Флюресцент микроскопийн арга. Флюресцент микроскоп

Цагаан будаа. 1. Эпи-флюресцент микроскоп

Уламжлалт тодосгогч бодис бүхий оптик микроскопоор хүрэхэд хэцүү хэд хэдэн онцлог шинж чанаруудын улмаас флюресцент микроскоп нь биологийн болон биоанагаахын судалгаа, материал судлалын аль алинд нь чухал хэрэгсэл болсон. Флюрохромуудын багцыг ашигласнаар флюресцент бус бодисоос өндөр өвөрмөц эсүүд болон микроскопийн доорх эсийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг тусгаарлах боломжтой болсон. Флюресценцийн микроскопоор үнэндээ бие даасан молекулуудыг ч илрүүлж болно. Флюресцент олон будгийг ашиглан янз бүрийн будагч бодисууд нь олон зорилтот молекулуудыг нэгэн зэрэг тодорхойлох боломжтой. Флюресцент микроскопын орон зайн нарийвчлал нь дээжийн өвөрмөц шинж чанараас хамаардаг дифракцийн хязгаараар хязгаарлагддаг боловч энэ хязгаараас доогуур флюресцент молекулуудыг илрүүлэх бүрэн боломжтой.

Олон дээж нь цацраг туяагаар (фторхром ашиглахгүйгээр) автофлуоресценцийг харуулдаг бөгөөд энэ үзэгдэл нь ургамал судлал, петрологи, хагас дамжуулагчийн үйлдвэрлэлд өргөн хэрэглэгддэг. Үүний эсрэгээр, амьтны эд эс эсвэл эмгэг төрүүлэгч организмыг судлах нь ихэвчлэн маш сул эсвэл эсрэгээр хүчтэй өвөрмөц бус автофлуоресценцээр төвөгтэй байдаг. Илүү их чухалЭнэ тохиолдолд энэ нь тодорхой долгионы уртад өдөөгдөж, шаардлагатай эрч хүчээр гэрэл ялгаруулдаг фторохромын (эсвэл фторофор) эд эсэд нэвтрүүлэхэд оршино. Фторхромууд нь харагдахуйц эсвэл үл үзэгдэх бүтцэд бие даан наалддаг будагч бодисууд бөгөөд зорилтот чиглэлд өндөр сонгомол, өндөр квантын гарцтай байдаг (ягарсан гэрэл шингэсэн фотоны тоонд харьцуулсан харьцаа). Флюресценцийн микроскопийн хэрэглээний хурдацтай өсөлт нь тусгай өдөөлт, ялгаралтын эрчмтэй, өгөгдсөн биологийн зорилтод "онилогдсон" шинэ синтетик болон байгалийн флуорофорууд гарч ирсэнтэй нягт холбоотой юм.

Өдөөлт ба ялгаруулалтын үйл явцын үндэс

Зураг 1-д дамжуулсан болон ойсон гэрлийн аль алинд нь ажиглалт хийхэд зориулагдсан орчин үеийн эпифлуоресценцийн микроскопын бүдүүвч хөндлөн огтлолыг үзүүлэв. Төв хэсэгт байрлах босоо гэрэлтүүлэгч нь нэг төгсгөлд гэрлийн эх үүсвэртэй (диаграммд эпископийн модуль гэж заасан), нөгөө талдаа шүүлтүүрийн хавсралттай байна. Энэхүү загвар нь туссан гэрлийн долгионы урт нь өдөөх долгионы уртаас их байдаг микроскоп дээр суурилдаг. Ойсон гэрлийн флюресцент микроскопийн босоо гэрэлтүүлэгчийн зохиогч нь Йохан С.Плоем гэж тооцогддог. Сонгомол өдөөх шүүлтүүрээр дамждаг нуман чийдэн эсвэл бусад эх үүсвэрийн олон давтамжийн гэрлийг флюресцент босоо гэрэлтүүлэгчээр тодорхой долгионы урттай (эсвэл өгөгдсөн долгионы интервалд) ихэвчлэн хэт ягаан, хөх, ногоон хэсгүүдээс гэрэл болгон хувиргадаг. спектрийн. Өдөөлтийн шүүлтүүрээр дамжсан урсгал нь дихромат (мөн дихроик гэж нэрлэдэг) толин тусгал эсвэл цацраг задлагчийн гадаргуугаас тусгаж, объективээр дамжин дээжийг хүчтэй гэрлээр гэрэлтүүлдэг. Хэрэв дээж нь флюресцэж байвал объектив цуглуулсан гэрэл дахин дихроик толин тусгалаар дамжин өнгөрч, дараа нь өдөөх долгионы уртад гэрлийг блоклодог (эсвэл ялгаруулах) шүүлтүүрээр шүүдэг. Оптик микроскопийн цорын ганц горим бол флюресценц бөгөөд дээж нь цацрагийн дараа өөрийн гэрлийг ялгаруулдаг. Цацраасан гэрлийн эх үүсвэрийн байршлаас үл хамааран бүх чиглэлд бөмбөрцөг хэлбэрээр дахин ялгардаг.

