Tema: Actividad catalítica de enzimas en células vivas.

Objetivo: identificar función catalítica proteínas en células vivas, desarrollar conocimientos sobre el papel de las enzimas en las células, consolidar la capacidad de trabajar con un microscopio, realizar experimentos y explicar los resultados del trabajo. Equipo: patatas crudas y hervidas, hoja de elodea (otra planta), solución fresca de peróxido de hidrógeno al 3%, tubos de ensayo, pinzas, arena, mortero, libreta, bolígrafo, lápiz, regla.

Progreso:

Prepara dos tubos de ensayo y coloca un poco de arena en el primero, un trozo de patata cruda en el segundo y un trozo de patata hervida en el tercero. Echa un poco de agua oxigenada en cada tubo de ensayo. Observa lo que sucede en cada tubo de ensayo.

Moler un trozo de patata cruda en un mortero con una pequeña cantidad arena.

Transfiera las patatas trituradas junto con la arena a un tubo de ensayo y agregue un poco de peróxido de hidrógeno.

Compare la actividad del tejido vegetal triturado y entero.

Haga una tabla que muestre la actividad de cada tejido bajo diferentes tratamientos. Explique sus resultados. Responde a las preguntas:

Observaciones

Peróxido de hidrógeno y patatas crudas.

Se libera oxígeno, la proteína se descompone en estructura primaria y se convierte en espuma

Peróxido de hidrógeno y patatas hervidas.

Sin reacción

Responde las preguntas: ¿En qué tubos de ensayo apareció la actividad de la enzima catalasa? Explicar por qué.

La catalasa es una enzima que cataliza la reacción de descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno molecular: H2O2 + H2O2 = O2 + 2H2O. papel biológico K. consiste en la degradación del peróxido de hidrógeno formado en las células como resultado de la acción de varias flavoproteínas oxidasas (xantina oxidasa, glucosa oxidasa, monoaminooxidasa, etc.) y proporcionando una protección eficaz de las estructuras celulares contra la destrucción bajo la influencia de peróxido de hidrógeno. La deficiencia de K. determinada genéticamente es una de las causas de la llamada acatalasia, una enfermedad hereditaria que se manifiesta clínicamente por ulceración de la mucosa nasal y cavidad oral, a veces cambios atróficos pronunciados en los tabiques alveolares y pérdida de dientes. La actividad se manifestó en 1,3 tubos de ensayo, porque contenían alimentos crudos que contenían proteínas. Y en los tubos de ensayo restantes había productos con proteínas destruidas durante el proceso de cocción y la reacción no apareció. Por tanto, el cuerpo absorbe mejor los alimentos que contienen proteínas.

¿Cómo se manifiesta la actividad enzimática en los tejidos vivos y muertos? Explica el fenómeno observado. No hay actividad enzimática en los tejidos muertos, porque la proteína que contenían se destruyó durante la cocción. Y en los tejidos vivos, al interactuar con el peróxido de hidrógeno, se liberaba oxígeno y la proteína, al descomponerse hasta su estructura primaria, se convertía en espuma.

¿Cómo afecta la trituración de tejidos la actividad enzimática en los tejidos vivos de plantas y animales? Al triturar tejido vivo, la reacción es más rápida, porque aumenta el área de contacto entre la proteína y el peróxido de hidrógeno. ¿Cómo propondrías medir la velocidad de descomposición del peróxido de hidrógeno? v=kc(a)c(b) donde v es la velocidad de la reacción química k es la constante de velocidad c es el cambio de concentración ¿Crees que todos los organismos vivos contienen la enzima catalasa, que asegura la descomposición del peróxido de hidrógeno?

Justifica tu respuesta. Dado que se trata de una enzima de la clase de las oxidorreductasas, cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno, que es tóxico para las células vivas, en agua y oxígeno. Contenido en lisosomas. Podemos concluir que está contenido en todas las células de los organismos vivos. Explique sus observaciones. Expresa tu conclusión.

Conclusión: la proteína está contenida sólo en los alimentos vivos, y en los alimentos cocidos la proteína se destruye, por lo que no se produce ninguna reacción con ellos. Si muele los productos, la reacción será más rápida.

Determinación de la actividad catalasa.

(según A.N. Bach y A.I. Oparin)

Las oxidorreductasas son una clase de enzimas que catalizan reacciones redox. La oxidación de monómeros formados durante el catabolismo de polímeros es un proceso complejo de varias etapas.

La oxidación de sustancias en las células se produce principalmente mediante la eliminación de hidrógeno (deshidrogenación) o la eliminación de electrones o mediante la adición de oxígeno a la molécula del compuesto oxidado.

Los aceptores de hidrógeno en las deshidrogenasas son NAD +, NADP, FAD y FMN, en algunas flavinas, oxígeno (se llaman oxidasas), en las que contienen hemo (peroxidasas y catalasas), H 2 O 2 (peróxido de hidrógeno).

Los aceptores y transportadores de electrones son citocromos (hemoproteínas) que contienen hemo.

La catalasa (EC 1.11.1.6) pertenece a las hemoproteínas, cataliza el proceso de destrucción del peróxido de hidrógeno, que es tóxico para las células, en agua y oxígeno: 2 H 2 O 2 = 2 H 2 O + O 2.

