijskim encimom) in pretvoriti v krožno zaporedje kot rezultat navzkrižnega povezovanja medsebojno komplementarnih koncev z ligazami. Metoda ima precejšnje pomanjkljivosti, saj je precej težko izbrati delovanje encimov za strogo izolacijo želenega gena. Skupaj z genom se ujamejo "dodatni" nukleotidi ali, nasprotno, encimi odrežejo del gena in ga spremenijo v funkcionalno okvarjen.
Kemijsko-encimska sinteza se uporablja, če je poznana primarna struktura protein ali peptid, katerega sintezo kodira gen. Potrebno je popolno poznavanje nukleotidnega zaporedja gena. Ta metoda vam omogoča natančno ustvarjanje želenega nukleotidnega zaporedja, kot tudi uvedbo prepoznavnih mest za restrikcijske encime, regulacijske sekvence itd. Metoda je sestavljena iz kemična sinteza fragmenti enoverižne DNA (oligonukleotidi) zaradi postopnega nastajanja estrskih vezi med nukleotidi, običajno 8–16 enot. Trenutno obstajajo »genski stroji«, ki pod nadzorom mikroprocesorja zelo hitro sintetizirajo specifične kratke sekvence enoverižne DNK
Želeno zaporedje baz vnesemo na tipkovnico. Mikroprocesor odpre ventile, skozi katere se s pomočjo črpalke nukleotidi, pa tudi potrebni reagenti in topila zaporedno dovajajo v sintezno kolono. Kolona je napolnjena s silicijevimi kroglicami, na katerih so zbrane molekule DNK. Ta naprava lahko sintetizira verige do 40 nukleotidov v dolžino s hitrostjo 1 nukleotida v 30 minutah. Nastali oligonukleotidi so zamreženi med seboj z uporabo DNA ligaze, da tvorijo dvoverižni nukleotid. Z uporabo ta metoda pridobljeni so bili geni za A- in B-verige inzulina, proinzulina, somatostatina itd.
Encimska sinteza genov na osnovi izolirane messenger RNA (mRNA) je trenutno najpogostejša metoda. Najprej se iz celic izolirajo messenger RNA, med katerimi je mRNA, kodirana z genom, ki ga je treba izolirati. Nato se pod odobrenimi pogoji sintetizira veriga DNA, ki je komplementarna mRNA (cDNA), na mRNA, izolirani iz celice, kot na matriksu, z uporabo reverzne transkriptaze (revertaze). Nastala komplementarna DNA (cDNA) služi kot matrica za sintezo druge verige DNA z uporabo DNA polimeraze ali reverzne seze. Primer je v tem primeru oligonukleotid, komplementaren 3’ koncu mRNA; iz deoksinukleozid trifosfatov v prisotnosti magnezijevih ionov nastane nova veriga DNA.
Metoda z velik uspeh leta 1979 uporabili za pridobitev gena za človeški rastni hormon (somatotropin). Gen, pridobljen na tak ali drugačen način, vsebuje informacije o strukturi proteina, vendar ga sam ne more implementirati. Zato so potrebni dodatni mehanizmi za nadzor delovanja gena. Prenos genetske informacije v prejemno celico poteka kot del vektorja. Vektor je praviloma krožna molekula DNK, ki je sposobna samostojnega podvajanja. Gen skupaj z vektorjem tvori rekombinantno DNA.
2.2. Selekcija vektorjev (virusi, plazmidi), sposobnih samostojnega razmnoževanja v prejemni celici.
Izraz "vektor" pomeni molekulo nukleinske kisline, ki lahko po vnosu v celico avtonomen obstoj zaradi prisotnosti replikacijskih in transkripcijskih signalov v njem.
Vektorske molekule morajo imeti naslednje lastnosti:
1) sposobnost avtonomnega podvajanja v prejemni celici, to je, da je neodvisen replikon;
Glede na cilje poskusa lahko vektorje razdelimo v dve skupini: 1) za kloniranje in pomnoževanje želenega gena; 2) specializirani, ki se uporabljajo za izražanje vgrajenih tujih genov. Druga skupina vektorjev združuje vektorje, ki zagotavljajo sintezo beljakovinskih produktov kloniranih genov. Ekspresijski vektorji vsebujejo sekvence DNA, ki so potrebne za transkripcijo kloniranih kopij genov in translacijo njihove mRNA v celičnih sevih.