Эпифлюресцент гэрэлтүүлэг нь зонхилох арга юм орчин үеийн микроскоп. Босоо ойсон гэрлийн гэрэлтүүлэгч нь ажиглалтын хоолой ба линзний эргэдэг толгойн хооронд байрладаг. Гэрэлтүүлэгч нь зураг руу очих зам болон дээжээс гарах өдөөх гэрэл нь микроскопын ижил объектоор дамждаг байхаар зохион бүтээгдсэн бөгөөд энэ тохиргоонд эхлээд конденсатор болж, буцах зам дээр ялгарах флюресцент гэрлийг цуглуулдаг. Энэ төрлийн асаагуур нь хэд хэдэн давуу талтай байдаг. Флюресценцийн микроскопын линз нь нэгдүгээрт, сайн тохируулсан конденсатор, хоёрдугаарт, дүрс үүсгэх гэрэл цуглуулах төхөөрөмжийн үүрэг гүйцэтгэдэг. Ижил бүрэлдэхүүн хэсэг болох линз/конденсатор нь үргэлж төгс нийцдэг. Дээжинд хүрч буй өдөөх гэрлийн ихэнх хэсэг нь харилцан үйлчлэлгүйгээр дамжин өнгөрч, объект руу буцаж ирдэггүй бөгөөд гэрэлтүүлсэн хэсэг нь нүдний шилээр (ихэнх тохиолдолд) ажиглагддаг дээжийн хэсэгт хязгаарлагддаг. Хэрэв микроскопыг Көллерийн гэрэлтүүлэгт зориулж зөв тохируулсан бол зарим тодосгогчийг сайжруулах аргуудаас ялгаатай нь объектив линзний бүрэн тоон нүхийг ажиглах боломжтой. Нэмж дурдахад энэ нь дамжуулсан болон ойсон гэрлийн ажиглалтын горим, дижитал дүрс үүсгэх горимыг хослуулах эсвэл тэдгээрийн аль нэгийг сонгох боломжийг олгодог.

Цагаан будаа. 2. Флюресцент шүүлтүүр

Дикроик толинд хүрч буй тархсан өдөөх гэрлийн ихэнх хэсэг нь гэрлийн эх үүсвэрт буцаж тусдаг боловч багахан хэсэг нь толины дотоод бүрхүүлээр дамжин өнгөрч эсвэл шингэж болно. Гэхдээ ялгарсан флюресцент нь нүдний шил эсвэл детекторт хүрэхээс өмнө блоклох эсвэл блоклох шүүлтүүрээр дамжин өнгөрөх ёстой урт долгионгэрэл цацарсан. Ихэнх ойсон гэрлийн гэрэлтүүлэгч нь өдөөх шүүлтүүр, дихроик толь, зогсоох шүүлтүүрийг 2-р зурагт үзүүлсэн шиг оптик нэгж (ихэвчлэн шоо гэж нэрлэдэг) болгон нэгтгэдэг. Орчин үеийн флюресцент микроскопууд нь дөрвөөс зургаан шүүлтүүр шоо (ихэвчлэн тойруулга эсвэл шургуулга дээр) багтаах боломжтой. хавсралт).

Босоо гэрэлтүүлэгчийн загвар нь хэрэглэгчдэд микроскопыг Köller-ийн гэрэлтүүлэгт тохируулах боломжийг олгох ёстой бөгөөд энэ нь бүх харах талбарт тод, жигд гэрэлтүүлгийг өгдөг. Оптик системийн залруулсан конденсатор линз нь төвлөрсөн диафрагмын дүрсийг фокусын линзний арын нүхтэй нийцүүлэхийг баталгаажуулдаг. Орчин үеийн гэрэлтүүлэгчийн хувьд урьдчилан төвлөрсөн, төвлөрсөн талбайн диафрагмын дүрс нь нүдний шилний тогтмол диафрагмын төвлөрсөн дүрс ба хавтгайтай нийлдэг.

Гэрэлтүүлгийн чийдэнгийн хэсэг нь ихэвчлэн хэт улаан туяаны гэрлийг хаадаг зогсоох шүүлтүүр агуулдаг. Дэнлүүний хэсэг нь өөрөө хэт ягаан туяаг гадагш дамжуулах ёсгүй. Ашиглалтын явцад нээгдэх тохиолдолд суурилуулсан таслууртай байх нь зүйтэй юм. Дэнлүүний нэгж нь үйл ажиллагааны явцад нуман чийдэнгийн болзошгүй дэлбэрэлтийг тэсвэрлэх хангалттай хүчтэй байх ёстой. Орчин үеийн чийдэнгийн төхөөрөмжүүдийн хувьд чийдэнгийн залгуур нь нуман чийдэнгийн дүрсийг линзний арын нүхэнд төвлөрүүлэхийн тулд тохируулагч товчлууруудаар тоноглогдсон байдаг (Келлерийн гэрэлтүүлгийн дор эдгээр онгоцууд нэгддэг). Дээжийг ажиглаагүй тохиолдолд өдөөх гэрлийг бүрэн хаахын тулд гэрлийн замд, ихэвчлэн чийдэнгийн нэгжийн ойролцоо боловч өдөөх шүүлтүүрийн өмнө хаалтыг байрлуулахыг зөвлөж байна. Нэмж дурдахад гэрэлтүүлэгчийн төхөөрөмж нь сэтгэл хөдөлгөм гэрэлтүүлгийн эрчмийг багасгахын тулд төвийг сахисан нягтын шүүлтүүрийг (бөмбөр, тойруулга эсвэл эвхэгддэг төрлийн хавсралт) агуулсан байх ёстой.

Стоксын шилжилт

Флуорофорын ялгаралтын оргил эрчим нь ихэвчлэн түүний шингээлтийн оргил эрчмээс бага байдаг ба илүү урт долгионы урттай үед тохиолддог. Ялгарлын муруй (спектрийн муруй) нь ихэвчлэн өдөөх муруйны толин тусгал дүрс (эсвэл үүнтэй ойролцоо) байдаг боловч 3-р зурагт үзүүлсэн шиг урт долгионы урт руу шилжсэн бөгөөд энэ нь Alexa Fluor 555 будгийн ашигтай спектрийн шинж чанарыг харуулж байна. шар-ногоон, шар-улбар шар бүсэд ялгардаг. Флюресценцийн хамгийн их эрчмийг бий болгохын тулд флюрофорыг (ихэвчлэн будагч бодис гэж нэрлэдэг) өдөөх муруйн оргилд ойрхон эсвэл ойролцоо долгионы уртад өдөөгдөж, ялгарах гэрлийг ялгаралтын оргилыг багтаасан хамгийн өргөн хүрээнд илрүүлдэг. Сэтгэл хөдөлгөм ба ялгарах долгионы уртыг сонгохдоо хөндлөнгийн шүүлтүүр ашиглан гүйцэтгэнэ (Зураг 2). Нэмж дурдахад микроскопын оптик системийн спектрийн шинж чанар нь шилний дамжуулалт (энэ нь тусгалын эсрэг бүрхүүлд нөлөөлдөг), линз ба толины тоо, мэдрэгчийн мэдрэмжээс хамаардаг гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй.