Para una célula viva, el peróxido de hidrógeno es un veneno fuerte, por lo que todas las enzimas que forman y neutralizan el H 2 O 2 se encuentran en los peroxisomas, orgánulos cubiertos de membrana. Los principales consumidores de H 2 O 2 son las peroxidasas (EC 1.11.1.7.), que oxidan fenoles, aminas, algunos compuestos heterocíclicos y otros sustratos por deshidrogenación, transfieren los eliminados de los sustratos a H 2 O 2, reduciéndolo a 2 H 2 O. Las moléculas de peróxido de hidrógeno, no reclamadas por las peroxidasas, son neutralizadas por la catalasa.

El método para determinar la actividad catalasa se basa en determinar la cantidad de peróxido de hidrógeno que se descompone durante la incubación con la enzima. La cantidad de H 2 O 2 en la mezcla de reacción se determina mediante valoración en medio ácido con una solución con una concentración de permanganato de potasio de 0,02 mol/l:

5 H 2 O 2 + 2KMnO 4 + 3H 2 SO 4 = 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + 5O 2 +8H 2 O

Basándose en la ecuación de reacción anterior, se puede calcular que 1 ml de una solución con una concentración de permanganato de potasio de 0,02 mol/l corresponde a 1,7 mg (50 µmol) de peróxido de hidrógeno.

PROGRESO. Se muelen bien 2-3 g de patatas crudas (u otro material vegetal fresco) en un mortero con arena de cuarzo o vidrio. Para disminuir reacción ácida agregue CaCO 3 en la punta del bisturí hasta que se detenga la liberación de burbujas de CO 2. Durante el proceso de trituración, añadir al mortero 40-50 ml de agua en pequeñas porciones. La masa molida se transfiere cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml, se ajusta con agua hasta la marca y se mezcla. La mezcla se deja reposar durante 10-15 minutos y después de agitar se filtra.

Tome dos matraces cónicos con una capacidad de 150-200 ml y agregue en ellos 20 ml del filtrado resultante. El contenido de un matraz se hierve durante 1 min y se enfría a temperatura ambiente (control). Otro matraz experimental contiene una enzima activa. Añadir 20 ml de agua y 3 ml de solución al contenido de los matraces de prueba y control. fracción de masa H2O2 1%. El contenido se mezcla bien y se deja a temperatura ambiente durante 30 minutos. Al final de la incubación, se añaden a ambos matraces 5 ml de una solución con una fracción masiva de ácido sulfúrico del 10%, se mezclan y el exceso de H 2 O 2 en cada matraz se titula con una solución con una concentración de permanganato de potasio de 0,02. mol/l hasta que se forme un color rosa que no desaparece en 1 min.

La actividad catalasa se expresa en µmol de peróxido de hidrógeno descompuesto por la enzima por 1 g del material de prueba (o por 1 mg de extracto del mismo) por 1 min. El cálculo se realiza según la fórmula:

Dónde X– actividad catalasa, E/g;

(a-b)– la diferencia entre los volúmenes de una solución con una concentración de permanganato de potasio de 0,02 mol/l, utilizada para la valoración del control (A) y experimentado (b) muestras, ml;

t– título de la solución de permanganato de potasio utilizada para la titulación;

50 – factor de conversión por µmol H 2 O 2;

100 – volumen total de extracto preparado;

m – masa de material tomado para análisis, g;

20 – volumen de filtrado tomado para análisis, ml;

30 – tiempo de incubación, min.

Se registran el principio de determinación, el procedimiento de análisis y el resultado del análisis.

La actividad catalasa también se puede determinar por el volumen de oxígeno liberado después de agregar H 2 O 2 al objeto de prueba.

Este principio se utiliza para determinar la actividad de la catalasa en la leche, expresada por el número de catalasa, que es el volumen de oxígeno (ml) liberado en 2 horas a 25 ° C a partir de 5 mg de una solución con una fracción de masa de H 2 O. 2 1% añadido a 15 ml de leche. La leche obtenida de animales sanos libera entre 0,7 y 2,5 ml de oxígeno, es decir. El número de catalasa de la leche natural no supera el 2,5. La leche obtenida de animales enfermos (mastitis, etc.) y el calostro tienen un número de catalasas aumentado, llegando hasta 15.

REACTIVOS. Agua destilada; carbonato de calcio (en polvo); solución con una concentración de permanganato de potasio de 0,02 mol/l; Soluciones con fracciones de masa: peróxido de hidrógeno al 1% (10 ml de solución con una fracción de masa de H 2 O 2 al 30% diluida con agua hasta 300 ml), ácido sulfúrico al 10%.

PREGUNTAS DE CONTROL.

1. Las principales vías de oxidación de sustratos en la célula.

2. Características de la estructura y acción de las deshidrogenasas dependientes de NAD+ - y NADP.

3. Características de la estructura y acción de las deshidrogenasas dependientes de FAD.

4. ¿Qué enzimas se llaman oxidasas? Sus cofactores.

5. Características de la estructura y acción de peroxidasas y catalasas.

6. Características de la estructura y acción de los citocromos.

7. Química, formación y formas de neutralizar el peróxido de hidrógeno en las células.

8. Método para determinar la actividad catalasa.

Las enzimas son catalizadores proteicos de reacciones bioquímicas, La mayoría de que en ausencia de la enzima procedería extremadamente lentamente. A diferencia de catalizadores químicos cada enzima es capaz de catalizar sólo un número muy pequeño de reacciones, a menudo sólo una.