Plazmidi in bakteriofagi se uporabljajo kot prokariontski vektorji; Kot evkariontske vektorje se uporabljajo živalski in rastlinski virusi, vektorji na osnovi 2 μm kvasovk in mitohondrijev ter številni umetno zgrajeni vektorji, ki se lahko razmnožujejo v bakterijskih in evkariontskih celicah (shuttle vektorji).
Plazmidi so ekstrakromosomski genetski elementi pro- in evkariontov, ki se avtonomno razmnožujejo v celicah. Večina plazmidnih vektorjev izhaja iz naravnih plazmidov ColE1, pMB1 in p15A.
Bakterijski plazmidi so razdeljeni v dva razreda. Nekateri plazmidi (na primer dobro raziskan faktor F, ki določa spol pri E. coli) so sami sposobni premikanja iz celice v celico, drugi pa te sposobnosti nimajo. Zaradi številnih razlogov, predvsem pa zaradi preprečevanja nenadzorovanega širjenja potencialno nevarnega genskega materiala, velika večina bakterijskih plazmidnih vektorjev temelji na drugem razredu plazmidov. Veliko naravnih plazmidov že vsebuje gene, ki določajo odpornost celic na antibiotike (produkti teh genov so encimi, ki spreminjajo ali razgrajujejo antibiotične snovi). Poleg tega se pri konstruiranju vektorjev v te plazmide vnesejo dodatni geni, ki določajo odpornost na druge antibiotike.
Na sl. Slika 1 prikazuje enega najpogostejših plazmidnih vektorjev E.coli - pBR322. Konstruiran je na osnovi temeljito raziskanega plazmida E.coli - kolicinogenega faktorja ColE1 - in vsebuje izvor replikacije tega plazmida. Posebnost plazmida ColE1 (oziroma pBR322) je v tem, da se v prisotnosti antibiotika zaviralca sinteze beljakovin kloramfenikola (ki posredno zavira replikacijo gostiteljskega kromosoma) njegovo število v E. coli poveča z 20-50 na 1000 molekul. na celico, kar omogoča pridobivanje velikih količin kloniranega gena. Pri konstruiranju vektorja pBR322 iz originalnih plazmidov je bilo izbrisanih več "dodatnih" mest za restrikcijske encime.
Trenutno so skupaj s številnimi primernimi vektorskimi sistemi za E. coli konstruirani plazmidni vektorji za številne druge gramnegativne bakterije (vključno s tako industrijsko pomembnimi, kot so Pseudomonas, Rhizobium in Azotobacter), grampozitivne bakterije (Bacillus), nižje glive (kvasovke) in rastline .
Plazmidni vektorji so primerni za kloniranje relativno majhnih fragmentov (do 10 tisoč baznih parov) ne-genomov velike velikosti. Če morate pridobiti knjižnico (ali knjižnico) genov višjih rastlin in živali, skupna dolžina katerih genom doseže ogromne velikosti, so običajni plazmidni vektorji neprimerni za te namene. Problem ustvarjanja genskih knjižnic za višje evkarionte smo rešili z uporabo derivatov bakteriofaga l kot vektorjev za kloniranje.
Med vektorji fagov so bili najprimernejši sistemi ustvarjeni na osnovi genomov bakteriofagov l in M13 E. coli. DNK teh fagov vsebuje razširjene regije, ki jih je mogoče izbrisati ali nadomestiti s tujo DNK, ne da bi to vplivalo na njihovo sposobnost podvajanja v celicah E. coli. Pri konstruiranju družine vektorjev na osnovi DNK faga l smo ji najprej odstranili številna restrikcijska mesta (z delitvijo kratkih odsekov DNK) iz regije, ki ni bistvena za replikacijo DNK, in jih pustili v regiji, namenjeni vstavljanje tuje DNK. Markerski geni so pogosto vstavljeni v to isto regijo, da se rekombinantna DNA loči od originalnega vektorja. Takšni vektorji se pogosto uporabljajo za ustvarjanje "genskih knjižnic". Velikosti nadomeščenega fragmenta fagne DNA in s tem vstavljene regije tuje DNA so omejene na 15-17 tisoč nukleotidnih ostankov, saj je genom rekombinantnega faga, ki je 10% večji ali 75% manjši od genoma divjega l faga. , ni več mogoče pakirati v fagne delce.