Цагаан будаа. 3. Флюорофорын шингээлт ба ялгаралтын муруй

Өдөөлт ба ялгаруулалтын долгионы уртыг ялгах, бүртгэх үр ашгийг флюресценцийн микроскопоор олж авдаг. зөв сонголтспектрийн хэт ягаан туяа, үзэгдэх болон ойрын хэт улаан туяаны бүсэд тодорхой долгионы урттай гэрлийг хааж, эсвэл эсрэгээр дамжуулдаг гэрлийн шүүлтүүрүүд. Босоо флюресцент гэрэлтүүлэгчд өдөөх гэрлийг хянадаг тул тэдгээрийн загвар нь дээж рүү гэрлийн зам дагуу, дээж ба ажиглалтын хоолойн хооронд буцах замд суурилуулсан хялбар солих шүүлтүүрийг (саармаг ба хөндлөнгийн өдөөх шүүлтүүр) ашиглах боломжийг олгодог. эсвэл дохио хүлээн авах систем. Флюресцент ялгаруулалтын бага эрчимтэй (дээр дурдсанчлан) өдөөх гэрлийн эх үүсвэр нь сул ялгардаг гэрлийг нэмэгдүүлэхийн тулд хангалттай гэрэлтэй байх шаардлагатай бөгөөд флюрохромууд нь зохих шингээлтийн шинж чанар, квант үр ашигтай байх шаардлагатай. Энэ нь магадгүй флюресцент микроскопийн гол шалгуур юм.

Бие даасан флюорофор нь өдөөх гэрлийн фотоныг шингээх үр ашиг нь түүний үр дүнтэй молекулын хөндлөн огтлолоос хамаардаг бөгөөд ийм үзэгдэл үүсэх магадлалыг шингээлтийн коэффициент гэж нэрлэдэг. Шингээлтийн коэффициентийн том утга нь тухайн долгионы уртын интервалд фотон (эсвэл квант) шингээх магадлал өндөр байгааг харуулж байна. Квантын гарц гэдэг нь ялгарсан тоог шингээсэн квантуудын тоонд харьцуулсан харьцаа юм (ихэвчлэн энэ нь 0.1-1.0 хооронд хэлбэлздэг). Квантын гарц нь 1-ээс бага утгыг авдаг нь цацраг идэвхт бус аргаар, жишээлбэл, дулаан эсвэл фотохимийн урвалаар дахин ялгаруулалт үүсэхгүй байх үед флюресцент үүсэхэд хүргэдэг эрчим хүчний үр дагавар юм. Шингээлтийн коэффициент, квант үр ашиг, гэрэлтүүлгийн дундаж эрчим, гэрэлтэх хугацаа нь чухал хүчин зүйлүүд, флюресценцийн эрчмд нөлөөлж, энэ аргыг ашиглах боломжийг тодорхойлох.

Бүдгэрэх, бүдгэрч, гэрэлтэх

Цагаан будаа. 4. Олон өнгийн дээжийг фото цайруулах хурд

Флюресценцийн эрчмийг бууруулахад хүргэдэг өдөөлтөөс тайвширч, янз бүрийн цацраг идэвхт бус аргаар явагддаг бөгөөд ихэвчлэн исэлдүүлэгч бодис эсвэл давс, хүнд металл, галоген нэгдлүүд байгаатай холбоотой байдаг. Зарим тохиолдолд унтрах нь өдөөгдсөн флюорофор (донор) -той ойрхон байгаа өөр молекул (акцептор гэж нэрлэгддэг) руу энерги шилжүүлсний үр дүнд үүсдэг. Энэ үзэгдлийг флюресцент резонансын энергийн дамжуулалт (FRET) гэж нэрлэдэг. Энэ механизм нь үндэс болсон юм үр дүнтэй аргасурч байна молекулын харилцан үйлчлэлмөн оптик микроскопын нягтралаас хамаагүй бага зайд холболтууд.

Флюресцент гэрлийн эх үүсвэрүүд

Микроскопын гадаад нуман чийдэнгийн тэжээлийн хангамж нь ихэвчлэн ажилласан цагийн тоог хянах таймераар тоноглогдсон байдаг. Нуман чийдэн нь ашиглалтын хугацаанаас (200-300 цаг) хэтэрсэн тохиолдолд гэрлийн хүчийг алдаж, ихэвчлэн эвдэрдэг. Мөнгөн усны чийдэн нь хэт ягаан туяанаас IR хүртэлх спектрийн мужид жигд эрч хүчийг өгдөггүй. Тэдний хамгийн их эрчим нь хэт ягаан туяаны ойролцоо тохиолддог. Тодорхой эрчим хүчний оргилууд 313, 334, 365, 406, 435, 546, 578 нанометрт тохиолддог. Үзэгдэх спектрийн бусад долгионы уртад эрчим нь тийм ч өндөр биш боловч тогтвортой байдаг (гэхдээ ихэнх хэрэглээнд хангалттай). Гэхдээ чийдэнгийн хүч нь өөрөө гэрэлтүүлгийн үр ашгийг тодорхойлох үзүүлэлт биш юм. Үүний эсрэгээр, хамгийн түрүүнд анхаарах ёстой чухал параметр бол эх үүсвэрийн тод байдал, нумын геометр, цацрагийн өнцгийн тархалтыг харгалзан үзэх дундаж гэрэлтэлт юм.

