Genski inženiring sodobna biotehnologija pa je nastala kot rezultat razvoja mikrobiologije, genetike in biokemije. Napredek v molekularni biologiji, molekularni genetiki, celični biologiji ter na novo odkrite eksperimentalne metode in nova oprema so zagotovili neverjetne stopnje razvoja genskega inženiringa in biotehnologije.

Namen genskega inženiringa

Cilj genskega inženiringa je spremeniti strukturo genov, njihovo lokacijo na kromosomu in uravnavati njihovo delovanje v skladu s človekovimi potrebami. Za dosego tega cilja se uporabljajo različne metode, ki omogočajo proizvodnjo beljakovin v industrijskem obsegu, ustvarjanje novih rastlinskih sort in živalskih pasem, ki najbolj ustrezajo zahtevam, ter diagnostiko in zdravljenje različnih infekcijskih in dednih bolezni ljudi.

Predmet raziskovanja genskega inženiringa so virusi, bakterije, glive, živali (vključno s človeškim telesom) in rastlinske celice. Ko se molekula DNK teh živih bitij očisti od drugih snovi v celici, materialne razlike med njimi izginejo. Očiščeno molekulo DNA je mogoče z encimi razcepiti na specifične segmente, ki jih je mogoče nato po potrebi povezati skupaj z encimi za navzkrižno povezovanje. Sodobne metode genskega inženiringa omogočajo reprodukcijo katerega koli segmenta DNK ali zamenjavo katerega koli nukleotida v verigi DNK z drugim. Seveda so bili ti uspehi doseženi kot rezultat doslednega preučevanja zakonov dednosti.

Gensko inženirstvo (genetski inženiring) je nastalo kot posledica odkritja encimov, ki specifično razdelijo materialno osnovo dednosti - molekulo DNK na segmente in te segmente povežejo s konci med seboj, ter elektroforetske metode, ki omogoča za natančno ločevanje segmentov DNK po njihovi dolžini. Ustvarjanje metod in opreme za določanje specifičnega zaporedja nukleotidov, ki tvorijo molekulo DNK, pa tudi za samodejno sintezo katerega koli želenega segmenta DNK je zagotovilo hiter razvoj genskega inženiringa.

Razvoju želje znanstvenikov po obvladovanju dednosti so pripomogli dokazi, da je osnova dednosti vseh rastlin in živali molekula DNK, da se tudi bakterije in fagi podrejajo zakonom dednosti, da je mutacijski proces skupen vsem živim bitjem. in ga je mogoče regulirati z eksperimentalnimi metodami.

Louis Paster

Veliki francoski znanstvenik Louis Pasteur, ki je razvil metodo za pridobivanje klonov, je prvi pokazal, da so bakterije raznolike, imajo dednost in so njihove lastnosti tesno povezane s slednjo (slika 1, 2).

Twort in D'Herrel

Leta 1915 sta Twort in D'Herrel dokazala, da lahko fagi (fagi so virusi, ki se razmnožujejo v bakterijah), ki se spontano razmnožujejo v bakterijah, le-te uničijo. Mikrobiologi so svoje upe polagali v uporabo fagov proti mikrobom, ki povzročajo nevarne nalezljive bolezni. Vendar pa so bakterije odporne na fage zaradi spontanih mutacij. Dedovanje teh mutacij ščiti bakterije pred uničenjem s fagi.

Z razmnoževanjem znotraj celice jo lahko virusi in fagi uničijo ali pa z vnosom v genom celice spremenijo njeno dednost. Za spremembo dednosti organizma se pogosto uporabljajo procesi transformacije in transdukcije.

Joshua in Esther Lederberg

Leta 1952 sta Joshua in Esther Lederberg z metodo kopiranja (replikacije) bakterijskih kolonij dokazala obstoj spontanih mutacij pri bakterijah (slika 3). Razvili so metodo za izolacijo mutantnih celic z uporabo replikacije. Pod vplivom zunanjega okolja se pogostost mutacij poveča. Posebne metode omogočajo ogled klonov novih sevov, ki nastanejo kot posledica mutacij, s prostim očesom.

Metoda replikacije bakterijske kolonije se izvaja na naslednji način. Sterilizirano žametno blago napnemo po površini lesene naprave in nanesemo na kolonijo bakterij, ki rastejo na površini petrijevke, namenjene presajanju replik. Nato se kolonije prenesejo v čisto petrijevko z umetnim hranilnim medijem. Material s strani

Faze genskega inženiringa

Gensko inženirstvo poteka v več fazah.

• Identificiramo gen, ki nas zanima, na podlagi njegove funkcije, nato ga izoliramo, kloniramo in preučujemo njegovo strukturo.
• Izolirani gen se združi (rekombinira) z DNK nekega faga, transpozona ali plazmida, ki ima sposobnost rekombinacije s kromosomom, in tako nastane vektorski konstrukt.
• Vektorski konstrukt vstavimo v celico (transformacija) in dobimo transgeno celico.
• Zrele organizme lahko pridobimo iz transgene celice v umetnih pogojih.

Genetski (genski) inženiring

Genetski (genski) inženiring– oblikovanje umetno genetske strukture in dedno spremenjeni organizmi. Genetski inženiring je del (uporabna veja) molekularne genetike, ki je povezan s ciljno tvorbo novih molekul DNK, ki se lahko razmnožujejo v gostiteljski celici. V tem primeru pride do umetne, namenske spremembe genotipa organizma (mikroorganizma) in oblikovanja novih lastnosti in lastnosti. Genski inženiring se ukvarja z dekodiranjem strukture genov, njihovo sintezo in kloniranjem ter vstavljanjem genov, izoliranih iz celic živih organizmov, v celice rastlin in živali z namenom specifičnega spreminjanja njihovih genetskih lastnosti.

Dobro razvite metode genskega inženiringa so transgeneza, mikrobiološka sinteza itd.

Transgeneza– prenos genov iz ene vrste organizma v drugo. Transgeneza se izvaja z rezanjem in šivanjem odsekov DNK s sodelovanjem encimov - restrikcijskih encimov in ligaz.

Faze transgeneze:

a) izolacija genov (fragmentov DNA) iz bakterijskih, rastlinskih ali živalskih celic z uporabo encima restrikcijskih encimov;

b) povezava (povezovanje) genov (fragmentov DNA) s plazmidom z uporabo encima ligaze;

c) vnos hibridne plazmidne DNA, ki vsebuje želeni gen, v gostiteljsko celico;

d) kopiranje (kloniranje) tega gena v gostiteljski celici in zagotavljanje njegovega delovanja po shemi: "koda DNK - transkripcija - prevod - protein"

Orodja za genski inženiring so encimi, odkriti leta 1974 - restrikcijski encimi (restrikcijske endonukleaze). Restrikcijski encimi prepoznajo odseke (mesta) DNK in naredijo reze v verigah DNK. Na koncih vsakega fragmenta se oblikujejo enonitni repi, imenovani " lepljivi konci" saj se zaradi komplementarnosti lahko tako rekoč držijo skupaj.

Restrikcijski encimi prepoznajo specifično zaporedje nukleotidov DNA v dvoverižni DNA. Restrikcijski encim se nato pritrdi na prepoznano mesto nukleotida in ga prereže na mestu pritrditve. Pogosteje restrikcijski encimi prepoznajo regije 4–6 nukleotidnih parov v molekuli DNA in prerežejo obe verigi DNA na sredini teh regij ali običajno z zamikom. Primeri restrikcijskih encimov: restrikcijski encim Eco RI, ki prepozna fragment DNA šestih nukleotidov GAATTC (mesto reza med nukleotidoma G in A obeh verig DNA); restrikcijski encim Hind III prepozna regijo AAGCTT (mesto reza med nukleotidoma A in A obeh verig DNA); restrikcijski encim Bam jaz prepozna regijo GGATCC (mesto reza med nukleotidoma G in G obeh verig DNK); restrikcijski encim Hae III prepozna mesto GGC (prerez med nukleotidoma G in C obeh verig DNK); restrikcijski encim Hpa II prepozna regijo CCGG (mesto reza med nukleotidoma C in C obeh verig DNA).

Nato je za izdelavo gensko spremenjenega organizma potrebno v celico tega organizma vnesti želeni gen. Vnos tujih genov v telo poteka z uporabo plazmidni vektor. Vektor je plazmid – majhna krožna molekula DNA ki se ekstrahira iz citoplazme bakterijske celice. Plazmidi– dejavniki dednosti, ki se nahajajo izven kromosomov, ki predstavljajo ekstrakromosomska DNA.

riž. 37.

A– Shema za vnos tuje DNA v bakterijski plazmid z uporabo encimov (restrikcijske endonukleaze in ligaze).

B– Shema prenosa človeških genov, odgovornih za sintezo hormona insulina in tvorbo vektorske DNA.

Lastnosti plazmida: 1) ima sposobnost avtonomne replikacije; 2) vsebuje gene, ki kodirajo antibiotike; 3) se lahko integrirajo v kromosom prejemne celice; 4) prepozna dele DNA, ki jih lahko režejo restrikcijski encimi; 5) restrikcijski encim lahko prereže plazmid in ga prenese v linearno stanje. Raziskovalci uporabljajo te lastnosti plazmida za pridobivanje rekombinantna (hibridna) DNA.

Zaporedje vnosa DNA v plazmid (plazmidni vektor) z uporabo restrikcijskega encima(Slika 37 A):

1) omejitev– rezanje molekule DNA z restrikcijskim encimom, tvorba fragmentov DNA in izolacijo potrebnega gena;

2) vključitev izoliranega gena v plazmid, tj. pridobivanje rekombinantne (hibridne) DNA z vnosom fragmenta tuje DNA v plazmid;

3) podvezovanje– encimsko zamreženje ligaza plazmid (vektor) in tuji fragmenti DNA; v tem primeru so konci vektorja in tuje DNA (tako imenovani »lepljivi konci«) komplementarni drug drugemu;

4) transformacija– vnos rekombinantnega plazmida v genom druge celice (celice prejemnice), zlasti bakterijske celice.

Upoštevati je treba, da plazmidi prodrejo le v del tretiranih bakterij. Transformirane bakterije skupaj s plazmidi pridobijo rezistenco na določen antibiotik, kar omogoča njihovo ločitev od netransformiranih bakterij, ki poginejo na gojišču z antibiotikom. Vsaka od transformiranih bakterij, postavljena na hranilni medij, se razmnožuje in tvori kolonijo več tisoč potomcev - klon.

5) presejanje– izbor med transformiranimi bakterijami tistih, ki vsebujejo plazmide z želenim genom.

Transgene živali in rastline

Klonirane gene z mikroinjekcijami vnesemo v jajčeca sesalcev ali rastlinske protoplaste (izolirano celico brez celične stene) in nato iz njih vzgojimo živali ali rastline, v katerih genomu delujejo tuji geni. Imenujejo se rastline in živali, katerih genomi so bili spremenjeni z genskim inženiringom transgene organizacije (transgene rastline in živali), ker vsebuje tuje gene. Pridobljene so bile transgene miši, zajci, prašiči in ovce. Njihov genom vsebuje gene bakterij, sesalcev in ljudi. Pridobljene so bile transgene rastline (koruza, paprika, paradižnik, pšenica, rž, stročnice, krompir itd.), ki vsebujejo gene nesorodnih vrst. Transgene rastline so odporne na herbicide, insekte, neugodne deževne razmere itd. Problem spreminjanja dednosti številnih kmetijskih rastlin se postopoma rešuje.