Slika 1. Podroben restrikcijski zemljevid plazmida pBR322.
Takšne omejitve teoretično ne obstajajo za vektorje, zgrajene na osnovi nitastega bakteriofaga M13. Opisani so primeri, ko je bila v genom tega faga vstavljena tuja DNK, dolga okoli 40 tisoč nukleotidnih ostankov. Znano pa je, da postane fag M13 nestabilen, ko dolžina tuje DNA preseže 5 tisoč nukleotidnih ostankov. Pravzaprav se vektorji, pridobljeni iz DNA faga M13, uporabljajo predvsem za sekvenciranje in mutagenezo genov, velikosti fragmentov, vstavljenih vanje, pa so veliko manjše.
Ti vektorji so zgrajeni iz replikativne (dvoverižne) oblike DNK faga M13, v katero so vgrajene »polilinker« regije (primer takšne zasnove je prikazan na sliki 5). DNK je vključena v delec faga kot enoverižna molekula. Tako ta vektor omogoča pridobitev kloniranega gena ali njegovega fragmenta tako v dvoverižni kot enoverižni obliki. Enoverižne oblike rekombinantne DNK se trenutno pogosto uporabljajo pri določanju nukleotidnega zaporedja DNK po Sangerjevi metodi in za oligodeoksinukleotidno usmerjeno mutagenezo genov.
Prenos tujih genov v živalske celice poteka z vektorji, pridobljenimi iz DNK številnih dobro raziskanih živalskih virusov - SV40, nekaterih adenovirusov, virusa govejega papiloma, virusa črnih koz itd. Konstrukcija teh vektorjev poteka po standardni shemi: odstranitev "dodatnih" mest za restrikcijske encime, vnos markerskih genov v področja DNK, ki niso bistveni za njeno replikacijo (na primer gen za timidin kinazo (tk) od HSV (virus herpesa)), uvedba regulatornih regij, povečanje stopnje izražanja genov.
Tako imenovani "shuttle vektorji", ki se lahko razmnožujejo tako v živalskih kot bakterijskih celicah, so se izkazali za priročne. Izdelani so s sestavljanjem velikih segmentov živalskih in bakterijskih vektorjev (na primer SV40 in pBR322), tako da regije, odgovorne za replikacijo DNK, ostanejo nedotaknjene. Tako je mogoče izvesti osnovne operacije konstruiranja vektorja v bakterijski celici (kar je tehnično veliko enostavneje), nato pa nastalo rekombinantno DNA uporabiti za kloniranje genov v živalski celici.
Slika 2. Restrikcijska karta vektorja M13 mp8.
2.3. Priprava rekombinantne DNA.
Bistvo konstruiranja rekombinantne DNA je integracija fragmentov DNA, med katerimi se nahaja za nas zanimiva regija DNA, v tako imenovane vektorske molekule DNA (ali preprosto vektorje) - plazmidno ali virusno DNA, ki jih lahko prenesemo v pro - ali evkariontske celice in se tam avtonomno razmnožujejo. Na naslednji stopnji se izvede selekcija tistih celic, ki nosijo rekombinantno DNA (z uporabo markerskih karakteristik, ki jih ima vektor sam), in nato posameznih klonov z za nas zanimivim segmentom DNA (z uporabo karakteristik ali sond, specifičnih za določen gen). ali segment DNK).
Pri reševanju številnih znanstvenih in biotehnoloških problemov konstrukcija rekombinantne DNA zahteva tudi ustvarjanje sistemov, ki zagotavljajo maksimalno izražanje kloniranega gena.
Obstajajo trije glavni načini za integracijo tuje DNK v vektorske molekule. V prvem primeru so 3" konci fragmentov DNA, med katerimi se nahaja za nas zanimiva regija DNA (gen ali njegov segment, regulatorna regija), podaljšani s homopolinukleotidnim zaporedjem (npr. poli(T)) z uporabo končnega encima nukleotidil transferaze. Konci so linearne oblike. To omogoča, da se dve molekuli DNK združita s komplementarnim združevanjem umetno proizvedenih "lepljivih" koncev.