Цагаан будаа. 5. Нуман флюресцент ламп

Шүүлтүүрийн тэмдэг

Үйлдвэрлэгчид өдөөх шүүлтүүрийн шинж чанарыг тодорхойлохын тулд өөр өөр товчлолыг ашигладаг. Жишээлбэл, хэт ягаан туяаны шилийг UG, цэнхэр шилийг BG гэж нэрлэдэг. Нарийн зурвасын шүүлтүүр дээр та KP (Герман хэлнээс "kurz" -аас "богино" гэж орчуулсан K) эсвэл зүгээр л SP гэсэн тэмдэглэгээг харж болно. Зарим үйлдвэрлэгчид хөндлөнгийн шүүлтүүрийг IF гэсэн товчлолоор тэмдэглэдэг. Нарийн зурвасын хөндлөнгийн өдөөх шүүлтүүрүүд нь ялангуяа Стоксын бага шилжилтэд үр дүнтэй байдаг.

Шүүлтүүрийг хаах товчлол, товчлол нь дараах байдалтай байна: LP эсвэл L нь өргөн зурвасын шүүлтүүр, Y эсвэл GG шар (Германы "gelb" - шар) шил, R эсвэл RG улаан шил, OG эсвэл O улбар шар шил, K. слот шүүлтүүр (Герман хэлнээс "kante" - ирмэг), шүүлтүүрийг хаах зориулалттай BA. Шүүлтүүрийг BA515 гэх мэт тоогоор тэмдэглэсэн бол энэ нь хамгийн их дамжуулалтынхаа тал хувийг эзэлдэг долгионы уртыг (нанометрээр) заана.

Dichroic beam splitters-ийг мөн өөр өөр товчлолоор тэмдэглэсэн байдаг: CBS нь chromatic beam splitter, DM нь dichroic толь, TK нь slot splitter (Герман хэлнээс "teiler kante"), FT нь өнгө ялгагч (Герман хэлнээс "farb teiler" гэсэн үг юм. ”), мөн RKP нь нарийн зурвасын цацруулагчийг илэрхийлдэг. Үүнээс гадна, бүх орчин үеийн dichroic цацраг задлагчдын оптик шил нь үргэлж интерференцийн бүрээстэй байдаг (органик эсвэл металл будагч бодисууд). өндөр тусгал. богино долгионурт долгионы өндөр дамжуулалт. Ойсон гэрлийн флюресцент гэрэлтүүлэгчээр дамжин оптик блок дээр тусах өдөөх гэрлийн эсрэг 45 градусын өнцгөөр дикроик цацраг задлагч нар хазайсан байна. Тэдний гол үүрэг нь тодорхой (богино) сэтгэл хөдөлгөм долгионыг зорилго болон түүний ард байрлах дээж рүү чиглүүлэх явдал юм. Эдгээр тусгай шүүлтүүрүүд нь илүү урт флюресценцийн долгионыг блоклох шүүлтүүр рүү дамжуулж, тархсан өдөөх гэрлийг чийдэнгийн хэсэг рүү буцааж тусгах нэмэлт функцтэй.

Цагаан будаа. 6. Nikon B-2E дунд зурвасын цэнхэр өдөөх шүүлтүүр

Системийн зүрхэнд тэмдэг, Nikon ашигладаг, 1990-ээд оны эхээр гарч ирсэн холимог нэр томъёо юм. Тухайн үед Nikon-ийн нэмэлт шүүлтүүрийн бүх хослолыг хатуу бүрэх аргаар үйлдвэрлэдэг байсан бол өнөөдөр зөөлөн бүрэх дэвшилтэт аргуудыг ашиглан олон шүүлтүүр үйлдвэрлэж байна. Хэдийгээр зөөлөн бүрээс нь чийгшил, халуунд илүү мэдрэмтгий бөгөөд илүү болгоомжтой харьцах шаардлагатай (хатуу бүрээстэй харьцуулахад) илүү ихийг харуулдаг. өндөр үнэ цэнэ оптик нягтралтодорхой зурвасын өргөнийг нарийн тохируулахад илүү хялбар болгоно. Nikon шүүлтүүрийн хослолуудын тухай ойлголт нь тодорхой флюорофоруудад шаардлагатай шүүлтүүрийг хурдан сонгох боломжийг олгодог.

Nikon-ийн үсэг тоон тэмдэглэгээний системийн эхний үсэг нь өдөөх спектрийн мужийг заадаг (жишээлбэл, UV, V, B, G нь товчлол юм. Англи үгс"хэт ягаан" - хэт ягаан, "ягаан" - ягаан, "цэнхэр" - цэнхэр, "ногоон" - ногоон тус тус). Өдөөлтийн спектрийн кодчилолын дараах тоо нь өдөөх шүүлтүүрийн зурвасын өргөнийг заана: 1 нь нарийн зурвасын өдөөлт, 2 нь дунд зурвасын өдөөлт, 3 нь өргөн зурвасын өдөөлттэй тохирч байна. Эцэст нь, өдөөх зурвасын өргөнтэй тохирох тооны дараах нэг буюу хэд хэдэн үсэг нь блоклох шүүлтүүрийн шинж чанарыг илтгэнэ. А үсэг нь хамгийн бага таслах долгионы урттай стандарт өргөн зурвасын таслах шүүлтүүрийг, B нь илүү их хэмжээтэй өргөн зурвасын таслах шүүлтүүрийг заана. өндөр давалгааогтлолт. Туузан дамжуулалтын ялгаруулалтын шүүлтүүр дэх E (англи хэлнээс "сайжруулсан" - сайжруулсан) гэсэн тэмдэглэгээ нь тусгаарлагдсан дохионы хөндлөнгийн харилцан үйлчлэлийг багасгах утгаараа гүйцэтгэл сайжирч байгааг харуулж байна. E/C тэмдэглэгээ нь DAPI, FITC, TRITC, Texas Red зэрэг тусгай будагч бодисуудтай ажиллахад зориулагдсан зөөлөн хөндлөнгийн бүрээсийн хослолыг заана.