Genetska karta kromosomov. Genska terapija

Genetska karta kromosomov je diagram relativne razporeditve genov, ki se nahajajo v isti vezni skupini. Takšni zemljevidi so sestavljeni za vsak par homolognih kromosomov. Genetski zemljevid prikazuje vrstni red genov na kromosomu in razdaljo med njimi (odstotek križanja med določenimi geni). Tako ustvarjanje novih sevov mikroorganizmov, ki so sposobni sintetizirati hormone, beljakovine in zdravila, temelji na poznavanju genetskih zemljevidov mikroorganizmov. Genetske karte ljudje so potrebni za medicinsko genetiko. Znanje o lokalizaciji gena na določenem kromosomu se uporablja pri diagnostiki številnih dednih bolezni, pa tudi v genski terapiji za popravljanje strukture in delovanja genov.

Genska terapija – zamenjava okvarjenih genov z nedotaknjenimi ali popravljanje njihove strukture.

Za boj proti dednim, onkološkim in starostnim boleznim se razvijajo metode genske terapije, ki so varne za človeške celice. Z metodami genske terapije je mogoče okvarjene gene v telesu, v katerih je prišlo do točkovnih mutacij, nadomestiti z nedotaknjenimi. Dandanes znanstveniki obvladujejo metode biološka varnost ljudi: vnos potrebnih genov v celice človeškega telesa. Tako se boste znebili številnih dednih bolezni.

Mikrobiološka sinteza

Metode genskega inženiringa omogočile izvajanje mikrobiološka sinteza(Slika 37 B). Mikrobiologi so z metodami genskega inženiringa uspeli pridobiti seve bakterij, zahvaljujoč katerim se mikrobiološka sinteza uspešno izvaja. Za to se izberejo potrebne bakterijske celice, ki ne vsebujejo plazmidov. Izolirajo se molekule DNA z danim zaporedjem nukleotidov, ki določajo razvoj želene lastnosti. Plazmid z integriranim odsekom DNA (genom) vnesemo v bakterijsko celico, v kateri začne delovati vgrajeni odsek DNA (potekajo procesi replikacije, transkripcije, prevajanja) in se sintetizira v bakterijski celici. prave beljakovine(interferon, genferon, imunoglobulin, insulin, somatotropin itd.). V industrijskih količinah se pridobivajo hormoni (insulin, somatotropin), številne aminokisline, antibiotiki, cepiva, itd.

Z uporabo genetske metode pridobljen je bil sev mikroorganizma Pseudomonas denitrificans, ki proizvede desetkrat več vitamina C in vitaminov B kot izvirna oblika; nov sev bakterije Micrococcus glutamicus izloča stokrat več aminokisline lizin kot prvotna (divje) kultura bakterije, ki proizvaja lizin.

Celični inženiring

Celični inženiring– gojenje posameznih celic ali tkiv v posebnih umetnih gojiščih, razvoj metod za ustvarjanje novega tipa celic z njihovo hibridizacijo, nadomeščanjem kromosomov in gojenjem hibridov iz njih.

1. Metoda tkivne kulture

Metoda je sestavljena iz gojenja izoliranih celic ali koščkov tkiva na umetnem hranilnem mediju v ustreznih mikroklimatskih pogojih. Zaradi gojenja se rastlinske celice ali delčki tkiva regenerirajo v celotno rastlino. Z mikroklonskim razmnoževanjem posameznih celic ali koščkov tkiva (običajno apikalni meristem stebla ali korenine) lahko pridobimo številne uporabne rastline. Eksperimentalno so izbrani mikroklimatski pogoji in hranilni mediji za obnovo okrasnih, kulturnih in zdravilnih rastlin. Tkivna kultura se uporablja tudi za proizvodnjo diploidnih rastlin po obdelavi prvotnih haploidnih oblik s kolhicinom.

2. Somatska hibridizacija

Somatska hibridizacija vključuje proizvodnjo hibridnih celic in iz njih - nove oblike; umetna oploditev jajc.

Pridobivanje novih hibridnih rastlin s fuzijo protoplastov (jedra in citoplazme) različnih celic v tkivni kulturi. Za spajanje protoplastov se s pomočjo encimov uniči rastlinska celična stena in dobi se izoliran protoplast. Pri gojenju takih protoplastov različni tipi rastline se združujejo in tvorijo oblike z novimi uporabnimi lastnostmi. Umetna oploditev jajčec se izvaja z metodo oploditve in vitro (IVF), ki omogoča oploditev jajčec in vitro z naknadno implantacijo zarodka v zgodnji fazi razvoja ter premagovanje nekaterih oblik neplodnosti pri ljudeh.

3. Kromosomski inženiring– zamenjava posameznih kromosomov v rastlinskih celicah ali dodajanje novih. Diploidi imajo pare homolognih kromosomov in takšne organizme imenujemo disomiki. Če v katerem koli paru ostane en kromosom, nastane monosomija. Če kateremu koli paru dodate še tretji homologni kromosom, nastane trisomik itd. Možna je zamenjava posameznih kromosomov ene vrste s kromosomi druge vrste. Prejeto oblike imenujemo substituirane.

Kaj je genski inženiring?

Genetski inženiring je nova, revolucionarna tehnologija, s katero lahko znanstveniki izvlečejo gene iz enega organizma in jih vnesejo v katerega koli drugega. Geni so program življenja - to so biološki konstrukti, ki sestavljajo DNK in določajo specifične lastnosti enega ali drugega živega organizma. Presaditev gena spremeni program prejemnega organizma in njegove celice začnejo proizvajati različne snovi, ki posledično ustvarijo nove lastnosti v tem organizmu.
S to metodo lahko raziskovalci spremenijo določene lastnosti in karakteristike v želeno smer, na primer lahko razvijejo sorto paradižnika z daljšim rokom trajanja ali sorto soje, ki je odporna na herbicide. Gensko inženirstvo je metoda biotehnologije, ki se ukvarja z raziskovanjem prestrukturiranja genotipov. Genotip ni le mehanska vsota genov, temveč kompleksen sistem, ki se je razvil med evolucijo organizmov. Genetski inženiring omogoča prenos genetskih informacij iz enega organizma v drugega z in vitro operacijami. Prenos genov omogoča premagovanje medvrstnih ovir in prenos posameznih dednih lastnosti enega organizma na drugega. Nosilci materialne osnove genov so kromosomi, ki vključujejo DNK in beljakovine. Toda geni nastajanja niso kemični, ampak funkcionalni.
S funkcionalnega vidika je DNK sestavljena iz številnih blokov, ki hranijo določeno količino informacij – gene. Delovanje gena temelji na njegovi sposobnosti določanja sinteze beljakovin prek RNA. Molekula DNK tako rekoč vsebuje informacije, ki določajo kemično strukturo beljakovinskih molekul. Gen je odsek molekule DNA, ki vsebuje informacije o primarni strukturi katerega koli proteina (en gen – en protein). Ker je v organizmih na desettisoče beljakovin, obstaja na desettisoče genov.

Skupek vseh genov celice sestavlja njen genom. Vse celice v telesu vsebujejo enak niz genov, vendar vsaka od njih izvaja drugačen del shranjenih informacij. Zato je npr. živčne celice tako po strukturnih, funkcionalnih kot bioloških značilnostih se razlikujejo od jetrnih celic. Prestrukturiranje genotipov pri izvajanju nalog genskega inženiringa je kvalitativne spremembe geni, ki niso povezani s spremembami v strukturi kromosomov, vidnimi v mikroskopu. Genske spremembe so povezane predvsem s transformacijo kemijska struktura DNK.
Informacija o strukturi proteina, zapisana kot zaporedje nukleotidov, se implementira kot zaporedje aminokislin v sintetizirani proteinski molekuli. Sprememba zaporedja nukleotidov v kromosomski DNK, izguba enih in vključitev drugih nukleotidov, spremeni sestavo molekul RNK, ki nastanejo na DNK, to pa določa novo zaporedje aminokislin med sintezo. Posledično se v celici začne sintetizirati nov protein, kar povzroči pojav novih lastnosti v telesu. Bistvo metod genskega inženiringa je v tem, da posamezne gene ali skupine genov vstavimo ali izločimo iz genotipa organizma. Zaradi vstavitve prej odsotnega gena v genotip je lahko celica prisiljena sintetizirati beljakovine, ki jih prej ni sintetizirala.

Problemi genskega inženiringa

Možnosti ene najpomembnejših stvaritev znanosti dvajsetega stoletja - genskega inženiringa - že dolgo burijo domišljijo človeštva, saj se je približala najpomembnejši stvari v človeškem telesu, zakonitostim življenja njegovega telesa. Če pa so bili pred petnajstimi leti rezultati dela biotehnologov povezani predvsem z razvojem novih sort korenja ali nove pasme krav molznic, se je pred nekaj leti izkazalo, da je mogoče komunicirati z ovco Dolly. , ki so ga klonirali škotski biologi, lani pa se je razpisalo o nastanku prvega bolj ali manj splošni zemljevidčloveški genom. V ozadju napredka na področju biologije hiti prejšnjih sezon bledijo v ozadje - nove Informacijska tehnologija. Malo ljudi zdaj zanima vprašanje, kdaj se bo človek lahko svobodno sprehajal po Marsu, veliko bolj pereča je debata o tem, kdaj bo človeka mogoče klonirati in kako to preprečiti - nekakšno kimanje. na moralo in etiko.

Genski inženiring - sovražnik ali prijatelj? Zgodovinska perspektiva...