Por tanto, las enzimas son catalizadores específicos de reacciones. Casi toda la biografía reacciones químicas catalizada por enzimas.

Muchas enzimas tienen acción catalítica sobre sustratos solo en presencia de un compuesto orgánico termoestable de bajo peso molecular específico: una coenzima.

En tales casos, la holoenzima (catalíticamente complejo activo) consta de una apoenzima (parte proteica) y una coenzima asociada (Apéndice H). Una coenzima puede unirse a una apoenzima mediante enlaces covalentes y no covalentes. El término "grupo protésico" se refiere a una coenzima unida covalentemente. Las reacciones que requieren la presencia de una coenzima incluyen: reacciones redox, transferencia de grupos, isomerización y condensación (según el sistema IUB, estas son clases 1, 2, 5, 6). Las reacciones de escisión ocurren en ausencia de coenzimas (según el sistema IUB, estas son clases 3 y 4).

^ 4.1 Trabajo de laboratorio “Determinación de la actividad de amilasa
malta según el método Wolgemut"

El método de Wolgemut se basa en determinar la cantidad mínima de enzima capaz de hidrolizar completamente 1 ml de solución de almidón al 0,1% en determinadas condiciones. La actividad amilasa de la malta se expresa en mililitros de una solución de almidón al 0,1%, que puede hidrolizarse con 1 ml de extracto de malta a una temperatura de 38 °C durante 30 minutos. La actividad normal de amilasa está entre 160 y 320 unidades de actividad.

El método Wohlgemuth se utiliza ampliamente en la práctica clínica para determinar la actividad de amilasa en sangre y orina, y en la elaboración de cerveza para determinar la actividad de amilasa de la malta. En la pancreatitis aguda y los tumores pancreáticos se observa un fuerte aumento de la actividad de la amilasa en la sangre y la orina (10 a 30 veces).

^ Materiales y reactivos: extracto de malta de grano, diluido 10 veces; Solución de almidón al 0,1%; Solución de yodo al 0,1% en solución de yoduro de potasio al 0,2%.

Equipo: soporte con tubos de ensayo, pipetas, goteros, termostato.

^ Avance del trabajo. Se vierte 1 ml de agua destilada en diez tubos de ensayo. Se agrega 1 ml del extracto diluido 10 veces al primer tubo de ensayo, se mezcla, se transfiere 1 ml de la mezcla al segundo tubo de ensayo. Se vuelve a mezclar el contenido de este tubo de ensayo y se transfiere 1 ml al tercer tubo de ensayo y así sucesivamente hasta el décimo tubo de ensayo. Se toma 1 ml del último tubo de ensayo y se vierte. Así, en cada tubo de ensayo posterior el contenido de enzima es dos veces menor que en el anterior. La dilución del extracto en diez tubos de ensayo será: 1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160; 1:320; 1:640; 1:1280; 1:2560; 1:5120; 1:10240.

A continuación, agregue 1 ml de agua y 2 ml de solución de almidón a todos los tubos, mezcle y coloque en un termostato a una temperatura 38ºC durante 30 min. Después de la incubación, enfriar los tubos con agua del grifo para detener la acción de la enzima, agregar dos gotas de solución de yodo, agitar bien y observar el cambio de color. Al reaccionar con el yodo, el líquido se vuelve amarillo, rosa y violeta.

Habiendo observado en qué dilución se produjo la hidrólisis completa del almidón con un contenido mínimo de enzimas (un tubo de ensayo con un color amarillento del contenido), la actividad de amilasa del extracto se calcula a partir de la cantidad de extracto sin diluir (A) en este tubo de ensayo.
(Un ml de extracto descompone X ml de solución de almidón al 0,1%).

Por ejemplo, amarillo Apareció en el cuarto tubo de ensayo, donde el extracto se diluyó 160 veces. Esta cantidad de extracto es capaz de hidrolizar 2 ml de una solución de almidón al 0,1%, y 1 ml de extracto sin diluir en las mismas condiciones hidroliza 320 ml: X = 2 × 160/1. Por tanto, la actividad de amilasa es 320.

^ 4.2 Trabajo de laboratorio “Determinación de la actividad catalasa

según Bach"

El método se basa en determinar la cantidad de peróxido de hidrógeno que queda después de la acción de la catalasa titulando una solución de KMnO 4. La reacción se desarrolla según la ecuación.

1 ml de solución de permanganato potásico 0,1 mol/l corresponde a 85 mg de peróxido de hidrógeno.

^ Materiales y reactivos: preparación de catalasa (se muele 1 g de brotes de malta de cebada en un mortero de porcelana con 6 ml de tampón fosfato y se filtra); Solución al 10% de H 2 SO 4; solución de peróxido de hidrógeno al 0,1 % en tampón fosfato, pH = 7,0 (35,0 ml de NaH 2 PO 4 0,2 mol/l en 13,6 ml de NaH 2 PO 4 0,2 mol/l); Solución de KMnO 4 0,1 mol/l.

Equipo: Matraces de 100 ml, pipetas, buretas, termostato.