V drugem primeru nastanejo »lepljivi« konci s cepitvijo molekule DNK (tako vektorske kot tiste, ki vsebujejo fragment, ki nas zanima) z eno od restrikcijskih endonukleaz (restrikcijskih encimov). Za restrikcijske encime je značilna izjemno visoka specifičnost. V DNK »prepoznajo« zaporedje več nukleotidnih ostankov in v njih cepijo strogo določene internukleotidne vezi. Zato tudi v veliki DNK restrikcijski encimi uvedejo omejeno število prelomov.
Tretja metoda je kombinacija prvih dveh, ko lepljive konce DNK, ki jih tvori restrikcijski encim, podaljšamo s sintetičnimi zaporedji (slika 3).
Konce fragmentov DNA je mogoče spremeniti v "lepljive" tako, da jih razširite z dvoverižnimi oligonukleotidi ("linkerji"), ki vključujejo restrikcijsko prepoznavno mesto.
Slika 3. Shema za konstruiranje rekombinantne DNA z uporabo restrikcijskih encimov PstI in poli(G)-poli(C)-linkerja.
zoy. Obdelava takega fragmenta s tem restrikcijskim encimom ga naredi primernega za integracijo v molekulo vektorske DNK, ki je cepljena z istim restrikcijskim encimom. Pogosto se polinukleotidni fragmenti uporabljajo kot "povezovalci", ki vsebujejo specifična mesta za več restrikcijskih encimov hkrati (imenujejo se "polilinkerji").
Po vstavitvi tuje DNA v vektor se izvede njihova kovalentna zamrežitev z DNA ligazo. Če velikost vrzeli v rekombinirani molekuli presega eno fosfodiestrsko vez, jo popravimo in vitro s pomočjo DNA polimeraze ali in vivo s pomočjo sistemov za popravilo celic.
2.4. Vnos rekombinantne DNA v prejemno celico
Prenos rekombinantne DNA se izvede s transformacijo ali konjugacijo. Transformacija je proces spreminjanja genetske lastnosti celice kot posledica prodiranja tuje DNK vanjo. Prvi ga je pri pnevmokokih odkril F. Giffith, ki je pokazal, da nekatere celice nevirulentnih sevov bakterij, ko okužijo miši skupaj z virulentnimi sevi, pridobijo patogene lastnosti. Transformacija je bila nato dokazana in raziskana pri različnih vrstah bakterij. Ugotovljeno je bilo, da je le nekaj tako imenovanih »kompetentnih« celic (sposobnih vključiti tujo DNA in sintetizirati poseben transformacijski protein) sposobnih transformacije. Kompetentnost celice določajo tudi dejavniki zunanje okolje. To lahko olajšamo z obdelavo celic s polietilen glikolom ali kalcijevim kloridom. Po prodoru v celico se ena od verig rekombinantne DNK razgradi, druga pa se zaradi rekombinacije s homologno regijo prejemne DNK lahko vključi v kromosomsko ali zunajkromosomsko enoto. Transformacija je največ na univerzalen način prenos genetske informacije in je izjemnega pomena za genske tehnologije.
Konjugacija je eden od načinov izmenjave genskega materiala, pri katerem pride do enosmernega prenosa genetske informacije od darovalca do prejemnika. Ta prenos je pod nadzorom posebnih konjugativnih plazmidov (faktor plodnosti). Prenos informacij iz donorske celice v prejemno celico poteka prek posebnih genitalnih resic (pili). Možno je tudi prenesti informacije z uporabo nekonjugiranih plazmidov s sodelovanjem pomožnih plazmidov. Prenos celotnega nabora virusnih ali fagnih genov, kar vodi do razvoja fagnih delcev v celici, se imenuje transfekcija. Tehnika, kot jo uporabimo za bakterijske celice, vključuje pridobivanje sferoplastov, čiščenje inkubacijskega medija iz nukleaz in dodajanje očiščene DNK faga (prisotnost protamin sulfata poveča učinkovitost transfekcije). Tehnika je uporabna za živalske in rastlinske celice z uporabo posebnih virusnih vektorjev.
3.
Ko bi ga uporabili za ljudi, bi lahko genski inženiring uporabili za zdravljenje dednih bolezni. Tehnično gledano pa obstaja bistvena razlika med zdravljenjem bolnika samega in spreminjanjem genoma njegovih potomcev.