Zgodovinska perspektiva

Kot veste, je življenje na Zemlji nastalo pred približno 4,6 milijarde let in ne glede na to, v kakšni obliki je bilo, je bila za življenjske manifestacije vsakega organizma odgovorna ista snov - deoksiribonukleinska kislina (aka DNK). DNK, zapisan v genih, je določal in še vedno določa (in v prihodnosti očitno pod strogim vodstvom človeka) presnovno aktivnost celic, potrebno za njihovo preživetje, in to je življenje samo. preprosta definicija . Pravzaprav se izraz geni ni uporabljal vse do začetka prejšnjega stoletja, čeprav so se raziskave njihovega delovanja začele v 19. stoletju. Avstrijski menih Gregor Mendel je dolga leta opazoval potomce graha, ki ga je gojil na samostanskem vrtu. S snemanjem zunanjih značilnosti - višina stebla, barva cvetnih listov, oblika graha, je lahko teoretično predlagal obstoj določenih "dejavnikov", ki jih potomci podedujejo od starševskih rastlin. Tako kot Kolumb je tudi Mendel umrl, ne da bi vedel, kaj je odkril. Od začetka dvajsetega stoletja je prišlo do razcveta raziskav celične strukture. Biologi so uspeli ugotoviti, katere funkcije opravlja celično jedro, in rešiti skrivnost narave kromosomov. Najpomembneje je bilo, da se je razjasnila narava prevajanja molekul DNK: med meozo, ki je pred pojavom jajčec in semenčic, se število kromosomov, ki vsebujejo DNK, zmanjša za polovico, kar se nato s fuzijo zarodne celice, bo omogočilo, da se njihova jedra združijo v eno samo celoto – da nastane nov organizem s popolnoma edinstvenim naborom genov. Leta 1953 je bilo končno mogoče izolirati dvojno vijačno strukturo DNK, ki jo zdaj vsak šolar pozna na pogled. DNK je zdaj priznan kot univerzalni biološki jezik, ki bo združil vse organizme, ki živijo na Zemlji: ljudi in bakterije, glive in rastline. Vendar pa dvajseto stoletje ni samo stoletje temeljnih odkritij, ampak tudi stoletje inženiringa - praktične uporabe teh istih odkritij. Zato so se ob nenehnih raziskavah, kako »sploh vse to deluje«, skokovito razvijale različne veje genskega inženiringa in različne biotehnologije. Tovrstna inženirska misel se je že od vsega začetka ukvarjala predvsem s tem, kako bi lahko nekatere žive organizme z določenim genom uporabili za izboljšanje drugih – govorili smo o rastlinah ali živalih. V sedemdesetih letih so se znanstveniki naučili izrezati dele DNK enega organizma in ga presaditi v drugega, kar je naredilo majhno revolucijo v proizvodnji različnih zdravil - insulina, človeškega rastnega hormona itd. Že vrsto let se poskuša izvajati tako imenovana človeška genska terapija - ljudem, ki nimajo določenih komponent v genskem naboru ali so v določeni meri okvarjeni, presadijo gene drugih ljudi. Znanje, pridobljeno z genetiko, se precej uporablja na področju človeške reprodukcije. Mnogi vedo, da je pod določenimi pogoji povsem mogoče vzgajati otroke "iz epruvete" in v nekaterih primerih ženske neplodnosti - za pomoč se obrniti na nadomestne matere. V Sloveniji se že pojavljajo gensko spremenjene rastline (žita, odporna proti zmrzali, transgeni krompir, hitro zreli paradižniki itd.). jedilne mize, čeprav zaenkrat niso povzročile večjega navdušenja.

Genski inženiring - sovražnik ali prijatelj? Možnosti genskega inženiringa ...

Možnosti genskega inženiringa, Projekt človeškega genoma

Seveda uspešne manipulacije z geni rastlin in živali je lahko vodilo do precej spolzkega vprašanja: kaj pa ljudje? Če je mogoče izboljšati živali, zakaj ne bi izboljšali ljudi. Vendar morate najprej razumeti nabor človeških genov. Tako se je leta 1990 pojavila pobuda za preslikavo človeških kromosomov, sestavljenih iz 26-30 tisoč genov. Projekt je dobil preprosto ime "Človeški genom" in naj bi bil približno predstavljen celoten zemljevid genom do približno leta 2005. Projekt vključuje raziskovalne skupine iz različnih držav in od poznih 90. ustanavljajo se posebna podjetja, katerih glavna naloga je olajšati in pospešiti komunikacijo med takimi skupinami. Do začetka leta 2001 sta bila že popolnoma preslikana 2 kromosoma: 21 in 22.

Vendar je bila glavna senzacija lanskega leta odkritje splošnega zemljevida človeškega genoma skupine Craiga Venterja. Znanstveniki pravijo, da če ta zemljevid primerjamo z navadnimi, bi z njim komajda bilo mogoče priti do trgovine na sosednji ulici, vsekakor pa že samo dejstvo njegovega obstoja govori o začetku obdobja genov. patentiranja, to pa odpira številna vprašanja, ki niso več biološka, ​​temveč etična in pravna. Čeprav znanstveniki pravijo, da je glavni namen kartiranja genoma potreba po razumevanju delovanja človeškega telesa, da bi se lahko učinkoviteje uprlo različnim boleznim, in lahko takšno znanje močno olajša ustvarjanje novih zdravil, je potreba po obeh pravna ureditev vprašanje: kako in kaj lahko počnemo s človeškim telesom ter odgovor na vprašanje: kje naj se ustavimo? Ali lahko človek postane podoben Stvarniku in sam začne ustvarjati nova bitja? Kartiranje človeškega genoma pogosto primerjajo s tako revolucionarnimi dogodki, kot je na primer pristanek človeka na Luni. Vendar pa je zdaj ena pomembna razlika: če so vesoljski programi ena od nalog države, potem imajo skupine, ki sodelujejo pri projektu, praviloma zasebno financiranje, zato bodo nedržavna podjetja imela avtorske pravice za svoj razvoj . Kaj bodo naredili z njimi?

Predstavljajmo si, da bo v bližnji prihodnosti zemljevid sestavljen precej natančno in bo mogoče tako opisati vsako osebo. Postavlja se vprašanje - kdo bo imel dostop do teh informacij? V kolikšni meri lahko človek najbolj »intimne« podatke o sebi ohrani nedotaknjene? Ali bodo delodajalci zavrnili zaposlitev osebe, ki ima genetsko nagnjenost k kateri koli vrsti raka? Bo zdravstveno zavarovanje možno v situaciji, ko bo genom vsakega posameznika dajal podatke o vseh možnih boleznih? Tony Blair je govoril o potrebi po sestavi genetskih portretov kriminalcev. In zdi se, da so znanstveniki pripravljeni delati na odkrivanju posebnih genov, odgovornih za deviantno vedenje pri ljudeh. Številne strokovnjake pa že prestraši možnost, da bo družba v bližnji prihodnosti rešitev preusmerila na različne probleme - kriminal, revščino, rasizem itd. - o genetikih in genskem inženiringu: "pravijo, da je vse v genih, če je kaj narobe, potem to ni skrb družbe, ampak genetska predispozicija posameznika." Konec koncev na splošno mnogi ljudje pozabljajo, da le nekatere redke bolezni povzroča izključno niz genov, tiste bolezni, ki jih običajno imenujemo genetske - rak, kardiovaskularne motnje - pa so le delno genetske narave, v mnogih pogledih verjetnost Od njihovega nastanka je preobrat odvisen predvsem od korakov človeka samega in družbe, zato ne more biti nič hujšega, kot da si družba umije roke nad takim stanjem. Najpogostejša metoda genskega inženiringa je metoda pridobivanja rekombinantnih, tj. ki vsebuje tuji gen, plazmid. Plazmidi so krožne dvoverižne molekule DNA, sestavljene iz več tisoč nukleotidnih parov.

Ta postopek je sestavljen iz več faz:
1. Omejitev - rezanje DNK, na primer človeške DNK na fragmente.
2. Ligacija - fragment z želenim genom se vključi v plazmide in sešije skupaj.
3. Transformacija je vnos rekombinantnih plazmidov v bakterijske celice. Preoblikovane bakterije pridobijo določene lastnosti. Vsaka od preoblikovanih bakterij se namnoži in tvori kolonijo več tisoč potomcev – klon.
4. Presejanje je izbira med kloni transformiranih bakterij tistih s plazmidi, ki nosijo želeni človeški gen.

Celoten postopek se imenuje kloniranje. S kloniranjem je mogoče pridobiti več kot milijon kopij kateregakoli fragmenta DNK osebe ali drugega organizma. Če klonirani fragment kodira protein, potem je mogoče eksperimentalno preučiti mehanizem, ki uravnava transkripcijo tega gena, pa tudi proizvesti ta protein v zahtevani količini. Poleg tega se lahko fragment klonirane DNK iz enega organizma vnese v celice drugega organizma. To lahko doseže na primer visoke in stabilne pridelke zahvaljujoč vnesenemu genu, ki zagotavlja odpornost na številne bolezni. Če v genotip talnih bakterij vnesete gene drugih bakterij, ki imajo sposobnost vezave atmosferskega dušika, potem bodo talne bakterije ta dušik lahko pretvorile v fiksen dušik v tleh. Z vnosom v genotip bakterije E. coli gena iz človeškega genotipa, ki nadzoruje sintezo inzulina, so znanstveniki dosegli proizvodnjo inzulina preko takšne E. coli. pri nadaljnji razvoj znanost, bo mogoče v človeški zarodek vnesti manjkajoče gene in se tako izogniti genetskim boleznim.

Poskusi kloniranja živali potekajo že dolgo. Dovolj je, da iz jajčeca odstranimo jedro, vanj vsadimo jedro druge celice, vzete iz embrionalnega tkiva, in ga vzgojimo – bodisi v epruveti bodisi v maternici posvojiteljice. Klonirana ovca Doli je nastala na nekonvencionalen način. Jedro iz celice vimena 6-letne odrasle ovce ene pasme smo presadili v brezjedrno jajčece ovce druge pasme. Razvijajoči se zarodek je bil nameščen v ovco tretje pasme. Ker je rojena ovca prejela vse gene od prve ovce darovalke, je njena natančna genetska kopija. Ta poskus odpira veliko novih priložnosti za kloniranje elitnih pasem, namesto dolgoletne selekcije. Znanstveniki z univerze v Teksasu so uspeli podaljšati življenje več vrstam človeških celic. Običajno celica umre po približno 7-10 procesih delitve, vendar so dosegli sto delitev celic. Do staranja po mnenju znanstvenikov pride, ker celice z vsako delitvijo izgubijo telomere, molekularne strukture, ki se nahajajo na koncih vseh kromosomov.

Znanstveniki so odkriti gen, ki je odgovoren za proizvodnjo telomeraze, vsadili v celice in jih s tem naredili nesmrtne. Morda to prihodnja pot do nesmrtnosti. Od 80. let prejšnjega stoletja so se pojavili programi za preučevanje človeškega genoma. V procesu izvajanja teh programov je bilo prebranih že približno 5 tisoč genov (celoten človeški genom jih vsebuje 50-100 tisoč). Odkrili so številne nove človeške gene. Genski inženiring prevzame vse višja vrednost v genski terapiji. Ker je veliko bolezni določenih na genetski ravni. V genomu je nagnjenost ali odpornost na številne bolezni. Mnogi znanstveniki menijo, da bosta genomska medicina in genski inženiring v 21. stoletju delovala. Noben znanstvenik, ki resnično trdno stoji na platformi znanstvene objektivnosti, ne bo nikoli rekel, da je s pomočjo nečesa mogoče pozdraviti popolnoma vse ali da je nekaj »popolnoma varno«, še posebej, če gre za genski inženiring, ki manipulira s posameznimi ravnmi Naravnega zakona, medtem ko ignoriranje njegove celovitosti. Kot smo videli že pri jedrskih raziskavah, je energija, ki se sprošča zaradi takšnih manipulacij, lahko ogromna, ogromna pa je tudi možna nevarnost. Ko je bila jedrska tehnologija v fazi razvoja, si nihče ni mogel predstavljati, da bo človeštvu v le nekaj letih grozilo večkratno uničenje, ki bi ga lahko enakovredno zagotovili obe nasprotujoči si sili. In ko se je jedrska energija začela uporabljati za proizvodnjo električne energije, nihče ni vedel, da bomo posledično končali z milijoni ton radioaktivnih odpadkov, ki bodo ostali strupeni več deset tisoč let. Nihče o tem ni vedel ničesar, a smo vseeno naredili slepo potezo in s tem ustvarili resne težave sebi in prihodnjim generacijam. Zato moramo biti zelo previdni pri uporabi genskega inženiringa, ki deluje na ravni, kjer je vsebovan. popolne informacije o najgloblji strukturi življenja.