^ Avance del trabajo. Añadir 2 ml de preparación de catalasa a dos matraces, añadir 1 ml de una solución de H2SO4 al 10% a uno de ellos (muestra), luego verter 2 ml de solución de peróxido de hidrógeno en cada matraz, colocar en un termostato durante 40 minutos a 38 °C. . Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se añade al segundo matraz (control) 1 ml de una solución de H 2 SO 4 al 10 % y se titulan ambas soluciones con una solución de KMnO 4 0,1 mol/L hasta que aparezca un color rosa persistente por el exceso de potasio. permanganato.

La actividad catalasa se determina por la cantidad de peróxido de hidrógeno descompuesto (ml) y se calcula mediante la fórmula:

,

Dónde
– diferencia en los resultados de la titulación de las muestras de control y de prueba con solución de KMnO 4 0,001 N, ml;

Q – cantidad de peróxido de hidrógeno (85 mg), correspondiente
1 ml de solución de KMnO 4 0,1 mol/l.

^ 4.3 Trabajo de laboratorio “Método de goteo
(según Klimovsky y Rodzevich)"

La actividad amilolítica, debida principalmente a la presencia de α-amilasa en la preparación, caracteriza la capacidad de la enzima para catalizar la hidrólisis del almidón en productos que no se tiñen con yodo. Si la preparación contiene α-amilasa y glucoamilasa, este método determina el efecto total de todas las enzimas amilolíticas.

En este método, se considera unidad de actividad amilolítica la cantidad de enzima que cataliza la descomposición de 1 g de almidón soluble en productos no teñidos con yodo en 1 hora a una temperatura de 30 ºC en condiciones estrictamente definidas. La actividad amilolítica de AS se expresa por el número de unidades indicadas por 1 g de fármaco, cultivo o 1 cm 3 de solución. El valor AC muestra cuántos gramos de almidón se pueden hidrolizar a compuestos sin yodo mediante 1 g de fármaco, cultivo o 1 cm 3 de solución en 1 hora en condiciones de determinación. La finalización de la reacción se controla visualmente mediante una prueba de yodo.

La sensibilidad del método se determina. cantidad minima Tiempo durante el cual se puede detectar visualmente un cambio en el color del yodo. Se supone que la velocidad reacción enzimática es directamente proporcional a la cantidad de enzima utilizada y permanece constante durante 5 minutos a 1 hora, es decir, la reacción obedece a la ley de reacción de orden cero. Además, la influencia del valor del pH y naturaleza química buffer por la cantidad de AC. Con un tampón de acetato (pH=4,7), el valor de CA en preparaciones de hongos es en promedio 1,5 veces mayor que cuando se determina con un tampón de fosfato (pH=6,0). Por lo tanto, al determinar el valor de CA de cultivos de hongos, se recomienda utilizar un tampón de acetato.

La desventaja del método es la vaguedad. definición visual final de la reacción.

^ Materiales y reactivos: tampón acetato con pH=4,7 para enzimas de origen fúngico; tampón fosfato con pH=6,0 para enzimas de origen bacteriano; solución de almidón al 1% (la solución de almidón utilizada para el análisis de preparaciones de hongos debe tener un pH = 4,7, para el análisis de preparaciones bacterianas - 6,0); soluciones de yodo. Para preparar una solución básica de yodo, se pesan 4,4 g de yoduro de potasio, 1,4 g de yodo metálico en un vaso tarado con tapa esmerilada y se añaden unos 2 cm 3 de agua destilada. El vaso se cierra con una tapa, se mezcla el contenido y una vez disuelto el yodo, se transfiere la solución a un matraz aforado de 100 cm 3 con tapón esmerilado. Llene el volumen con agua destilada hasta la marca. El contenido del matraz se almacena en un lugar fresco y oscuro. La solución básica de yodo se puede utilizar dentro de los 30 días siguientes a la fecha de su preparación. Se prepara una solución de trabajo de yodo a partir de la solución principal. Para ello, se vierten 20 cm 3 de una solución básica de yodo en un matraz aforado con una capacidad de 100 cm 3, se añaden 4,4 g de yoduro de potasio y se ajusta el volumen total de la solución a 100 cm 3. La solución de trabajo de yodo se puede consumir dentro de los seis días posteriores a su preparación.

Equipo: tubos de ensayo anchos, varillas de vidrio, pipetas, vasos de precipitados de 50 ml, placas de Petri, termostato.

^ Avance del trabajo. Para determinar el valor de CA, es importante observar estrictamente las condiciones de reacción. Para hacer esto, todas las soluciones: sustrato (solución de almidón al 1%), solución enzimática y agua destilada deben calentarse primero a una temperatura de 30 ° C.

Se coloca el sustrato en una cantidad de 25 cm 3 (12,5 ml) en un tubo de ensayo ancho en el que se inserta una varilla de vidrio. Se vierten 30 cm 3 (15 ml) de extracto y 30 cm 3 (15 ml) de agua en tubos de ensayo separados, se colocan en un termostato y se mantienen a una temperatura de 30 ºС durante
10 minutos.