Naloga spreminjanja genoma odrasle osebe je nekoliko bolj zapletena kot vzreja novih gensko spremenjenih pasem živali, saj v tem primeru potrebno je spremeniti genom številnih celic že oblikovanega organizma in ne le enega embrionalnega jajčeca. Za to se predlaga uporaba virusnih delcev kot vektorja. Virusni delci lahko prodrejo v pomemben odstotek celic odraslega človeka in vanje vgradijo svoje dedne informacije; možna je nadzorovana reprodukcija virusnih delcev v telesu. Hkrati se znanstveniki za zmanjšanje stranskih učinkov poskušajo izogniti vnašanju gensko spremenjene DNK v celice spolnih organov, s čimer se izognejo vplivu na bolnikove bodoče potomce. Omeniti velja tudi precejšnjo kritiko te tehnologije v medijih: razvoj gensko spremenjenih virusov mnogi dojemajo kot grožnjo celotnemu človeštvu.
S pomočjo genske terapije je mogoče v prihodnosti spremeniti človeški genom. Trenutno so učinkovite metode za spreminjanje človeškega genoma v fazi razvoja in testiranja na primatih. Dolgo časa genski inženiring opic se je soočil z resnimi težavami, vendar so bili poskusi leta 2009 okronani z uspehom: publikacija se je pojavila v reviji Nature uspešna prijava gensko spremenjeni virusni vektorji za ozdravitev barvne slepote pri odraslem opičjem samcu. Istega leta je prvi gensko spremenjeni primat (zgojen iz spremenjenega jajčeca) skotil potomce – navadno marmozetko.
Čeprav v majhnem obsegu, se genski inženiring že uporablja, da ženskam z nekaterimi vrstami neplodnosti omogoči zanositev z uporabo jajčec zdrave ženske. Posledično otrok podeduje genotip enega očeta in dveh mater.
Vendar se možnost pomembnejših sprememb človeškega genoma sooča s številnimi resnimi etičnimi težavami.
Zaključek
Kot rezultat intenzivnega razvoja metod genskega inženiringa so nastali kloni mnogih genov za ribosomsko, transportno in 5S RNA, histone, mišji, zajčji, človeški globin, kolagen, ovalbumin, humani insulin in druge peptidne hormone, humani interferon itd. pridobljeno.
To je omogočilo ustvarjanje sevov bakterij, ki proizvajajo številne biološke aktivne snovi, ki se uporablja v medicini, kmetijstvo in mikrobiološka industrija.
Na osnovi genskega inženiringa je nastala veja farmacevtske industrije, imenovana »industrija DNK«. To je ena od sodobnih vej biotehnologije.
Za medicinska uporaba humani insulin (humulin), pridobljen z recDNA, je odobren. Poleg tega so na podlagi številnih mutantov za posamezne gene, pridobljenih med študijem, ustvarili zelo učinkovite testne sisteme za identifikacijo genetske aktivnosti okoljskih dejavnikov, vključno z identifikacijo rakotvornih spojin.
UPORABLJENE REFERENCE:
1) Bekish O.-Ya.L. Medicinska biologija. – Mn.: Urajai, 2000. – Str. 114-119.
2) Mutovin G.R. Osnove klinične genetike. – M.: podiplomska šola, 1997. – str. 83-84.
3) Hare R.S. Osnove medicinske genetike. – Mn.: Višja šola, 1998. – str. 60-65.
4) biotechnolog.ru
načrt:
Uvod.
1.Bistvo genskega inženiringa.
1.1. Zgodovina genskega inženiringa
1.2. Koncept genskega inženiringa
1.3. Cilji in cilji genskega inženiringa
2. Faze ustvarjanja organizmov z gensko spremenjenim programom.
2.1. Izolacija genov (naravnih ali sintetiziranih), ki vsebujejo potrebne informacije.
2.2. Izbor vektorjev (virusov, plazmidov), ki so sposobni samostojnega podvajanja v prejemni celici.
2.3. Priprava rekombinantne DNA.
2.4. Vnos rekombinantne DNA v prejemno celico.
3.Uporaba tehnologij genskega inženiringa v medicini.
Gensko inženirstvo je skupek metod, tehnik in tehnologij za izolacijo genov iz celic ali organizma, pridobivanje rekombinantne RNK in DNK, izvajanje različnih manipulacij z geni ter njihovo vnašanje v druge organizme. Ta disciplina pomaga pridobiti želene lastnosti spremenjenega organizma.