Potrebovali so milijone let, da se je življenje na Zemlji razvilo v zelo uravnotežen, dinamičen ekosistem, kakršen je danes, z vso nešteto raznolikostjo življenjskih oblik, ki jih danes poznamo. Zdaj živimo v času, ko bodo v generaciji ali manj najpomembnejše poljščine podvržene korenitim spremembam zaradi posega genskega inženiringa in te spremembe bodo resno škodile celotnemu ekosistemu in ogrozile tudi celotno človeštvo. Dokler ne bo dokazana varnost izdelkov, pridobljenih z genskim inženiringom, bo to vprašanje vedno vprašljivo – in to je stališče, ki ga zagovarja Stranka naravnega prava. Nujno je, da uporabo genskega inženiringa spremlja strog znanstveni varnostni nadzor. Skoraj s popolno gotovostjo lahko trdimo, da bo genski inženiring povzročil kemično onesnaženje okolja. Žlahtnjenje sort zrn s povečano odpornostjo na herbicide bo povzročilo dejstvo, da bodo kmetje prisiljeni uporabiti trikrat več kemičnih pesticidov za zatiranje plevela kot doslej, to pa bo povečalo onesnaženje ameriške zemlje in podzemne vode. Na primer, kemično podjetje Monsanto je že razvilo sorte koruze, soje in sladkorne pese, ki so odporne na herbicid Roundup, ki ga proizvaja isto podjetje. Predstavniki industrije so večkrat povedali, da je Roundup varen za žive organizme in da ga okolje hitro nevtralizira. Vendar pa so predhodne raziskave na Danskem pokazale, da Roundup ostane v tleh tri leta (in ga torej lahko absorbirajo naslednji pridelki, posajeni na tem območju), druga znanstvena dela pa so pokazala, da njegova uporaba Herbicid povzroča toksične reakcije pri kmetih, moti reproduktivno funkcijo sesalcev ter škoduje ribam, deževnikom in koristnim žuželkam.

Zagovorniki genskega inženiringa pogosto trdijo, da je tehnologija le izboljšana oblika križanja, ki se že tisočletja uporablja za izboljšanje vrste poljščin in domačih živali. Toda v resnici poseg genskega inženiringa prodira skozi naravne reproduktivne ovire med vrstami, ki ohranjajo ravnovesje in celovitost življenja na Zemlji. Tradicionalni sistem vzreje novih pasem in sort lahko križa eno pasmo prašičev z drugo ali konja z oslom ali dve sorti paradižnika, ne more pa paradižnika z ribami – narava ne dopušča takšnega mešanja genov. In s pomočjo genskega inženiringa so znanstveniki že združili gene rib in paradižnika - in ti paradižniki, ki niso označeni na noben način, zdaj tiho ležijo na naših policah. Poleg tega so skoraj vsa žita in stročnice, zelenjava in sadje že prestala poseg genskega inženiringa in prehrambena industrija namerava vse te izdelke predstaviti v naslednjih 5-8 letih. Pioneer Hybrid International, največje svetovno semensko podjetje, je uporabilo genski inženiring za razvoj nove sorte soje, ki vključuje gen za brazilski oreh za povečanje vsebnosti beljakovin v soji. Toda vsajena komponenta brazilskega oreha v soji je povzročila alergijsko reakcijo pri večini potrošnikov, nato pa je Pioneer preklical projekt. In ko je japonsko podjetje Showa Denko z genskim inženiringom spremenilo strukturo naravnih bakterij za učinkovitejšo proizvodnjo aditivi za živila imenovan triptofan, so te genetske manipulacije povzročile, da je bakterija, čeprav je vsebovala triptofan, proizvedla zelo strupeno snov, ki so jo odkrili šele po tem, ko je bil izdelek dan na trg leta 1989. Posledično: 5000 ljudi je zbolelo, 1500 jih je postalo trajnih invalidov, 37 pa jih je umrlo. Raziskovalci so zelo navdušeni nad uporabo genskega inženiringa za razvoj bolj donosnih sort pšenice, ustvarjanje bolj hranljive hrane in odpravo nekaterih bolezni, s čimer upajo, da bodo izboljšali življenje ljudi na Zemlji. Toda v resnici je kljub dejstvu, da je gene mogoče ekstrahirati in pravilno križati v eksperimentalni bučki, v resničnem življenju zelo težko predvideti posledice vsaditve genov v telo nekoga drugega.

Takšne operacije lahko povzročijo mutacije, zaradi česar je aktivnost naravnih genov telesa zatrta. Vneseni geni lahko povzročijo tudi nepričakovane stranske učinke: gensko spremenjena hrana lahko na primer vsebuje toksine in alergene ali ima zmanjšano hranilno vrednost, zaradi česar potrošniki zbolijo ali celo, kar se je zgodilo, umrejo. Poleg tega so organizmi, vzrejeni z genskim inženiringom, sposobni samostojnega razmnoževanja in križanja z naravnimi populacijami, ki niso bile podvržene genskemu posegu, kar povzroča nepopravljive biološke spremembe celotnem ekosistemu Zemlje. Z gotovostjo lahko rečemo, da je genski inženiring zagotovo perspektivno področje, ki pa pri nas žal ni financirano in nima svojega proizvajalca. Rusija se seveda ukvarja z razvojem na tem področju, vendar je prisiljena svoje izume prodajati v tujino. Naši znanstveniki so izumili človeški interferon, aspartam in pajčevino. Pomembno je, da pri ustvarjanju zdravila ne gre v uporabo, dokler njegova struktura ni blizu človeškemu genomu. V tem primeru je zdravilo popolnoma neškodljivo. Pri proizvodnji aspartama se mešata dve aminokislini, vendar so katalizator procesa mikroorganizmi. Naloga genetika je izvesti razvoj tako, da čiščenje zdravila iz mikroorganizmov prestane 100-odstotno preverjanje. To je kakovost dela. Odgovorni smo za kakovost in strokovno stališče je, da je genski inženiring v razumni meri koristen za človeštvo.

Genski inženiring - sovražnik ali prijatelj? Nevarnosti genskega inženiringa ...

Znanstvena dejstva o nevarnostih genskega inženiringa

1. Genski inženiring se bistveno razlikuje od razvoja novih sort in pasem. Umetno dodajanje tujih genov močno moti natančno regulirano genetsko kontrolo normalne celice. Manipulacija genov se bistveno razlikuje od kombinacije materinih in očetovih kromosomov, do katere pride pri naravnih križanjih.

2. Trenutno je genski inženiring tehnično nepopoln, saj ne more nadzorovati procesa vstavljanja novega gena. Zato je nemogoče predvideti mesto vstavitve in učinke dodanega gena. Tudi če je lokacijo gena mogoče določiti, ko je bil vstavljen v genom, so razpoložljive informacije o DNK zelo nepopolne za napovedovanje rezultatov.

3. Kot posledica umetnega dodajanja tujega gena, nepričakovano nevarne snovi. V najslabšem primeru so to lahko strupene snovi, alergeni ali druge zdravju škodljive snovi. Podatki o takih možnostih so še zelo nepopolni.

4. Popolnoma zanesljivih metod testiranja neškodljivosti ni. Več kot 10 % resnih neželenih učinkov novih zdravil ni mogoče odkriti kljub skrbno izvedenim varnostnim študijam. Tveganje, da bodo škodljive lastnosti novih gensko spremenjenih živil ostale neodkrite, je verjetno bistveno večje kot pri zdravilih.

5. Sedanje zahteve glede varnostnega testiranja so izjemno nezadostne. Jasno so oblikovani za poenostavitev postopka odobritve. Omogočajo uporabo izjemno neobčutljivih metod testiranja neškodljivosti. Zato obstaja veliko tveganje, da bodo nevarni živilski izdelki lahko prestali pregled neopaženi.

6. Dosedanji živilski izdelki, ustvarjeni z genskim inženiringom, nimajo pomembne vrednosti za človeštvo. Ti izdelki zadovoljujejo predvsem komercialne interese.

7. Poznavanje učinkov gensko spremenjenih organizmov, vnesenih v okolje, je popolnoma nezadostno. Ni še dokazano, da z genskim inženiringom spremenjeni organizmi ne bodo škodljivo vplivali na okolje. Okoljevarstveniki so predlagali različne možne okoljske zaplete. Obstaja na primer veliko možnosti za nenadzorovano širjenje potencialno škodljivih genov, ki jih uporablja genski inženiring, vključno s prenosom genov z bakterijami in virusi. Zapleti, ki jih povzroča okolju, verjetno ne bo mogoče popraviti, saj sproščenih genov ni mogoče vzeti nazaj.

8. Novo in nevarni virusi. Eksperimentalno je bilo dokazano, da se virusni geni, vgrajeni v genom, lahko združujejo z geni kužnih virusov (ti rekombinacija). Ti novi virusi so morda bolj agresivni od prvotnih. Virusi lahko tudi postanejo manj specifični za vrsto. Na primer, rastlinski virusi lahko postanejo škodljivi za koristne žuželke, živali in tudi ljudi.

9. Poznavanje dedne snovi, DNK, je zelo nepopolno. Znano je delovanje le treh odstotkov DNK. tvegano manipulirati kompleksni sistemi, znanje o katerem je nepopolno. Bogate izkušnje s področja biologije, ekologije in medicine kažejo, da lahko to povzroči resne nepredvidljive težave in motnje.

10. Genski inženiring ne bo rešil problema svetovne lakote. Trditev, da lahko genski inženiring pomembno prispeva k rešitvi problema svetovne lakote, je znanstveno neutemeljen mit.

Genski inženiring(genetski inženiring) - skupek metod in tehnologij, vključno s tehnologijami za proizvodnjo rekombinantnih ribonukleinskih in deoksiribonukleinskih kislin, za izolacijo genov iz telesa, manipulacijo genov in njihovo vnašanje v druge organizme.

Genski inženiring - komponento sodobna biotehnologija, teoretična osnova to je molekularna biologija, genetika. Bistvo nove tehnologije je usmerjeno, po vnaprej določenem programu, načrtovanje molekularnih genetski sistemi zunaj telesa (in vitro) z naknadnim vnosom ustvarjenih struktur v živi organizem. Posledično se doseže njihova vključitev in aktivnost v določenem organizmu in njegovem potomstvu. Možnosti genskega inženiringa so genska transformacija, prenos tujih genov in drugih materialnih nosilcev dednosti v celice rastlin, živali in mikroorganizmov, proizvodnja gensko spremenjenih (gensko spremenjenih, transgenih) organizmov z novimi edinstvenimi genetskimi, biokemičnimi in fiziološke lastnosti in znaki, zaradi katerih je ta smer strateška.

Z metodološkega vidika genetski inženiring združuje temeljna načela (genetika, celična teorija, molekularna biologija, sistemska biologija), dosežke najsodobnejših postgenomskih ved: genomike, metabolomike, proteomike in resnični dosežki na aplikativnih področjih: biomedicina, agrobiotehnologija, bioenergija, biofarmakologija, bioindustrija itd.

Gensko inženirstvo sodi (skupaj z biotehnologijo, genetiko, molekularno biologijo in vrsto drugih ved o življenju) na področje naravoslovja.