Luego, utilizando pipetas, agregue de 1 a 25 cm 3 de la solución enzimática original y la cantidad correspondiente de agua a la solución de almidón en un tubo de ensayo ancho, sin sacar los tubos del termostato, de modo que el volumen total de la reacción. la mezcla es de 50 cm 3 . Si el extracto enzimático está inactivo, puede agregar solo 25 cm 3 y no agregar agua en absoluto.

El contenido del tubo de ensayo se mezcla con una varilla y se anota con un cronómetro el tiempo en que se añadió el extracto a la solución de almidón. Cada 60 segundos se toma una gota de muestra del tubo de ensayo sin sacarlo del termostato. Se coloca una gota sobre un plato de porcelana blanca, esta gota se combina con una gota de solución de trabajo de yodo y se observa el color. La reacción de descomposición del almidón se considera completa cuando el yodo ya no produce un cambio de color cuando se combina con una gota de la solución de prueba dentro de los primeros 10 segundos. El cambio de color es claramente visible en el borde de contacto entre dos gotas: yodo y la mezcla de reacción.

El tiempo que tarda el almidón en descomponerse en productos que no estén teñidos con yodo debe estar en el rango de 10 a
20 minutos.

Si el tiempo de hidrólisis es inferior a 10 minutos, se repite la determinación, utilizando menos extracto para la hidrólisis y mas agua. Si la hidrólisis no se completa en 20 minutos, el análisis también se repite, tomando más extracto enzimático y menos agua para la determinación. La cantidad de extracto enzimático que se debe tomar para un nuevo análisis se calcula teniendo en cuenta el tiempo de hidrólisis obtenido.

Si el extracto enzimático tiene poco o demasiado alta actividad, y la cantidad de solución enzimática de 1 a 25 cm 3 no garantiza la duración de la hidrólisis del almidón durante 10...20 minutos, luego para el análisis no toman 25 cm 3 de solución de almidón, sino una cantidad mayor o menor, para ejemplo, 10 o 40 cm 3, añadiendo la modificación correspondiente a fórmula de cálculo(0,1 o 0,4, respectivamente, en lugar del habitual 0,25).

El valor de la actividad amilolítica del AS (unidades/g) se calcula mediante la fórmula:

Donde 0,25 es la cantidad de almidón que hay en 25 cm 3 de una solución al 1%, g;

60 – factor de conversión durante 1 hora;

N es la cantidad de enzima que participa en la reacción, g o cm 3 (este valor se determina teniendo en cuenta la concentración del extracto inicial y la dilución posterior);

T – tiempo durante el cual el almidón se descompone en productos no teñidos con yodo, min.

Ejemplo. Para su análisis se tomó un extracto enzimático de un cultivo aéreo del hongo. La solución madre se preparó a razón de 5 g de cultivo en 100 cm 3 de agua tamponada. Se sabe que esta cultura es muy activo, por lo que se hizo una dilución adicional de la solución original: se llevaron 20 cm 3 en un matraz aforado a 50 cm 3 con agua destilada y de allí se tomaron 2 cm 3 para análisis, es decir. Se obtuvo la siguiente secuencia de dilución:

5 gramos → 100 cm 3 → 20 cm 3 → 50 cm 3 → 2 cm 3.

Se necesitaron 12 minutos para hidrolizar 0,25 de almidón (25 cm 3 de una solución de almidón al 1%) con la solución enzimática de la última dilución (2 cm 3). Entonces la CA del cultivo secado al aire (unidades/g) será:

Al recalcular la actividad enzimática, no se debe tener en cuenta la sustancia absolutamente seca de la preparación enzimática, sino la humedad. El cálculo debe realizarse mediante la fórmula:

,

Donde W es el contenido de humedad del cultivo o preparación.

^ 4.4 Trabajo de laboratorio “Método Willstetter
y definición de Waldschmidt-Leitz de proteolítico
actividad enzimática en modificación"

El método se basa en la determinación de grupos carboxilo libres en soluciones alcohólicas de aminoácidos y polipéptidos.

La actividad (PA) se expresa por la cantidad de miligramos de nitrógeno amínico que se forma durante la hidrólisis de una cierta cantidad de solución de gelatina al 5% con un valor de pH de 7,3 a 7,5 1 g del fármaco o 1 cm 3 de solución enzimática en 1 hora a una temperatura de 40 ºC.

Se considera unidad de actividad proteolítica la cantidad de enzima que produce 1 mg de nitrógeno amínico en 1 hora en las condiciones experimentales aceptadas.

^ Materiales y reactivos: 96% de alcohol etílico; Solución al 1% de timolftaleína; solución de NaOH 0,1 N; sustrato – solución de gelatina al 5%; extracto de la planta analizada.

Preparación de un extracto para determinar la actividad proteolítica: se coloca una muestra de 0,25 g de material vegetal en un mortero de porcelana y se muele durante 2,5 minutos con 2,5 ml de tampón fosfato (pH = 7,3), luego se filtra la masa.