Флюресцент гэрлийн тэнцвэр

1.4 тоон нүхтэй 100x объективийн хувьд харааны талбайн диаметрийг ойролцоогоор 40 микрометр гэж үзвэл дээжийн гэрэлтүүлсэн талбай нь 12 × 10 E(-6) квадрат сантиметр байна. Дараа нь дээж дээрх гэрлийн урсгал нь квадрат см тутамд 150 ватт байх бөгөөд энэ нь нэг см квадрат тутамд 3.6 × 10 E (20) фотоны урсгалын нягттай тохирч байна. Тиймээс дээжийн гэрэлтүүлгийн эрчим нь гэрэлтүүлгийн эрчмээс ойролцоогоор 1000 дахин их байна. дэлхийн гадаргуужирийн нартай өдөр.

Ийм гэрлийн урсгал дахь флюресцент ялгаруулалт нь флюрофорын шингээлт, ялгаруулах шинж чанар, дээж дэх концентраци, дээжийн оптик замын уртаас хамаарна. Математикийн аргаар үүсгэсэн флюресценцийг (F) тэгшитгэлээр тодорхойлно.

F = σ Q I

Энд σ нь молекул шингээлтийн хөндлөн огтлол, Q нь квантын гарц, I нь дээр дурдсан гэрлийн урсгал юм. Флуоресцеин нь 3 × 10 E(-16) квадрат см-ийн шингээлтийн хөндлөн огтлолтой (σ) флуорофор гэж үзвэл бид 0.99 Q-ийг олж авах бөгөөд энэ нь молекул тутамд секундэд 100,000 фотон флюресцент F-ийг бий болгодог. 40 микрометр диаметртэй, 10 микрометр зузаантай (12 пиколитртэй тэнцэх эзэлхүүнтэй) дискэнд жигд тархсан нэг литрт 1 микромоль будгийн концентраци нь ойролцоогоор 1.2 x 10 E(-17) моль будагч бодис буюу 7.2 сая. оптик зам дахь молекулууд. Хэрэв бүх молекулууд нэгэн зэрэг өдөөгдвөл флюресценцийн хурд нь секундэд 7.2 x 10 E(11) фотон байх болно (энэ нь F ба будгийн молекулын тооны бүтээгдэхүүн юм). Асуулт гарч ирнэ: хэдэн ялгарсан фотон бүртгэгдэх вэ, энэ ялгаралтын хурд хэр удаан үргэлжлэх вэ?

Хүснэгт 1. Төрөл бүрийн гэрлийн эх үүсвэрийн гэрлийн энергийн нягтрал

Фотон илрүүлэх үр ашгийг тэдгээрийн цуглуулгын үр ашиг, детекторын квант гарцаар тодорхойлно. Тоон диафрагм 1.4 ба 100 хувийн дамжуулалттай линз (энэ нь бодит бус нөхцөл) фотон цуглуулах хамгийн их үр ашиг нь 30 орчим хувийн хүлээн авах өнцгөөр хязгаарлагддаг. Дихрой толины дамжуулалт 85 хувь, блоклох шүүлтүүр 80 хувь байна. Энэ тохиолдолд цуглуулах үр ашиг нь 20 хувь буюу секундэд 140 тэрбум фотон юм. Хэрэв уламжлалт цэнэгтэй хосолсон төхөөрөмжийг (CCD) детектор болгон ашиглавал ногоон флуоресцеины долгионы уртад (525 нанометр) квантын гарц 50 хувь болно. Ийнхүү секундэд 70 тэрбум фотон буюу флюресценцээр ялгардаг фотонуудын 10 орчим хувийг илрүүлэх болно. Хамгийн тохиромжтой детектор ч (100 хувийн квант үр ашигтай) флюресценцийн фотонуудын 20 орчим хувийг л барьж чаддаг.

Флюресцент гэрлийн үргэлжлэх хугацаа нь гэрэл гэгээтэй цайралтын үр дагавар болох флюрофорыг устгах хурдаас хамаардаг. Хүчилтөрөгч агуулсан давсны уусмал дахь флуоресцеины молекул бүр устахаасаа өмнө 36,000 орчим фотон ялгаруулж чаддаг болохыг хэмжилтүүд харуулж байна. Хүчилтөрөгчгүй орчинд фото устгалын хурд ойролцоогоор арав дахин буурдаг. Тиймээс флуоресцеины молекул нь 360,000 фотон үүсгэж чаддаг. Бидний жишээн дээрх бүх будагч бодисууд (7.2 сая молекул) хамгийн багадаа 2.6 x 10 E(11), дээд тал нь 2.6 x 10 E(12) фотон ялгаруулах чадвартай. Секундэд 100,000 фотоны нэг молекулын ялгаруулалтын хурдаар (дээрх тооцооллын дагуу) бид фото устгалын өмнөх флюресцент ялгарлын үргэлжлэх хугацааг 0.3-3 секундтэй тэнцүү болгодог. Хэрэв ялгарсан фотонуудын 10 хувийг илрүүлбэл детекторын дохио нь секундэд 7.2 × 10 E(10) электрон байх болно.

Тиймээс хэрэв CCD нь 1000x1000 пикселийн камертай бол энэ дохио нь нэг сая гэрэл мэдрэмтгий элементүүдийн дунд, өөрөөр хэлбэл тус бүрт ойролцоогоор 72,000 электрон хуваарилагдах болно. 9 микрометрийн гэрэл мэдрэмтгий элемент бүхий судалгааны CCD-ийн хувьд цэнэгийн багтаамж нь ойролцоогоор 80,000 электрон, унших чимээ нь 10 электроноос бага байна. Энэ тохиолдолд дохионы дуу чимээний харьцааг голчлон фотоны хэлбэлзлийн дуу чимээгээр тодорхойлно. квадрат язгуурдохио, өөрөөр хэлбэл ойролцоогоор 268. Бараг бүх тохиолдолд энэ өндөр түвшинДохио нь фото устгал үүсэхээс өмнө богино хугацаанд үргэлжлэх боломжтой. Ажиглалтын хугацааг уртасгахын тулд ихэнх микроскопчид цацрагийн урсгалын эрчмийг бууруулж, фторфорын молекулуудын нийт тооны зөвхөн нэг хэсгийг өдөөдөг тул устгадаг. Тиймээс дохио-дуу чимээний харьцаа нь онолын дээд хэмжээнд хүрэх нь ховор бөгөөд флюресценцийн микроскопоор ихэвчлэн 10-20 хооронд байдаг.