Zgodovinska referenca

Gensko inženirstvo se je pojavilo zaradi dela številnih raziskovalcev v različnih vejah biokemije in molekularne genetike. Leta 1953 sta J. Watson in F. Crick na prelomu 50-ih in 60-ih let 20. stoletja ustvarila model dvoverižne DNK; genetski kod, do konca 60. let pa je bila njegova univerzalnost potrjena eksperimentalno. Prišlo je do intenzivnega razvoja molekularne genetike, katere objekti so bili E. coli, njeni virusi in plazmidi. Razvite so bile metode za izolacijo visoko prečiščenih pripravkov intaktnih molekul DNA, plazmidov in virusov. DNA virusov in plazmidov je bila vnesena v celice v biološko aktivni obliki, kar je zagotovilo njeno replikacijo in izražanje ustreznih genov. G. Smith je leta 1970 prvi izoliral številne encime – restrikcijske encime, primerne za namene genskega inženiringa. G. Smith je ugotovil, da očiščen encim HindII, pridobljen iz bakterij, ohranja sposobnost rezanja molekul nukleinske kisline (aktivnost nukleaze), značilno za žive bakterije. Kombinacija DNA restrikcijskih encimov (za rezanje molekul DNA na določene fragmente) in encimov, DNA ligaz, izoliranih že leta 1967 (za »povezovanje« fragmentov v poljubno zaporedje), lahko upravičeno velja za osrednji člen v tehnologiji genskega inženiringa.

Tako so bili do začetka 70. let oblikovani osnovni principi delovanja nukleinskih kislin in proteinov v živem organizmu ter ustvarjeni teoretični predpogoji za genski inženiring.

Akademik A.A. Baev je bil prvi znanstvenik v naši državi, ki je verjel v obljube genskega inženiringa in vodil raziskave na tem področju. Gensko inženirstvo (po definiciji) je in vitro gradnja funkcionalno aktivnih genetskih struktur (rekombinantne DNK) ali z drugimi besedami ustvarjanje umetnih genetskih programov.

Cilji in metode genskega inženiringa

Znano je, da ima tradicionalna vzreja številne omejitve, ki preprečujejo proizvodnjo novih živalskih pasem, rastlinskih sort ali ras praktično dragocenih mikroorganizmov:

1. odsotnost rekombinacije pri nesorodnih vrstah. Med vrstami obstajajo toge ovire, ki otežujejo naravno rekombinacijo.
2. nezmožnost nadzora procesa rekombinacije v telesu od zunaj. Pomanjkanje homologije med kromosomi vodi do nezmožnosti približevanja in izmenjave posameznih delov (in genov) med nastajanjem zarodnih celic. Posledično postane nemogoče prenesti potrebne gene in zagotoviti optimalno kombinacijo genov, pridobljenih iz različnih starševskih oblik v novem organizmu;
3. nezmožnost natančne opredelitve lastnosti in lastnosti potomcev, ker Postopek rekombinacije je statističen.

Naravne mehanizme, ki varujejo čistost in stabilnost genoma organizma, je s klasičnimi selekcijskimi metodami skoraj nemogoče preseči.

Tehnologija pridobivanja genetsko spremenjeni organizmi(GSO) temeljito rešuje vprašanja premagovanja vseh naravnih in medvrstnih rekombinacijskih in reproduktivnih ovir. Za razliko od tradicionalne selekcije, pri kateri se genotip spreminja le posredno, genski inženiring omogoča neposreden poseg v genetski aparat s tehniko molekularnega kloniranja. Genetski inženiring vam omogoča, da delate s poljubnimi geni, tudi umetno sintetiziranimi ali pripadajočimi nepovezanim organizmom, jih prenašate iz ene vrste v drugo in jih kombinirate v poljubnem vrstnem redu.

Tehnologija vključuje več stopenj ustvarjanja GSO:

1. Pridobivanje izoliranega gena.
2. Vnos gena v vektor za integracijo v telo.
3. Prenos vektorja s konstruktom v spremenjeni prejemni organizem.
4. Molekularno kloniranje.
5. Izbor GSO.

Prva stopnja - sinteza, izolacija in identifikacija fragmentov tarčne DNA ali RNA in regulatornih elementov je zelo dobro razvita in avtomatizirana. Izolirani gen je mogoče pridobiti tudi iz knjižnice fagov.

Druga stopnja je ustvarjanje in vitro (v epruveti) genetskega konstrukta (transgena), ki vsebuje enega ali več fragmentov DNA (kodirajo aminokislinsko zaporedje proteinov) v kombinaciji z regulatornimi elementi (slednji zagotavljajo aktivnost transgeni v telesu). Nato se transgeni vstavijo v DNK vektorja za kloniranje z uporabo orodij genskega inženiringa – restrikcijskih encimov in ligaz. Za odkritje restrikcijskih encimov so Werner Arber, Daniel Nathans in Hamilton Smith prejeli Nobelovo nagrado (1978). Kot vektor se praviloma uporabljajo plazmidi, majhne krožne molekule DNA bakterijskega izvora.

Naslednja stopnja je dejanska “genska modifikacija” (transformacija), tj. prenos konstrukta »vektor – vgrajena DNK« v posamezne žive celice. Vnos končnega gena v dedni aparat rastlinskih in živalskih celic je težka naloga, ki je bil rešen po proučevanju značilnosti vnosa tuje DNA (virusa ali bakterije) v genetski aparat celice. Kot princip uvajanja je bil uporabljen postopek transfekcije genetski material v kletko.

Če je transformacija uspešna, potem po učinkoviti replikaciji iz ene transformirane celice nastane veliko hčerinskih celic, ki vsebujejo umetno ustvarjen genski konstrukt. Osnova za pojav nove lastnosti v organizmu je biosinteza za organizem novih beljakovin - transgenskih produktov, na primer rastlin - odpornost na sušo ali škodljivce v gensko spremenjenih rastlinah.

Za enocelični organizmi proces genske modifikacije je omejen na vstavitev rekombinantnega plazmida s kasnejšo selekcijo spremenjenih potomcev (klonov). Za višje večcelične organizme, na primer rastline, je obvezna vključitev konstrukta v DNK kromosomov ali celičnih organelov (kloroplastov, mitohondrijev), čemur sledi regeneracija celotne rastline iz ločene izolirane celice na hranilnih medijih. Pri živalih se celice s spremenjenim genotipom vnesejo v blastocide nadomestne matere. Prve gensko spremenjene rastline so leta 1982 pridobili znanstveniki z Inštituta za rastlinstvo v Kölnu in podjetja Monsanto.

Glavne smeri

Postgenomsko obdobje v prvem desetletju 21. stoletja je dvignilo razvoj genskega inženiringa na novo raven. Tako imenovani Kölnski protokol »K na znanju temelječemu bioekonomiji« je bioekonomijo opredelil kot »preoblikovanje znanja znanosti o življenju v nove, trajnostne, okoljsko učinkovite in konkurenčne izdelke«. Načrt genskega inženiringa vsebuje številna področja: gensko zdravljenje, bioindustrijo, tehnologije, ki temeljijo na živalskih matičnih celicah, gensko spremenjenih rastlinah, gensko spremenjenih živalih itd.

Gensko spremenjene rastline

Tujo DNK lahko vnesemo v rastline na različne načine.

Za dvodomne rastline obstaja naravni vektor za horizontalni prenos genov: plazmidi Agrobacterium. Kar zadeva enokaličnice, čeprav so bili v zadnjih letih doseženi določeni uspehi pri njihovem preoblikovanju z agrobakterijskimi vektorji, se takšna pot preoblikovanja še vedno srečuje z velikimi težavami.

Za transformacijo rastlin, odpornih na agrobakterije, so bile razvite metode za neposredni fizični prenos DNK v celico, ki vključujejo: obstreljevanje z mikrodelci ali balistično metodo; elektroporacija; obdelava s polietilen glikolom; Prenos DNK v liposomih itd.

Ko je rastlinsko tkivo tako ali drugače preoblikovano, ga in vitro postavimo na posebno gojišče s fitohormoni, ki spodbuja celično proliferacijo. Gojišče običajno vsebuje selektivno sredstvo, na katerega pridobijo odpornost transgene celice, ne pa kontrolne celice. Regeneracija največkrat preide skozi fazo kalusa, po kateri, ko pravilna izbira začne se organogeneza (nastajanje poganjkov). Nastale poganjke prenesemo v koreninski medij, ki pogosto vsebuje tudi selektivno sredstvo za strožjo selekcijo transgenih osebkov.

Prve transgene rastline (rastline tobaka z vstavljenimi geni iz mikroorganizmov) so bile pridobljene leta 1983. Prvi uspešni terenski poskusi transgenih rastlin (rastlin tobaka, odpornih na virusne okužbe) so bili v ZDA izvedeni že leta 1986.

Po opravljenih vseh potrebnih testih za toksičnost, alergenost, mutagenost itd. Prvi transgeni izdelki so postali komercialno dostopni v Združenih državah leta 1994. To so bili Calgenovi paradižniki Flavr Savr z zakasnjenim zorenjem in Monsantova soja, odporna na herbicide. V 1-2 letih so biotehnološka podjetja dala na trg celo vrsto gensko spremenjenih rastlin: paradižnik, koruza, krompir, tobak, soja, ogrščica, bučke, redkev, bombaž.

V Ruski federaciji je bila leta 1990 prikazana možnost pridobivanja transgenega krompirja z bakterijsko transformacijo z uporabo Agrobacterium tumefaciens.

Trenutno se na stotine komercialnih podjetij po vsem svetu s skupnim kapitalom več kot 100 milijard dolarjev ukvarja s proizvodnjo in testiranjem gensko spremenjenih rastlin. Genski inženiring rastlinska biotehnologija je že postala pomembna veja proizvodnje hrane in drugod zdravi izdelki, ki privabi pomembne človeške vire in finančne tokove.

V Rusiji je pod vodstvom akademika K.G. Skrjabin (Center za bioinženiring Ruske akademije znanosti), pridobljene in karakterizirane so bile gensko spremenjene sorte krompirja Elizaveta Plus in Lugovskoy Plus, odporne na koloradskega hrošča. Na podlagi rezultatov inšpekcijskega pregleda Zvezne službe za nadzor na področju varstva pravic potrošnikov in dobrega počutja ljudi, na podlagi strokovnega mnenja Državnega raziskovalnega inštituta za prehrano Ruske akademije medicinskih znanosti, so te sorte so opravili državno registracijo, vpisani v državni register in so dovoljeni za uvoz, proizvodnjo in promet v Ruski federaciji.

Te gensko spremenjene sorte krompirja se bistveno razlikujejo od konvencionalnih po prisotnosti integriranega gena v svojem genomu, ki določa 100-odstotno zaščito pridelka pred koloradskim hroščem brez uporabe kakršnih koli kemikalij.

Prvi val transgenih rastlin, odobrenih za praktično uporabo, je vseboval dodatne gene za odpornost (na bolezni, herbicide, škodljivce, kvarjenje med skladiščenjem, stres).

Trenutna stopnja razvoja rastlinskega genskega inženiringa se imenuje "metabolični inženiring". V tem primeru naloga ni toliko izboljšati nekatere obstoječe lastnosti rastline, kot pri tradicionalnem žlahtnjenju, ampak naučiti rastlino proizvajati popolnoma nove spojine, ki se uporabljajo v medicini, kemični proizvodnji in na drugih področjih. Te spojine so lahko na primer posebne maščobne kisline, koristne beljakovine z visoko vsebnostjo esencialnih aminokislin, modificirani polisaharidi, užitna cepiva, protitelesa, interferoni in drugi »zdravilni« proteini, novi polimeri, ki ne onesnažujejo okolja, in še marsikaj. , veliko več. Uporaba transgenih rastlin omogoča vzpostavitev obsežne in poceni proizvodnje tovrstnih snovi in ​​s tem njihovo večjo dostopnost za široko porabo.