Preparación de una solución de gelatina al 5% (sustrato): Se remojan previamente 5 g de gelatina en un vaso de vidrio en 15...20 cm 3 de agua destilada durante 20...30 minutos. La proteína hinchada se vierte en 20...25 cm 3 de una solución tampón a una temperatura de 70 a 80 ° C y se mezcla bien con una varilla de vidrio. La parte disuelta se vierte en un matraz aforado de 100 cm 3, se añaden otros 20...25 cm 3 de solución tampón a la parte no disuelta y la solución resultante se transfiere nuevamente al mismo matraz. Una solución de gelatina enfriada a 40 °C se lleva hasta la marca con una solución tampón de la misma temperatura. La solución de gelatina preparada se guarda en el frigorífico a temperatura de 2 a 5 °C y se utiliza para el análisis durante dos días. Antes del análisis, la solución de gelatina se calienta a una temperatura de 40 °C en un baño de agua.

Equipo: matraces cónicos de 200 a 250 ml de volumen, matraces aforados de 50 ml de volumen, varillas de vidrio, pipetas, buretas, termostato.

^ Avance del trabajo. A 10 cm 3 de una solución de gelatina al 5% con un valor de pH de 7,3 a 7,5, agregue 2 cm 3 de la solución enzimática problema e inmediatamente transfiera 1 cm 3 de la mezcla de reacción a un matraz cónico con una capacidad de 50 a 100 cm 3, donde verter 20 cm 3 96% alcohol etílico y 0,2 cm3 1% de timolftaleína. La muestra se titula con solución de NaOH 0,1 N hasta que aparece un color azul.

La mezcla de gelatina restante con la solución enzimática se coloca en un termostato con una temperatura de 40 ºC para su hidrólisis. Después de 3 horas, se introduce 1 cm 3 de la mezcla de reacción en un segundo matraz con una capacidad de 50 a 100 cm 3, en el que primero se vierten 20 cm 3 de alcohol etílico al 96 % y 0,2 cm 3 de timolftaleína al 1 %. La muestra se titula como en el caso de la variante de control.

El cálculo de la actividad proteolítica del PS se realiza mediante la fórmula:

,

Donde A es la cantidad de nitrógeno amínico acumulado durante el experimento del medio de reacción, ml;

T – duración de la proteólisis, h;

P es un coeficiente que tiene en cuenta la dilución y la conversión a 1 g de fármaco o 1 cm 3 de solución enzimática líquida.

El valor A se calcula mediante la fórmula:

,

Donde a es la cantidad de solución de NaOH 0,1 N utilizada para la titulación de 1 cm 3 de la muestra experimental, cm 3;

Y a – lo mismo para la muestra de control;

1,4 – factor de conversión de la cantidad de solución alcalina 0,1 N en miligramos de nitrógeno de aminoácidos y polipéptidos;

K – corrección del título de álcali.

Trabajo de laboratorio No. 1

PAPEL DE LAS ENZIMAS EN LA ACELERACIÓN DE REACCIONES EN LA CÉLULA

(DETECCIÓN DE ACTIVIDAD CATALASA)

Objetivo: detectar la acción de la enzima catalasa en células vegetales y animales, comparar la actividad enzimática de células naturales y dañadas por ebullición.

Equipo: Solución de peróxido de hidrógeno al 3%, trozos de patatas y carne crudas y hervidas (hígado, pulmones), tubos de ensayo.

Detección de actividad catalasa.

La catalasa es una enzima que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno para formar oxígeno molecular, liberado en forma de burbujas de gas:

catalasa

2H2O2 _ → 2H2O + O2

El peróxido de hidrógeno se produce en algunas células vegetales y animales como subproducto de reacciones redox. Este compuesto es tóxico para las células y la catalasa asegura su eliminación eficaz. La catalasa es una de las enzimas que trabaja más rápido: una molécula de catalasa descompone hasta 200.000 moléculas de peróxido de hidrógeno en un segundo. La catalasa se localiza en las vesículas de membrana de las células: microcuerpos y peroxisomas.

Progreso

Tome 4 tubos de ensayo limpios y coloque en el primero de ellos una pequeña cantidad de patatas finamente ralladas, en el segundo, unas patatas hervidas, en el tercero, trozos de carne finamente picados (hígado, pulmón), en el cuarto, un poco picados. carne hervida. Agregue 3-4 ml a cada tubo de ensayo. Solución de peróxido de hidrógeno al 3%. Observa lo que sucede en los tubos de ensayo. Registre los resultados de la observación en la tabla.

Actividad enzimática de células naturales y dañadas.

Explique sus resultados. Sacar una conclusión sobre la actividad catalítica de la catalasa en células vivas y muertas.

Conclusión: ________

_______________

_______________

_____________

Preguntas de control:

1. ¿Qué son las enzimas? ¿Qué estructura de las proteínas crea su actividad?___________

2. ¿Qué propiedades tienen las enzimas?______

3. Como se llama centro activo¿enzima? ¿Cuántos centros de este tipo puede haber en una enzima?

4. ¿Cómo aceleran las enzimas las reacciones químicas?___________________________

5. *El alcohol, el fenol, la cloramina y otros antisépticos se utilizan en medicina para tratar zonas del cuerpo contaminadas con flora patógena. Explicar por qué._____

Gr.___3

Trabajo de laboratorio No. 2

DETECCIÓN DE SUSTANCIAS ORGÁNICAS

Objetivo: identificar sustancias orgánicas en los tejidos (almidón, proteínas, grasas) y estudiar sus propiedades.

Equipo: bolsa de gasa, granos de trigo molidos (harina de trigo), solución de yodo al 5%, semillas de girasol (o cualquier otro cultivo oleaginoso: algodón, lino, maní, soja, etc.).