Нэг молекул илрүүлэх

Тохиромжтой нөхцөлд нэг молекулын флюресцент ялгаруулалтыг илрүүлэх боломжтой байдаг бөгөөд мэдээжийн хэрэг оптик дэвсгэр болон детекторын дуу чимээ хангалттай бага байх тохиолдолд. Дээр дурьдсанчлан, нэг флюресцеины молекул гэрэл цайруулах замаар устгагдахаасаа өмнө 300,000 хүртэл фотон ялгаруулж чаддаг. 20% цуглуулах, илрүүлэх үр ашигтай үед ойролцоогоор 60,000 фотон илрэх болно. Энэ төрлийн туршилтанд нуранги фотодиод эсвэл электрон үржүүлэхэд суурилсан CCD-г ашигласнаар судлаачид бие даасан молекулуудын үйл ажиллагааг секунд, тэр байтугай минутын хугацаанд хянах боломжтой болсон. Гол асуудалИйм тохиолдолд оптик дэвсгэр шуугиан дарагддаг. Микроскопийн линз, шүүлтүүрийг бүтээхэд ашигласан олон материал нь тодорхой хэмжээний автофлюресценцийг харуулдаг тул эхний хүчин чармайлтыг бага флюресценцтэй бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг үйлдвэрлэхэд чиглүүлсэн. Гэсэн хэдий ч бүрэн флюресцент микроскопийн аргыг ашиглах нь удалгүй тодорхой болсон дотоод тусгал(TIR, эсвэл англи товчлолоор TIR), шаардлагатай бага дэвсгэр болон өндөр эрчимтэй өдөөх гэрлийн хослолыг бий болгож чадна.

Цагаан будаа. 7. Урвуу болон TIRF микроскопуудын тохиргоо

Нийт дотоод ойлтын флюресценцийн микроскоп (англи товчлолоор TIRFM эсвэл TIRFM) нь хугарлын өөр өөр үзүүлэлт бүхий хоёр мэдээллийн хэрэгслийн интерфэйс дэх нийт дотоод тусгалын үед үүсдэг тархдаггүй эсвэл хурдан муудах долгионы үзэгдлийг ашигладаг.

Гадны гэрлийн эх үүсвэрийг ашигладаг хэлхээг Зураг 7(а)-д үзүүлэв. Энэ аргын хувьд гэрлийн туяа (ихэвчлэн өргөтгөсөн лазер туяа) нь шил эсвэл хугарлын бага илтгэгч усан уусмалын хажууд байрлах өндөр хугарлын илтгэгч призм (шил эсвэл индранил гэх мэт) дамжин өнгөрдөг. Хэрэв гэрлийг эгзэгтэй өнцгөөс их өнцөгт призм рүү чиглүүлбэл цацраг нь интерфейсээс бүрэн тусгагдана. Тусгалын үзэгдэл нь интерфэйс дээр тархдаггүй долгион үүсгэдэг, тухайлбал, хугарлын бага илтгэгчтэй орчинд 200 нанометрээс илүүгүй зайд нэвтэрдэг цахилгаан соронзон орон үүсдэг. Унтраах долгион дахь гэрлийн эрч хүч нь флюорофорыг өдөөхөд хангалттай боловч түүний гүн нь маш гүехэн тул өдөөх хэмжээ маш бага байдаг. Үүний үр дүнд цацраг туяанд өртсөн дээжийн эзэлхүүн нь маш бага (гадаргуугаас 200 нм зайд байгаа хэсэг) тул бага түвшний дэвсгэр юм.

Нийт дотоод тусгалын флюресценцийн микроскопийг өргөн талбайн микроскопод ашигладаг өөрчилсөн эпи-гэрэлтүүлгийн техник ашиглан хийж болно (Зураг 7(b)-д үзүүлэв). Энэ арга нь маш өндөр NA зорилго (дор хаяж 1.4, гэхдээ 1.45-1.6) ба хэсэгчилсэн гэрэлтүүлэгтэй микроскопын талбар шаарддаг бөгөөд үүнийг жижиг толбо эсвэл гэрэлтүүлгийн жигд байдлыг хангахын тулд гэрлийн хэсгийг хаадаг нимгэн цагираг ашиглан олж авдаг. урсгал. Нийт дотоод тусгал үүсэх эгзэгтэй өнцөгт хүрэхийн тулд линз болон микроскопын бүрхүүлийн шилэнд дүрэх орчин нь хугарлын өндөр индекстэй байх шаардлагатай. Зураг 7(b)-д үзүүлснээр, гэрлийн туяа, урд линзээс эгзэгтэй өнцгөөс бага өнцгөөр гарч ирвэл (зураг дээр үүнийг A(1) гэж тэмдэглэсэн) микроскоп руу буцаж ирэхээ болино. Критик өнцөгт хүрэх буюу хэтэрсэн үед (Зураг 7(b)-ийн A(2) өнцөг) нийт дотоод тусгал үүснэ.

Судалгаанд нэмэлт мэдээлэл өгөхийн тулд нийт дотоод тусгалыг флюресценцийн резонансын энерги дамжуулах (FRET), гэрэл гэгээтэй цайруулсаны дараа флюресценцийг сэргээх (FRAP), спектроскопи зэрэг бусад алдартай дэвшилтэт флюресценцийн аргуудтай хослуулдаг. Эдгээр аргууд нь бие даасан флюрофор болон флюресцент өнгөтэй молекулуудыг судлах хүчирхэг хэрэгсэл юм. Ганц молекулуудыг судлахын ашиг тус одоо л хэрэгжиж эхэлж байна. Тиймээс өнөөдөр оптик микроскопийн судалгааны хүрээ нь нэг молекулаас эхлээд бүхэл бүтэн амьтад хүртэл байдаг.