Gensko spremenjene živali

Živalske celice se bistveno razlikujejo od bakterijskih celic po svoji sposobnosti absorpcije tuje DNA, zato metode in metode za vnos genov v embrionalne celice sesalcev, muh in rib ostajajo v središču pozornosti genetskih inženirjev.

Najbolj genetsko raziskan sesalec je miš. Prvi uspeh sega v leto 1980, ko je D. Gordon s sodelavci dokazal možnost vnosa in integracije tuje DNK v genom miši. Integracija je bila stabilna in ohranjena pri potomcih. Transformacija se izvede z mikroinjiciranjem kloniranih genov v enega ali oba pronukleusa (jedra) novonastalega zarodka v enocelični fazi (zigota). Pogosteje se izbere moški pronukleus, ki ga vnese sperma, saj je njegova velikost večja. Po injiciranju se jajčece takoj implantira v jajcevod posvojitvene matere ali pusti, da se razvije v kulturi do stopnje blastociste, nato pa se implantira v maternico.

Tako so bili vbrizgani geni za človeški interferon in inzulin, kunčji gen za β-globin, gen za timidin kinazo virusa herpes simpleks in cDNA virusa mišje levkemije. Število molekul, ki jih dajemo na injekcijo, je od 100 do 300.000, njihova velikost pa je od 5 do 50 kb. Običajno preživi 10–30 % jajčec, delež miši, skotenih iz transformiranih jajčec, pa se giblje od nekaj do 40 %. Torej je dejanska učinkovitost približno 10%.

Ta metoda je bila uporabljena za proizvodnjo gensko spremenjenih podgan, zajcev, ovac, prašičev, koz, telet in drugih sesalcev. Pri nas so bili pridobljeni prašiči nosilci gena za somatotropin. V stopnjah rasti se niso razlikovale od normalnih živali, vendar je sprememba metabolizma vplivala na vsebnost maščob. Pri takih živalih so bili procesi lipogeneze inhibirani in aktivirana sinteza beljakovin. Vstavljanje genov insulinu podobnega faktorja je povzročilo tudi spremembe v metabolizmu. Gensko spremenjeni prašiči so bili ustvarjeni za preučevanje verige biokemičnih transformacij hormona, stranski učinek pa je bila krepitev imunskega sistema.

Najmočnejši sistem za sintezo beljakovin se nahaja v celicah mlečne žleze. Če postavite gene tujih beljakovin pod nadzor promotorja kazeina, bo izražanje teh genov močno in stabilno, beljakovine pa se bodo kopičile v mleku. S pomočjo živalskih bioreaktorjev (transgene krave) je že pridelano mleko, ki vsebuje človeško beljakovino laktoferin. Ta protein naj bi se uporabljal za preprečevanje gastroenteroloških bolezni pri ljudeh z nizko imunsko odpornostjo: bolnikih z aidsom, nedonošenčkih, bolnikih z rakom, ki so bili podvrženi radioterapiji.

Pomembno področje transgenoze je proizvodnja živali, odpornih na bolezni. Gen interferona, povezan z zaščitnimi proteini, so vstavili v različne živali. Transgene miši so bile deležne odpornosti - niso zbolele ali so zbolele malo, pri prašičih pa takšnega učinka niso našli.

Uporaba v znanstvenih raziskavah

Gene knockout je tehnika za odstranitev enega ali več genov, ki omogoča preučevanje delovanja gena. Za proizvodnjo izločenih miši se nastali gensko spremenjeni konstrukt vnese v embrionalne matične celice, kjer je konstrukt podvržen somatski rekombinaciji in nadomesti normalni gen, spremenjene celice pa se implantirajo v blastociste nadomestne matere. Na podoben način pride do izločkov v rastlinah in mikroorganizmih.

Umetno izražanje je dodatek gena telesu, ki ga prej ni imelo, tudi z namenom proučevanja delovanja genov. Vizualizacija genskega produkta – Uporablja se za preučevanje lokacije genskega produkta. Zamenjava normalnega gena z inženirskim genom, spojenim z reporterskim elementom (na primer genom zelenega fluorescentnega proteina), zagotavlja vizualizacijo produkta genske modifikacije.

Študija mehanizma izražanja. V telo se vnese majhen del DNK, ki se nahaja pred kodirno regijo (promotor) in služi za vezavo transkripcijskih faktorjev, nato pa sledi reporterski gen, na primer GFP, ki katalizira zlahka zaznavno reakcijo namesto lastnega gena. Poleg tega, da postane delovanje promotorja v določenih tkivih včasih jasno vidno, takšni poskusi omogočajo preučevanje strukture promotorja z odstranitvijo ali dodajanjem fragmentov DNA ter umetno izboljšanjem gena. izražanje.

Biološka varnost dejavnosti genskega inženiringa

Leta 1975 so znanstveniki po vsem svetu na konferenci Asilomar dvignili najpomembnejše vprašanje: ali bo pojav GSO potencialno negativno vplival na biološka raznovrstnost? Od tega trenutka se je hkrati s hitrim razvojem genskega inženiringa začela razvijati nova smer - biološka varnost. Njegova glavna naloga je oceniti, ali ima uporaba GSO neželene učinke na okolje, zdravje ljudi in živali, glavni cilj pa je odpreti pot uporabi dosežkov sodobne biotehnologije ob zagotavljanju varnosti.

Strategija biološke varnosti temelji na znanstvena raziskava značilnosti GSO, izkušnje z njim ter informacije o njegovem namenu in okolju, v katerega bo vnesen. S skupnimi dolgoročnimi prizadevanji mednarodnih organizacij (UNEP, WHO, OECD), strokovnjaki iz različnih držav, vključno z Rusijo, osnovni pojmi in postopki: biološka varnost, biološka nevarnost, tveganje, ocena tveganja. Šele po uspešno opravljenem celotnem ciklu preverjanj se pripravi znanstveni zaključek o biološki varnosti GSO. WHO je leta 2005 objavila poročilo, po katerem je uživanje gensko spremenjenih rastlin, registriranih kot hrana, enako varno kot njihovi tradicionalni primerki.

Kako je v Rusiji zagotovljena biološka varnost? Ratifikacijo Konvencije o biotski raznovrstnosti leta 1995 lahko štejemo za začetek vključitve Rusije v svetovni sistem biološke varnosti. Od tega trenutka se je začelo oblikovanje nacionalni sistem biološka varnost, katere izhodišče je bil začetek veljavnosti zveznega zakona Ruske federacije "O državni ureditvi na področju dejavnosti genskega inženiringa" (1996). Zvezni zakon določa osnovne koncepte in načela državne ureditve in nadzora vseh vrst dela z GSO. Zvezni zakon določa stopnje tveganja glede na vrsto GSO in vrsto dela, opredeljuje zaprte in odprte sisteme, sproščanje GSO itd.

V zadnjih letih je Rusija razvila enega najstrožjih regulativnih sistemov. Nenavadno je, da se je sistem državne regulacije gensko spremenjenih organizmov začel izvajati preventivno, leta 1996, preden so bili pravi gensko spremenjeni organizmi razglašeni za komercializacijo v Rusiji (prvi GSO - gensko spremenjena soja - je bila registrirana za uporabo v prehrani leta 1999). Osnovni pravni instrumenti so državna registracija gensko spremenjenih organizmov, pa tudi proizvodov, pridobljenih iz njih ali jih vsebujejo, namenjenih za uporabo kot hrana in krma.

Za razumevanje Trenutne razmere pomembno dejstvo je, da v 25 letih, kolikor je minilo od prvega vstopa gensko spremenjenih rastlin na trg, ni bil ugotovljen niti en zanesljiv negativen vpliv na okolje ter zdravje ljudi in živali, niti med testiranjem niti med komercialna uporaba. Samo eden od svetovnih virov - poročilo avtoritativnega društva AGBIOS "Essential Biosafety" vsebuje več kot 1000 referenc na študije, ki dokazujejo, da sta hrana in krma, pridobljena iz biotehnoloških pridelkov, enako varna kot tradicionalni proizvodi. Vendar pa danes v Rusiji ni regulativnega okvira, ki bi dovoljeval sproščanje v okolje gensko spremenjenih rastlin, pa tudi izdelkov, pridobljenih iz njih ali jih vsebujejo, na ozemlju naše države. Posledično se od leta 2010 na ozemlju Ruske federacije v komercialne namene ne goji niti ena gensko spremenjena rastlina.

Po napovedih Kölnskega protokola (2007) se bo do leta 2030 odnos do gensko spremenjenih kmetijskih pridelkov spremenil v smer odobritve njihove uporabe.

Dosežki in razvojne možnosti

Genetski inženiring v medicini

Potrebe po zdravstveni oskrbi in reševanje problemov starajočega se prebivalstva ustvarjajo stalno povpraševanje po gensko spremenjenih farmacevtskih izdelkih (z letno prodajo 26 milijard dolarjev) ter medicinskih in kozmetičnih izdelkih iz rastlinskih in živalskih surovin (z letno prodajo okoli 40 milijard dolarjev). ZDA).

Med številnimi dosežki genskega inženiringa, ki so bili uporabljeni v medicini, je najpomembnejša proizvodnja človeškega insulina v industrijskem obsegu.

Trenutno po podatkih WHO približno 110 milijonov ljudi na svetu trpi za sladkorno boleznijo. Inzulin, katerega injekcije so indicirane za bolnike s to boleznijo, že dolgo pridobivajo iz živalskih organov in uporabljajo v zdravniška praksa. Vendar pa dolgotrajna uporaba živalskega inzulina povzroči nepopravljivo okvaro številnih bolnikovih organov zaradi imunoloških reakcij, ki jih povzroči vbrizgavanje tujkov. na človeško teloživalski insulin. Toda tudi potrebe po živalskem insulinu so bile do nedavnega pokrite le za 60–70 %. Genetski inženirji Kot prva praktična naloga je bil kloniran inzulinski gen. Gene kloniranega humanega inzulina so s plazmidom vnesli v bakterijsko celico, kjer se je začela sinteza hormona, ki ga naravni sevi mikrobov niso nikoli sintetizirali. Od leta 1982 podjetja v ZDA, na Japonskem, v Veliki Britaniji in drugih državah proizvajajo gensko spremenjen inzulin. V Rusiji se proizvodnja gensko spremenjenega humanega insulina - Insuran - izvaja na Inštitutu za bioorgansko kemijo poimenovano po. MM. Shemyakin in Yu.A. Ovchinnikov RAS. Danes se domači insulin proizvaja v količini, ki zadostuje za oskrbo bolnikov s sladkorno boleznijo v Moskvi. Hkrati je povpraševanje celotnega ruskega trga po gensko spremenjenem insulinu zadovoljeno predvsem z uvoženimi zalogami. Svetovni trg z inzulinom je trenutno vreden več kot 400 milijonov dolarjev, z letno porabo približno 2500 kg.