Compuestos orgánicos– las sustancias que contienen carbono, características de la naturaleza viva, constituyen en promedio entre el 20 y el 30% de la masa de las células de los organismos vivos. Las principales propiedades de las células y los organismos están determinadas por polímeros orgánicos: proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos, así como conexiones complejas– grasas y una serie de moléculas de hormonas, pigmentos, nucleótidos individuales, en particular ATP. Además materia orgánica las células contienen minerales y agua, pero el contenido de sustancias orgánicas es siempre mayor. La cantidad de materia orgánica puede variar.

Proteínas – Polímeros irregulares o informativos cuyos monómeros son aminoácidos.

Según su composición, las proteínas se dividen en:

- simple– consisten únicamente en aminoácidos. Por ejemplo, las proteínas vegetales son prolaminas, están contenidas en el gluten de las semillas de cereales y no se disuelven en agua;

- complejo– además de aminoácidos, contienen otros compuestos orgánicos (ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos), compuestos de fósforo y metales. En consecuencia, se denominan: nucleoproteínas, lipoproteínas, glicoproteínas, fosfo y metaloproteínas.

carbohidratos - compuestos que contienen carbono, hidrógeno y oxígeno. Se dividen en mono, di y polisacáridos. Los polisacáridos son carbohidratos de alto peso molecular que consisten en gran número monosacáridos, sus masa molecular es grande, las moléculas tienen una estructura lineal o ramificada. En términos funcionales, se distinguen los polisacáridos con fines estructurales y de reserva. Insoluble en agua almidón– polisacárido de reserva principal células vegetales(polímero ά - glucosa); cuando se expone al yodo se vuelve azul; contenida en grandes cantidades en tubérculos de papa, frutas, semillas. glucógeno- un polisacárido que se encuentra en los tejidos del cuerpo humano y animal, así como en hongos y levaduras, - juega papel importante en la transformación de carbohidratos en las células. Fibra (celulosa)– polisacárido estructural principal membranas celulares plantas.

Lípidos y lípidos– grasas y sustancias similares a las grasas – compuestos orgánicos con estructura diferente. No se disuelven en agua, pero se disuelven bien en compuestos orgánicos: éter, gasolina, cloroformo, etc.

Por Estructura química Los lípidos (compuestos de glicerol, alcohol trihídrico) con ácidos orgánicos (grasos) de alto peso molecular no tienen una estructura polimérica.

Composición de semillas

(Según A.N. Bach y A.I. Oparin)

Todas las diversas transformaciones que forman la base de las funciones vitales del cuerpo ocurren con la participación de catalizadores biológicos: enzimas, que son proteínas específicas.

Gracias a las enzimas, se manifiesta una de las características notables de las células vivas: la capacidad de llevar a cabo las reacciones más complejas en muy un tiempo corto y a una temperatura corporal relativamente baja. Importancia biológica Este fenómeno es muy grande.

Para estudiar la acción de las enzimas, es necesario aislarlas de los tejidos vivos. Normalmente, para este fin se selecciona una fuente fácilmente disponible rica en esta enzima. Para transferir la enzima a solución, es necesario destruir las paredes celulares, lo que se logra mediante un homogeneizador, trituración en un mortero, congelación y descongelación, autólisis, etc. Normalmente, la destrucción de las paredes celulares se lleva a cabo. a baja temperatura, por lo que todos los procesos enzimáticos se suspenden en los tejidos.

El grupo de enzimas redox incluye enzimas que contienen hemo. catalasa, que cataliza la reacción de descomposición del peróxido de hidrógeno con la liberación de oxígeno molecular:

2H2O2-- > 2H2O + O2

La catalasa se encuentra en la mayoría de los tejidos de un organismo vivo.

Principio del método.

El peróxido de hidrógeno se descompone mediante catalasa. El exceso de peróxido de hidrógeno se titula con permanganato de potasio en medio ácido. La reacción viene según la ecuación:

2 KMnO 4 + 5 H 2 O 2 + 3 H 2 SO 4 -- > 2 MnSO 4 + K 2 SO 4 + 8 H 2 O + 5 O 2

En el experimento se determina la cantidad de peróxido de hidrógeno restante sin destruir, en el control: total se tomó peróxido de hidrógeno (la catalasa en la muestra de control se inactivó mediante ebullición).

Restando los resultados experimentales de los resultados de control, descubrimos la cantidad de peróxido de hidrógeno destruido en un cierto período de tiempo, lo que nos permite juzgar la actividad de la catalasa.

Equipo: 1. Buretas rectas de 50 y 100 ml (1 pieza cada una)

2. Cilindro de 10 ml

3. Mortero y maja

4. Matraces cónicos de 200-250 ml (2 uds.)

5. Básculas técnicas con pesas

6. Pipeta de 10 ml “extracto enzimático”

7. Pipetear "H 2 SO 4"

8. Baño de agua hirviendo

9. Espátula

10. Matraz aforado de 100 ml

11. Embudo

12. Papel de filtro

Materiales: 1. Material vegetal fresco (zanahorias o patatas)

2. Solución 0,1 N de H 2 O 2

3. Solución 0,1 N de KMnO4

4. Solución al 10% de H 2 SO 4

5. CaCO 3 (cristal)

6. Arena de cuarzo

Progreso:

Se muelen 2 g de patatas crudas (o zanahorias) con arena de cuarzo en un mortero, añadiendo poco a poco 2-3 ml de agua. Para reducir la reacción ácida, agregue carbonato de calcio con la punta de la espátula hasta que deje de burbujear. dióxido de carbono. La masa molida se transfiere cuantitativamente a un matraz aforado y se ajusta a 100 ml con agua. La mezcla se deja reposar durante 30-60 minutos, tras lo cual se filtra.