Znanost v v širšem smislu Genski inženiring ni, vendar velja za biotehnološko orodje. Uporablja raziskave ved, kot sta genetika in molekularna mikrobiologija.
Ustvarjene metode genskega inženiringa, povezane z upravljanjem dednosti, so bile ene najbolj svetle dogodke v razvoju znanosti.
Znanstveniki, molekularni biologi in biokemiki so se naučili spreminjati, spreminjati gene in ustvarjati popolnoma nove s kombiniranjem genov iz različnih organizmov. Naučili so se tudi sintetizirati gradivo po danih vzorcih. Znanstveniki so začeli vnašati umetne snovi v organizme in jih prisiliti k delu. Na vsem tem delu temelji genetski inženiring.
Vendar pa obstajajo nekatere omejitve " biološki material». Ta problem znanstveniki jo poskušajo rešiti s pomočjo in Strokovnjaki ugotavljajo, da je ta pot precej obetavna. V zadnjih nekaj desetletjih so znanstveniki razvili tehnike, s katerimi je mogoče določeno rastlino ali rastlinske celice prisiliti, da se razvijajo in razmnožujejo neodvisno, ločeno od organizma.
Dosežki genskega inženiringa imajo velika vrednost. uporabljajo v poskusih, pa tudi v industrijske proizvodnje nekatere snovi, ki jih ni mogoče pridobiti z uporabo bakterijskih kultur. Vendar pa so tudi na tem področju težave. Težava je na primer v pomanjkanju sposobnosti delitve živalskih celic neskončno število tako kot
Med poskusi so bila narejena temeljna odkritja. Tako je bil prvič vzgojen "kemično čist" izoliran gen. Kasneje so znanstveniki odkrili ligazo in restrikcijske encime. S pomočjo slednjega je postalo mogoče gen razrezati na koščke – nukleotide. In s pomočjo ligaz, nasprotno, lahko povežete, "zlepite" te koščke skupaj, vendar v novo kombinacijo, ustvarjanje, konstruiranje drugega gena.
Znanstveniki so naredili pomemben napredek tudi v procesu »branja« bioloških informacij. Dolga leta sta W. Gilbert in F. Sanger, ameriška in angleška znanstvenika, razvozlavala podatke v genih.
Strokovnjaki ugotavljajo, da genski inženiring v celotnem obdobju svojega obstoja ni imel nobenega vpliva. negativen vpliv na raziskovalce same, ni povzročila škode ljudem in ni povzročila škode naravi. Znanstveniki ugotavljajo, da doseženi rezultati tako v procesu proučevanja delovanja mehanizmov, ki zagotavljajo vitalne funkcije organizmov, kot v uporabni industriji so zelo impresivni. Hkrati se obeti zdijo res fantastični.
Kljub velikemu pomenu genetike in genskega inženiringa v kmetijstvu in medicini njeni glavni rezultati še niso bili doseženi.
Pred znanstveniki je kar nekaj izzivov. Ugotoviti je treba ne le funkcije in namen posameznega gena, temveč tudi pogoje, pod katerimi pride do njegove aktivacije, v katerih obdobjih življenja, pod vplivom katerih dejavnikov, v katerih delih telesa se vklopi in izzove sintezo ustreznega proteina. Poleg tega je pomembno ugotoviti, kakšno vlogo ima ta protein v življenju telesa, kakšne reakcije sproža, ali presega celične meje in kakšne informacije nosi. Problem zvijanja beljakovin je precej zapleten. Rešitev teh in številnih drugih težav znanstveniki iščejo v okviru genskega inženiringa.
Genetski inženiring in sodobna biotehnologija sta nastala kot posledica razvoja mikrobiologije, genetike in biokemije. Napredek v molekularni biologiji, molekularni genetiki, celični biologiji ter na novo odkrite eksperimentalne metode in nova oprema so zagotovili neverjetne stopnje razvoja genskega inženiringa in biotehnologije.
Namen genskega inženiringa
Cilj genskega inženiringa je spremeniti strukturo genov, njihovo lokacijo na kromosomu in uravnavati njihovo delovanje v skladu s človekovimi potrebami. Za dosego tega cilja uporabite različne metode, ki omogoča proizvodnjo beljakovin v industrijskem obsegu, ustvarjanje novih rastlinskih sort in živalskih pasem, ki najbolj ustrezajo zahtevam, ter diagnostiko in zdravljenje različnih nalezljivih in dednih bolezni ljudi.