Razvoj genskega inženiringa v 80-ih letih prejšnjega stoletja je Rusiji dal dobre temelje pri ustvarjanju gensko spremenjenih sevov mikroorganizmov z dane lastnosti– proizvajalci biološko aktivne snovi, pri razvoju metod genskega inženiringa za rekonstrukcijo genskega materiala virusov, pri proizvodnji zdravilnih učinkovin, vključno z uporabo računalniško modeliranje. Rekombinantni interferon in dozirne oblike na njegovi osnovi za medicinske in veterinarske namene, interlevkin (b-levkin) in eritropoetin so prišli v fazo proizvodnje. Kljub naraščajočemu povpraševanju po visoko prečiščenih zdravilih domača proizvodnja imunoglobulinov, albumina in plazmola zagotavlja 20% potreb domačega trga.

Aktivno potekajo raziskave za razvoj cepiv za preprečevanje in zdravljenje hepatitisa, aidsa in številnih drugih bolezni ter konjugiranih cepiv nove generacije proti najbolj družbeno pomembnim okužbam. Nova generacija polimernih podenotnih cepiv je sestavljena iz visoko prečiščenih zaščitnih antigenov različnih narav in nosilca – imunostimulansa polioksidonija, ki zagotavlja povečana raven specifični imunski odziv. Rusija bi lahko zagotovila cepljenja proti veliki večini znanih okužb na podlagi lastne imunološke proizvodnje. Samo proizvodnja cepiva proti rdečkam je popolnoma odsotna.

Genetski inženiring za kmetijstvo

Genetsko izboljšanje poljščin in okrasnih rastlin je dolgotrajen in neprekinjen proces z uporabo vse bolj natančnih in predvidljivih tehnologij. Znanstveno poročilo ZN (1989) je navedlo naslednje: »Ker molekularne metode so najbolj natančni, imajo tisti, ki jih uporabljajo, večje zaupanje v lastnosti, ki jih dajejo rastlinam, in je zato manj verjetno, da bodo imeli nenamerne učinke kot pri običajnih metodah žlahtnjenja.«

Prednosti novih tehnologij že na veliko izkoriščajo v državah, kot so ZDA, Argentina, Indija, Kitajska in Brazilija, kjer gensko spremenjene pridelke gojijo na velikih površinah.

Nove tehnologije prav tako močno vplivajo na revne kmete in ljudi v revnih državah, zlasti na ženske in otroke. Na primer, gensko spremenjeni bombaž in koruza, odporna na škodljivce, zahtevata znatno višje stopnje uporabe insekticidov. manjše količine(zaradi česar je delo na kmetiji varnejše). Takšni pridelki pomagajo povečati produktivnost, kmetom prinašajo višje dohodke, zmanjšujejo revščino in zmanjšujejo tveganje zastrupitve prebivalstva s kemičnimi pesticidi, kar je še posebej značilno za številne države, vključno z Indijo, Kitajsko, Južno Afriko in Filipini.

Najpogostejše gensko spremenjene rastline so tiste, ki so odporne na poceni, najmanj strupene in najbolj razširjene herbicide. Gojenje takšnih pridelkov vam omogoča, da dobite večji donos na hektar, se znebite izčrpavajočega ročnega plevela, porabite manj denarja zaradi minimalne obdelave ali brez obdelave, kar posledično vodi do zmanjšanja erozije tal.

V letu 2009 so gensko spremenjene pridelke prve generacije nadomestili proizvodi druge generacije, kar je prvič privedlo do povečanja samega pridelka. Primer novega razreda biotehnoloških pridelkov (na katerem so delali številni raziskovalci) je na glifosat odporna soja RReady2Yield™, pridelana leta 2009 v ZDA in Kanadi na več kot 0,5 milijona hektarjev.

Vpeljavo genskega inženiringa v sodobno agrobiologijo lahko ponazorimo z naslednjimi podatki iz številnih tujih strokovnih ocen, med drugim iz letne recenzije neodvisne mednarodne službe za spremljanje uporabe agrobiotehnologij (ISAAA), ki jo vodi svetovno znani strokovnjak Claiv James. : (www .isaaa.org)

Leta 2009 je 25 držav po svetu gojilo gensko spremenjene rastline na površini 134 milijonov hektarjev (kar je 9 % od 1,5 milijarde hektarjev vseh obdelovalnih površin na svetu). Šest držav EU (od 27) je gojilo Bt koruzo, v letu 2009 pa je površina z Bt koruzo dosegla več kot 94.750 hektarjev. Analiza globalnega gospodarskega vpliva uporabe biotehnoloških poljščin za obdobje od 1996 do 2008. kaže povečanje dobička v višini 51,9 milijarde $ zaradi dveh virov: prvič, zmanjšanje proizvodnih stroškov (50 %) in drugič, znatno povečanje pridelka (50 %) za 167 milijonov ton.

Leta 2009 je bila skupna tržna vrednost semen gensko spremenjenih rastlin na svetu 10,5 milijarde dolarjev. Celotna biotehnološka vrednost zrn koruze in soje ter bombaža je leta 2008 znašala 130 milijard USD in naj bi letno rasla za 10–15 %.

Ocenjuje se, da se bo v primeru popolnega prevzema biotehnologije do konca obdobja 2006–2015 dohodek vseh držav glede na BDP povečal za 210 milijard dolarjev na leto.

Opazovanja od začetka uporabe v kmetijstvo posevki, odporni na herbicide, zagotavljajo prepričljiv dokaz, da lahko kmetje zdaj učinkoviteje zatirajo plevel. Hkrati rahljanje in oranje njiv izgubi pomen kot sredstvo zatiranja plevela. Posledično se zmanjša poraba goriva traktorja, izboljša se struktura tal in prepreči erozija. Ciljni insekticidni programi za Bt bombaž vključujejo manj škropljenja posevkov in s tem manj izletov na polje, kar ima za posledico zmanjšano erozijo tal. Vse to nehote prispeva k uvajanju varčevalne tehnologije obdelovanja tal, katere cilj je zmanjšanje erozija tal, raven ogljikov dioksid in zmanjšanje izgube vode.

Za trenutno stanje znanosti je značilno Kompleksen pristop, ustvarjanje enotnih tehnoloških platform za izvajanje širokega spektra raziskav. Ne združujejo le biotehnologije, molekularne biologije in genskega inženiringa, temveč tudi kemijo, fiziko, bioinformatiko, transkriptomiko, proteomiko, metabolomiko.

Priporočeno branje
1. J. Watson. Molekularna biologija gen. M.: Mir. 1978.
2. Stent G., Kalindar R. Molekularna genetika. M.: Mir. 1981
3. S.N. Ščelkunov "Genetski inženiring". Novosibirsk, založba Sibirska univerza, 2008
4. Glick B. Molekularna biotehnologija. Načela in uporaba / B. Glick, J. Pasternak. M.: Mir, 2002
5. Genetski inženiring rastlin. Laboratorijski priročnik. Uredili J. Draper, R. Scott, F. Armitage, R. Walden. M.: "Mir". 1991.
6. Agrobiotehnologija v svetu. Ed. Skrjabina K.G. M.: Center "Bioinženiring" RAS, 2008. - 135 str.
7. Klark. D., Russell L. Preprosta in zabavna molekularna biologija. M.: JSC "KOND Company". 2004

Povezave
1. "O državni ureditvi dejavnosti genskega inženiringa." Zvezni zakon-86 s spremembami 2000, čl
2. Kölnski protokol, Kölnski dokument, je bil sprejet na konferenci »Na poti k na znanju temelječemu bioekonomiji« (Köln, 30. maj 2007), ki jo je organizirala Evropska unija med nemškim predsedovanjem EU.

S pomočjo katerega se izvaja usmerjena kombinacija genetskih informacij katerega koli organizma. Genetski inženiring (GE) omogoča premagovanje naravnih medvrstnih ovir, ki onemogočajo izmenjavo genetskih informacij med taksonomsko oddaljenimi vrstami organizmov, ter ustvarjanje celic in organizmov s kombinacijami genov, ki v naravi ne obstajajo, z določenimi dednimi lastnostmi.

Glavni predmet vpliva genskega inženiringa je nosilec genetske informacije - deoksiribonukleinska kislina (DNK), katere molekula je običajno sestavljena iz dveh verig. Stroga specifičnost združevanja purinskih in pirimidinskih baz določa lastnost komplementarnosti - medsebojno ujemanje nukleotidov v dveh verigah. Ustvarjanje novih kombinacij genov se je izkazalo za možno zaradi temeljne podobnosti v strukturi molekul DNK v vseh vrstah organizmov in dejanske univerzalnosti genetike. Koda omogoča izražanje tujih genov (manifestacija njihove funkcionalne aktivnosti) v kateri koli vrsti celice. K temu je pripomoglo tudi kopičenje znanja s področja kemije, ugotavljanje molekularnih značilnosti organizacije in delovanja genov (vključno z vzpostavitvijo mehanizmov za uravnavanje njihovega izražanja in možnostjo podrejanja genov delovanju »tujkov«). regulatorni elementi), razvoj metod zaporedja DNA, odkritje verižne reakcije s polimerazo, ki je omogočila hitro sintetizacijo katerega koli fragmenta DNA.

Pomembni predpogoji za nastanek G.I. so bili: odkritje plazmidov, ki so sposobni avtonomne replikacije in prehoda iz ene bakterijske celice v drugo, in pojav transdukcije - prenos določenih genov z bakteriofagi, kar je omogočilo oblikovanje ideje o vektorjih - molekulah nosilcih genov.

Velik pomen pri razvoju metodologije G.I. igrajo encimi, ki sodelujejo pri transformaciji nukleinskih kislin: restrikcijski encimi (prepoznajo strogo določene sekvence (mesta) v molekulah DNA in na teh mestih »prerežejo« dvojno verigo), DNA ligaze (kovalentno vežejo posamezne fragmente DNA), reverzna transkriptaza (sintetizira RNA na šabloni komplementarna kopija DNA ali cDNA) itd. Samo v njihovi prisotnosti je ustvarjanje umetnosti. struktur je postala tehnično izvedljiva naloga. Encimi se uporabljajo za pridobivanje posameznih fragmentov DNA (genov) in ustvarjanje molekularnih hibridov – rekombinantne DNA (recDNA) na osnovi DNA plazmidov in virusov. Slednji dostavijo želeni gen v gostiteljsko celico, kjer zagotovijo njegovo razmnoževanje (kloniranje) in nastanek končnega genskega produkta (njegovo izražanje).

Principi ustvarjanja rekombinantnih molekul DNA

Izraz "G. In." je postala razširjena po P. Bergu in sod. Prvič je bila pridobljena rekombinantna DNK, ki je bila hibrid, v katerem so bili združeni fragmenti DNK bakterije Escherichia coli, njenega virusa (bakteriofaga λ) in DNK virusa opice SV40. Leta 1973 so S. Cohen in sod. Uporabili smo plazmid pSC101 in restrikcijski encim ( Eko RI), ki jo na enem mestu pretrga tako, da na koncih dvoverižne molekule DNK nastanejo kratki komplementarni enoverižni »repi« (običajno 4-6 nukleotidov). Imenujejo se "lepljivi", ker se lahko parijo (tako rekoč držijo skupaj) drug z drugim. Ko so takšno DNA pomešali z fragmenti tuje DNA, obdelane z istim restrikcijskim encimom in z enakimi lepljivimi konci, so dobili nove hibridne plazmide, od katerih je vsak vseboval vsaj en fragment tuje DNA, vdelan v Eko RI mesto plazmida. Postalo je očitno, da je mogoče v takšne plazmide vstaviti fragmente različnih tujih DNK, pridobljenih tako iz mikroorganizmov kot višjih evkariontov.