Дүгнэлт

Орчин үеийн флюресцент микроскопууд нь өндөр чанарын оптик бүрэлдэхүүн хэсгүүдийн хүчийг компьютержсэн удирдлага, дижитал дүрслэлтэй хослуулж, энгийн харааны ажиглалтаас хамаагүй илүү боловсронгуй түвшинд хүрдэг. Өнөөдөр микроскопи нь мэдээллийг хурдан авахын тулд цахим дүрслэлийн арга техникт ихээхэн тулгуурладаг бага түвшингэрлийн дохио эсвэл харагдахгүй долгионы урттай. Эдгээр техникийн сайжруулалтууд нь зөвхөн гадаад дизайны элементүүд биш, харин нарийн төвөгтэй хэмжих систем болох оптик микроскопын чухал бүрэлдэхүүн хэсэг юм.

Оптик микроскоп нь зөвхөн дүрслэх ухаан эсвэл оюуны тоглоом байсан цаг өнгөрсөн. Өнөөдөр оптик дүрслэл нь өгөгдөлд дүн шинжилгээ хийх эхний алхам юм. Энэ эхний алхамыг микроскопоор хамт хийдэг электрон илрүүлэгч, дүрс боловсруулах системийн өргөтгөл гэж үзэж болох дүрс процессор, дэлгэц. Түгээмэл хэрэглээнд байгаа фокус, тайзны байрлал, оптик эд анги, хаалт, шүүлтүүр, детекторыг компьютержүүлсэн удирдлага нь механик микроскоп дээр ажиллахад хүний ​​хувьд ердөө л боломжгүй байсан туршилтын явцад ийм зохицуулалт хийх боломжийг олгодог. Флюресценцийн микроскопод оптоэлектроникийн хэрэглээ нэмэгдэж байгаа нь эсийн доорх бүтэц, тоосонцорыг удирдах, бие даасан молекулуудыг ажиглах, өргөн хүрээний нарийн спектроскопийн хэрэглээнд зориулагдсан оптик хясаа хөгжүүлэхэд хүргэсэн.

Флюресцент шүүлтүүрийн хослолууд

Эпи-флюресценцийн интерференц ба шингээлтийн шүүлтүүрүүдийн хослолыг шүүлтүүрийн куб (эсвэл оптик нэгж) дотор байрлуулсан бөгөөд өдөөх шүүлтүүр, дихроик цацраг задлагч (ихэвчлэн толин тусгал гэж нэрлэдэг) болон блоклох (эсвэл ялгаруулах) шүүлтүүрийг Зураг 1-д үзүүлэв. (a). Энэхүү гарын авлага нь өргөн талбайн флюресценцийн микроскопод хэрэглэгддэг хромофорын шингээлт ба ялгаралтын спектрийн шинж чанарт тохирсон шүүлтүүрийн хослолыг сонгоход тустай байж болох юм. Цэнхэр өдөөх муж дахь өндөр хүчин чадалтай зурвасын шүүлтүүрүүдийн ердийн хослолын спектрийн муруйг Зураг 1(b)-д үзүүлэв. Nikon флюресцент шүүлтүүрийн хослолууд нь нарийн зурвасын, дунд зурвасын болон өргөн зурвасын өдөөх шүүлтүүрүүд болон тэдгээрийн харгалзах тусгай буюу өргөн зурвасын ялгаралтын шүүлтүүртэй байдаг.

Цагаан будаа. 8. Флюресцент гэрлийн шүүлтүүрийн блокийн спектрийн муруй

Хэт ягаан туяаны өдөөлт - Nikon-ийн хэт ягаан туяаны өдөөлтийн флюресценцийн шүүлтүүрийн багц нь ердийн зурвасын дамжуулалт эсвэл өргөн зурвасын ялгаруулалтыг (хориглох) шүүлтүүрийг багтаасан нарийн тэнцвэртэй дөрвөн хослолыг агуулдаг бөгөөд флюресцент ялгаралтыг харагдах спектрийн цэнхэр, ногоон, улаан хэсгүүдийн нарийн эсвэл өргөн хүрээнд дамжуулж чаддаг. Эдгээр шүүлтүүрийн хослолууд нь 10, 40, 50 нанометрийн зурвасын өргөнтэй 330-380 нанометрийн өдөөх хүрээг хамардаг. Гурван хослол нь ижил dichroic толин тусгалыг ашигладаг бөгөөд дөрөв дэх нь нарийн өдөөх зурваст тохирох долгионы уртыг багасгадаг. Хэт ягаан туяаны шүүлтүүрийн хослолууд нь тогтмол эсвэл өргөн зурвасын ялгаруулалтын шүүлтүүрийг агуулдаг.

Нил ягаан өдөөлт - Nikon-ийн нил ягаан өдөөх флюресцент шүүлтүүрийн багц нь спектрийн нарийн эсвэл өргөн хүрээний цэнхэр, ногоон, улаан бүсэд флюресцент ялгаралтыг сонгон дамжуулж чаддаг ердийн зурвасын дамжуулалт эсвэл өргөн зурвасын ялгаруулагч (хаалт) шүүлтүүрийг багтаасан гурван хослолыг агуулдаг. Эдгээр шүүлтүүрийн хослолууд нь 10, 22, 40 нанометрийн зурвасын өргөнтэй 379-420 нанометрийн өдөөх хүрээг хамардаг. Хоёр хослол нь ижил dichroic толин тусгалыг ашигладаг бөгөөд гурав дахь нь богино долгионы урттай өдөөх зурваст тааруулахын тулд бага таслах долгионы урттай байдаг.