En un matraz cónico de 200 ml, tomar con una bureta 25 ml de una solución de peróxido de hidrógeno 0,1 N y añadir con una pipeta 20 ml del extracto enzimático. Después de 30 minutos, se detiene la acción de la enzima añadiendo 5 ml de una solución de ácido sulfúrico al 10% y la mezcla se titula con una solución de permanganato de potasio 0,1 N (hasta que dura un color rosa durante aproximadamente 1 minuto). Se anota la cantidad de mililitros de solución de permanganato de potasio utilizados para valorar el peróxido de hidrógeno restante.

Al mismo tiempo, se establece un control con calentamiento inactivado en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos con una solución enzimática (20 ml, después de enfriar, se añaden a esta solución 25 ml de una solución de peróxido de hidrógeno 0,1 N). La mezcla se deja reposar durante 30 minutos, tras lo cual se añaden 5 ml de una solución de ácido sulfúrico al 10% y se titula con una solución 0,1 N de permanganato de potasio. Se anota la cantidad de mililitros de permanganato de potasio utilizados para valorar la cantidad total de peróxido de hidrógeno.

A partir de la diferencia entre las valoraciones experimentales y de control, se encuentra la cantidad de permanganato equivalente a la cantidad de peróxido de hidrógeno descompuesto. Según la ecuación de reacción entre KMnO 4 y H 2 O 2, 1 ml de solución 0,1 N de permanganato de potasio corresponde a 1,7 mg de peróxido de hidrógeno.

Ejemplo de cálculo.

Se preparó un extracto de catalasa de 100 ml a partir de 1,25 g de zanahorias. La titulación de la muestra experimental requirió 15,5 ml y la muestra de control, 30,2 ml de una solución 0,1 N de permanganato de potasio. La cantidad de peróxido de hidrógeno descompuesto en la muestra equivale a 30,2-15,5 = 14,7 ml de solución 0,1 N de permanganato de potasio y, por tanto, igual a 14,7 * 1,7 = 24,99 mg.

1 g de zanahoria cruda contiene una cantidad de catalasa capaz de descomponer (24,99*100)/(20*1,25)=99,96 mg de peróxido de hidrógeno en 30 minutos, y 99,96/30=3,33 mg en 1 minuto. Porque

1 µmol de peróxido de hidrógeno son 0,034 mg, luego en 1 g de zanahorias hay 33,3/0,034 = 100 U de catalasa.

Trabajo de laboratorio No. 4.

Preparación de sacarasa a partir de células de levadura. Especificidad de la acción enzimática.

Todo diferente transformaciones quimicas, que forman la base de las funciones vitales del cuerpo, ocurren con la participación de catalizadores biológicos: enzimas, que son proteínas específicas.

Gracias a las enzimas, se manifiesta una de las características notables de las células vivas: la capacidad de llevar a cabo reacciones complejas en muy poco tiempo y a una temperatura corporal relativamente baja.

El estudio de las propiedades de las enzimas, las condiciones de su acción, la determinación del contenido de enzimas en diversos órganos y tejidos ha gran importancia Para comprensión correcta procesos complejos actividad vital del cuerpo.

Uno de las propiedades más importantes Las enzimas es la especificidad de su acción en relación con un sustrato particular. La especificidad de las propiedades catalíticas de las enzimas se manifiesta en el hecho de que la enzima, por regla general, actúa solo sobre cierta sustancia. La estricta especificidad de las enzimas también queda indicada por el hecho de que en casos de estereoisomerismo, una enzima particular cataliza la escisión de un solo estereoisómero. La especificidad de las enzimas es su característica más importante. propiedad biológica, sin el cual un metabolismo ordenado es imposible.

Este trabajo examina los procesos de escisión por la enzima sacarasa del sustrato (sacarosa) y la descomposición del almidón por la enzima amilasa, que se encuentra en la saliva humana.

Extracción de sacarasa de células de levadura.

Materiales y reactivos:

· Levadura prensada – 10 g

Homogeneizador (mortero y maja)

· Arena de cuarzo

· Agua destilada

Progreso

Colocar 10 gramos de levadura seca en un mortero, agregar 10 ml de agua destilada y homogeneizar en un mortero de porcelana con una pequeña cantidad. arena de cuarzo para destruir las paredes celulares. Luego colocar el mortero porcelánico con el homogeneizado en una cámara de secado a una temperatura de 60 0 C durante 30-40 minutos.

Pasado el tiempo indicado, retirar el mortero, enfriar, añadir 30 ml de agua destilada y triturar el contenido del mortero hasta que quede suave.

Luego el homogeneizado, para sedimentar la masa celular, se centrifuga a 3000 rpm durante 15 minutos. El sobrenadante resultante es extracto de sacarasa.