Glavna sodobna strategija za pridobivanje recDNA je naslednja:

1. v DNA plazmida ali virusa, ki se lahko razmnožuje neodvisno od kromosoma, se vstavijo fragmenti DNA, ki pripadajo drugemu organizmu in vsebujejo določene značilnosti. geni ali umetno pridobljena nukleotidna zaporedja, zanimiva za raziskovalca;
2. nastale hibridne molekule vnesemo v občutljive prokariontske ali evkariontske celice, kjer se replicirajo (pomnožijo, pomnožijo) skupaj z vanje vgrajenimi fragmenti DNA;
3. celični kloni se izberejo v obliki kolonij na posebnih hranilnih medijih (ali virusi - v obliki čistilnih con - plakov na sloju kontinuirane rasti bakterijskih celic ali živalskih tkivnih kultur), ki vsebujejo zahtevane vrste molekul recDNA, in jih podvržejo na celovite strukturne in funkcionalne študije.

Za lažjo izbiro celic, v katerih je prisotna recDNA, se uporabljajo vektorji, ki vsebujejo enega ali več markerjev. V plazmidih lahko na primer geni za odpornost na antibiotike služijo kot taki markerji (celice, ki vsebujejo recDNA, so izbrane na podlagi njihove sposobnosti rasti v prisotnosti določenega antibiotika). RecDNA, ki nosi želene gene, se izbere in vnese v prejemne celice. Od tega trenutka se začne molekularno kloniranje - pridobivanje kopij recDNA in s tem kopij ciljnih genov v njeni sestavi. Le če je mogoče ločiti vse transfektirane ali okužene celice, bo vsak klon predstavljen z ločeno kolonijo celic in bo vseboval specifično celico. recDNA. Vklopljeno končna faza izvede se identifikacija (iskanje) klonov, ki vsebuje želeni gen. Temelji na dejstvu, da vstavitev v recDNA določa neko edinstveno lastnost celice, ki jo vsebuje (na primer ekspresijski produkt vstavljenega gena). Pri poskusih molekularnega kloniranja upoštevamo 2 osnovni načeli:

• nobena celica, kjer pride do kloniranja recDNA, ne sme prejeti več kot ene plazmidne molekule ali virusnega delca;
• slednji mora biti sposoben replikacije.

Kot vektorske molekule v G.I. uporablja se širok spekter plazmidne in virusne DNA. Najbolj priljubljeni vektorji za kloniranje vsebujejo več genetskih genov. označevalci in imajo isto mesto delovanja za različne restrikcijske encime. To zahtevo na primer najbolje izpolnjuje plazmid pBR322, ki je bil zgrajen iz prvotno naravno prisotnega plazmida z uporabo metod, ki se uporabljajo pri delu z recDNA; vsebuje gene za odpornost na ampicilin in tetraciklin ter vsebuje eno prepoznavno mesto za 19 različnih restrikcijskih encimov. Poseben primer klonirnih vektorjev so ekspresijski vektorji, ki poleg pomnoževanja zagotavljajo pravilno in učinkovito izražanje tujih genov v prejemnih celicah. V nekaterih primerih lahko molekularni vektorji zagotovijo integracijo tuje DNK v genom celice ali virusa (imenujemo jih integrativni vektorji).

Ena najpomembnejših nalog G.I. - ustvarjanje sevov bakterij ali kvasovk, celičnih linij živalskih ali rastlinskih tkiv, pa tudi transgenih rastlin in živali (glej Transgenski organizmi), ki bi zagotovili učinkovito izražanje v njih kloniranih genov. Visoka stopnja proizvodnje beljakovin je dosežena, ko so geni klonirani v večkopijske vektorje, ker v tem primeru bo ciljni gen v celici prisoten v velikih količinah. Pomembno je, da je kodirno zaporedje DNA pod nadzorom promotorja, ki ga celična RNA polimeraza učinkovito prepozna, in da je nastala mRNA razmeroma stabilna in se učinkovito prevaja. Poleg tega tuje beljakovine, sintetizirane v prejemnih celicah, ne smejo biti predmet hitre razgradnje znotrajceličnih proteaz. Pri ustvarjanju transgenih živali in rastlin pogosto dosežemo tkivno specifično izražanje vnesenih ciljnih genov.

Od genetske koda je univerzalna; možnost izražanja gena je določena le s prisotnostjo v njegovi sestavi signalov za začetek in prekinitev transkripcije in translacije, ki jih gostiteljska celica pravilno prepozna. Ker Večina genov višjih evkariontov ima diskontinuirano strukturo ekson-intron, zaradi transkripcije takšnih genov nastane prekurzorska messenger RNA (pre-mRNA), iz katere se med kasnejšim spajanjem tvorijo nekodirajoče sekvence - introni; se odcepi in nastane zrela mRNA. Takšni geni se ne morejo izražati v bakterijskih celicah, kjer ni sistema za spajanje. Da bi premagali to oviro, se na zrelih molekulah mRNA s pomočjo reverzne transkriptaze sintetizira kopija DNA (cDNA), ki se ji s pomočjo DNA polimeraze doda druga veriga. Takšne fragmente DNA, ki ustrezajo zaporedju kodiranja gena (ki niso več ločeni z introni), je mogoče vstaviti v ustrezen molekularni vektor.

Če poznamo aminokislinsko zaporedje ciljnega polipeptida, je mogoče sintetizirati nukleotidno zaporedje, ki ga kodira, in tako pridobiti tako imenovani. enakovreden gen in ga vstavite v ustrezen ekspresijski vektor. Pri ustvarjanju enakovrednega gena se običajno upošteva lastnost genetske degeneracije. kodo (20 aminokislin je kodiranih z 61 kodoni) in pogostost pojavljanja kodonov za vsako aminokislino v tistih celicah, v katere je načrtovana uvedba tega gena, ker Sestava kodonov se lahko med različnimi organizmi zelo razlikuje. Pravilno izbrani kodoni lahko bistveno povečajo proizvodnjo ciljnega proteina v prejemni celici.

Pomen genskega inženiringa

G.I. bistveno razširil eksperimentalne meje, saj je omogočil uvedbo v razgradnjo. celice tipizirajo tujo DNK in preučujejo njene funkcije. To je omogočilo identifikacijo splošnih bioloških vzorcev organizacije in izražanja genetskih. informacije v različnih organizmi. Ta pristop je odprl možnosti za ustvarjanje popolnoma novih mikrobioloških proizvajalci biološko aktivnih snovi. kot tudi živali in rastline, ki nosijo funkcionalno aktivne tuje gene. Mn. prej biološko nedostopna aktivne beljakovine oseba, vklj. interferoni, interlevkini, peptidni hormoni, krvni faktorji so začeli nastajati v velikih količinah v celicah bakterij, kvasovk ali sesalcev in so se pogosto uporabljali v medicini. Poleg tega je postalo mogoče umetno ustvariti gene, ki kodirajo himerne polipeptide, ki imajo lastnosti dveh ali več naravnih proteinov. Vse to je dalo močan zagon razvoju biotehnologije.

Glavni cilji G.I. so bakterije Escherichia coli (Escherichia coli) in Bacillus subtilis (bacilno seno), pekovski kvas Saccharomices cerevisiae, razkroj. celične linije sesalcev. Obseg predmetov vpliva genskega inženiringa se nenehno širi. Intenzivno se razvijajo raziskovalna področja ustvarjanja transgenih rastlin in živali. Z uporabo metod G.I Ustvarjajo se najnovejše generacije cepiv proti različnim povzročiteljem okužb (prvo je bilo ustvarjeno na osnovi kvasovk, ki proizvajajo površinske beljakovine virusa človeškega hepatitisa B). Veliko pozornosti namenjamo razvoju klonirnih vektorjev na osnovi virusov sesalcev in njihovi uporabi za ustvarjanje živih polivalentnih cepiv za veterinarske in medicinske potrebe ter molekularnih vektorjev za gensko terapijo rakavih tumorjev in dednih bolezni. Razvita je metoda neposrednega vnosa recDNA v telo ljudi in živali, ki usmerja nastajanje različnih antigenov v njihovih celicah. povzročitelji infekcij (DNK cepljenje). Najnovejša smer G.I. je ustvarjanje užitnih cepiv na osnovi transgenih rastlin, kot so paradižnik, korenje, krompir, koruza, solata itd., ki proizvajajo imunogene proteine ​​povzročiteljev okužb.

Pomisleki, povezani s poskusi genskega inženiringa

Kmalu po prvih uspešnih poskusih pridobivanja recDNA je skupina znanstvenikov pod vodstvom P. Berga predlagala omejitev izvajanja številnih poskusov genskega inženiringa. Ti pomisleki so temeljili na dejstvu, da lastnosti organizmov vsebujejo tujo genetiko. informacije je težko predvideti. Lahko pridobijo neželene lastnosti in motijo ​​okolje. ravnovesja, vodijo v nastanek in širjenje nenavadnih bolezni pri ljudeh, živalih in rastlinah. Poleg tega je bilo ugotovljeno, da človeški poseg v genetsko naprava živih organizmov je nemoralna in lahko povzroči neželene družbene in etične posledice. Leta 1975 so o teh problemih razpravljali na mednarodni konferenci. konferenci v Asilomarju (ZDA). Njegovi udeleženci so prišli do zaključka, da je treba nadaljevati z uporabo metod G.I. vendar ob obveznem upoštevanju definicije. pravila in priporočila. Kasneje so ta pravila, ki so bila uveljavljena v številnih državah, bistveno omilili in zmanjšali na običajne metode v mikrobiologiji. raziskovanje, ustvarjanje posebnih zaščitne naprave, ki preprečujejo širjenje bioloških dejavnikov. povzročiteljev v okolju, uporaba varnih vektorjev in prejemnih celic, ki se v naravnih razmerah ne razmnožujejo.

Pogosto pod G.i. razumeti samo delo z recDNA, in kot sopomenke za G.I. Uporabljajo se izrazi "molekularno kloniranje", "kloniranje DNK", "kloniranje genov". Vendar pa vsi ti koncepti odražajo vsebino le posameznih operacij genskega inženiringa in zato niso enakovredni izrazu G.I. V Rusiji kot sinonim za G.I. Izraz "genski inženiring" se pogosto uporablja. Vendar pa je pomenska vsebina teh izrazov drugačna: G.i. želi ustvariti organizme z novo genetiko. program, medtem ko izraz "genski inženiring" pojasnjuje, kako se to izvaja, tj. z gensko manipulacijo.

Literatura

Ščelkunov S.N. Kloniranje genov. Novosibirsk, 1986; Watson J., Ace J.,Kurtz D. Rekombinantna DNA: Kratek tečaj. M., 1986; kloniranje DNK. Metode M., 1988; Novo v kloniranju DNK: Metode M., 1989. Ščelkunov S.N. Genski inženiring. 2. izd., Novosibirsk, 2004.