Predmeti raziskav genskega inženiringa so virusi, bakterije, glive, živali (vključno s človeškim telesom) in rastlinske celice. Ko se molekula DNK teh živih bitij očisti od drugih snovi v celici, materialne razlike med njimi izginejo. Očiščeno molekulo DNA je mogoče z encimi razcepiti na specifične segmente, ki jih je mogoče nato po potrebi povezati skupaj z encimi za navzkrižno povezovanje. Sodobne metode Genetski inženiring vam omogoča reprodukcijo katerega koli dela DNK ali zamenjavo katerega koli nukleotida v verigi DNK z drugim. Seveda so bili ti uspehi doseženi kot rezultat doslednega preučevanja zakonov dednosti.
Gensko inženirstvo (genetski inženiring) je nastalo kot posledica odkritja encimov, ki specifično razdelijo materialno osnovo dednosti - molekulo DNK na segmente in te segmente povežejo s konci med seboj, ter elektroforetske metode, ki omogoča za razdelitev segmentov DNK po dolžini z visoko natančnostjo. Ustvarjanje metod in opreme za določanje specifičnega zaporedja nukleotidov, ki tvorijo molekulo DNK, pa tudi za samodejno sintezo katerega koli želenega segmenta DNK je zagotovilo hiter razvoj genskega inženiringa.
Razvoju želje znanstvenikov po obvladovanju dednosti so pripomogli dokazi, da je osnova dednosti vseh rastlin in živali molekula DNK, da se tudi bakterije in fagi podrejajo zakonom dednosti, da je mutacijski proces skupen vsem živim bitjem. in ga je mogoče regulirati z eksperimentalnimi metodami.
Louis Paster
Veliki francoski znanstvenik Louis Pasteur, ki je razvil metodo za pridobivanje klonov, je prvi pokazal, da so bakterije raznolike, imajo dednost in so njihove lastnosti tesno povezane s slednjo (slika 1, 2).
Twort in D'Herrel
Leta 1915 sta Twort in D'Herrel dokazala, da lahko fagi (fagi so virusi, ki se razmnožujejo v bakterijah), ki se spontano razmnožujejo v bakterijah, le-te uničijo. Mikrobiologi so svoje upe polagali v uporabo fagov proti mikrobom, ki povzročajo nevarne nalezljive bolezni. Vendar pa so bakterije odporne na fage zaradi spontanih mutacij. Dedovanje teh mutacij ščiti bakterije pred uničenjem s fagi.
Z razmnoževanjem znotraj celice jo lahko virusi in fagi uničijo ali pa z vnosom v genom celice spremenijo njeno dednost. Za spremembo dednosti organizma se pogosto uporabljajo procesi transformacije in transdukcije.
Joshua in Esther Lederberg
Leta 1952 sta Joshua in Esther Lederberg z metodo kopiranja (replikacije) bakterijskih kolonij dokazala obstoj spontanih mutacij pri bakterijah (slika 3). Razvili so metodo za izolacijo mutantnih celic z uporabo replikacije. Pod vplivom zunanjega okolja se pogostost mutacij poveča. Posebne metode omogočiti, da vidite s prostim očesom klonov novih sevov, ki so nastali kot posledica mutacij.
Metoda replikacije bakterijske kolonije se izvaja na naslednji način. Sterilizirano žametno blago napnemo po površini lesene naprave in nanesemo na kolonijo bakterij, ki rastejo na površini petrijevke, namenjene presajanju replik. Nato se kolonije prenesejo v čisto petrijevko z umetnim hranilnim medijem. Material s strani
Faze genskega inženiringa
Gensko inženirstvo poteka v več fazah.
- Identificiramo gen, ki nas zanima, na podlagi njegove funkcije, nato ga izoliramo, kloniramo in preučujemo njegovo strukturo.
- Izolirani gen se združi (rekombinira) z DNA nekega faga, transpozona ali plazmida, ki ima sposobnost rekombinacije s kromosomom, in na ta način nastane vektorski konstrukt.
- Vektorski konstrukt vstavimo v celico (transformacija) in dobimo transgeno celico.
- Zrele organizme lahko pridobimo iz transgene celice v umetnih pogojih.