Цэнхэр ягаан өдөөлт - Nikon-ийн Цэнхэр ягаан өдөөх флюресценцийн шүүлтүүрийн багц нь ердийн зурвасын дамжуулалт эсвэл өргөн зурвасын ялгаруулагч (хаалт) шүүлтүүрийг агуулсан дөрвөн хослолыг агуулдаг бөгөөд энэ нь харагдахуйц цэнхэр, ногоон, улаан хэсгүүдийн нарийхан эсвэл өргөн хүрээнд флюресцент ялгаралтыг дамжуулж чаддаг. спектр. Эдгээр нэмэлт шүүлтүүрүүд нь 10, 20, 40 нанометрийн зурвасын өргөнтэй 400-аас 446 нанометрийн өдөөх хүрээг хамардаг. Гурван хослол нь ижил дихроик толин тусгалыг ашигладаг бол дөрөв дэх нь бусад бүрэлдэхүүн хэсгүүдтэй тохирох долгионы урттай (5 нанометрээр) илүү өндөр байдаг.

Цэнхэр өдөөлт - Nikon-ийн цэнхэр өдөөх флюресцент шүүлтүүр нь спектрийн ногоон, шар, улаан, хэт улаан туяаны хэсгүүдийн нарийхан эсвэл өргөн хүрээнд флюресцент ялгаралтыг сонгон дамжуулж чаддаг ердийн зурвасын дамжуулалт эсвэл өргөн зурвасын ялгаруулагч (хаалт) шүүлтүүрийг багтаасан зургаан тэнцвэртэй хослолоос бүрддэг. . Эдгээр шүүлтүүрийн хослолууд нь 20, 30, 40, 70 нанометрийн зурвасын өргөнтэй 420-495 нанометрийн өдөөх хүрээг хамардаг. Таван хослол нь ижил дихроик толин тусгалыг ашигладаг бөгөөд зургаа дахь нь хүлээн авсан дохиог нэмэгдүүлэхийн тулд таслах долгионы урт багатай байдаг. Nikon цэнхэр өдөөх шүүлтүүрийн иж бүрдэлд зориулсан бүх зурвас зогсолтын шүүлтүүрүүд нь 40 нанометрийн спектрийн өргөнтэй. Шүүлтүүрүүдийн нэг (B-3A) нь вольфрамын галоген чийдэнгийн гэрэлтүүлэгт ашиглах зориулалттай.

Ногоон өдөөлт - Nikon-ийн ногоон өдөөлтийн флюресцент шүүлтүүр нь зургаан блокоос бүрдэх ба үүнд ердийн зурвасын дамжуулалт эсвэл өргөн зурвасын ялгаруулалтыг (блоклох) шүүлтүүрүүд нь шар, улбар шар, улаан, ойрын хэт улаан туяаны бүсэд нарийхан эсвэл өргөн хүрээнд флюресцент ялгаралтыг дамжуулах чадвартай. спектр. Эдгээр шүүлтүүрийн хослолууд нь 10, 25, 30, 50 нанометрийн зурвасын өргөнтэй (нарийн, дунд, өргөн өдөөх зурвасыг оруулаад) 510-560 нанометрийн өдөөх хүрээг хамардаг. Гурван хослол нь ижил дихроик толин тусгалыг ашигладаг (565 нанометр), нөгөө гурав нь илүү урт долгионы урттай (570 ба 575 нанометр). Nikon-ийн зургаан ногоон өдөөх шүүлтүүрийн хоёр иж бүрдэл нь 60 ба 75 нанометрийн туузан шүүлтүүрийг агуулдаг.

Шар өдөөлт - Nikon-ийн шар өдөөх флюресцент шүүлтүүрийн багц нь спектрийн улбар шар болон улаан хэсэгт флюресцент ялгаралтыг сонгон дамжуулах чадвартай, нэг тодорхой нэвтрүүлэх зурвас бүхий ялгаруулах (блоклох) шүүлтүүрийг багтаасан хоёр тэнцвэртэй хослолоос бүрдэнэ. Эдгээр нэмэлт шүүлтүүрийн хослолууд нь 40 ба 55 нанометрийн зурвасын өргөнтэй 532-587 нанометрийн өдөөх хүрээг хамардаг. Энэ хоёр хослол нь ижил дихроик толин тусгалыг агуулдаг (595 нанометрийн зүсэлттэй). Nikon-ийн шар өдөөх шүүлтүүрийн хоёр иж бүрдэлд 60 ба 75 нанометрийн туузан дамжуургын шүүлтүүр орно.

Улаан өдөөлт - Nikon-ийн улаан өдөөх флюресцент шүүлтүүрийн хослол нь спектрийн алс улаан болон ойрын хэт улаан туяаны бүсэд флюресцент ялгаруулалтыг сонгон дамжуулах чадвартай зурвасын ялгаруулалт (блоклох) шүүлтүүрийг агуулсан нэг нэгжээр илэрхийлэгддэг. Блоклох шүүлтүүрийн нэвтрүүлэх зурвасын төв нь 700 нанометр, өргөн нь 75 нанометр (663-аас 738 нанометр) юм. 590-аас 650 нм хүртэлх 60 нм өдөөх өргөн зурвас нь улбар шар, улаан долгионы уртыг хамардаг. Cy5 HYQ хослол нь 660 нанометрийн огтлолтой дихроик толин тусгалыг агуулдаг бөгөөд энэ нь өдөөх зурвасын хязгаараас 10 нанометрээр өндөр байна.

Шар флюресцент уургийн (YFP) өдөөлт - YFP-д зориулж Nikon нь урт долгионы урттай GFP хувилбаруудад (YFP) шүүлтүүр ашиглан флюресцент уураг илрүүлэх чадварыг (3 Ногоон Флюресцент уураг (GFP) шүүлтүүрийн иж бүрдэлээр хангагдсан) сайжруулдаг нэг өндөр чанартай, тэнцвэртэй хослолыг боловсруулсан. болон EYFP). YFP HYQ шүүлтүүрийн сан нь сайжруулсан шар флюресцент уургийн (YFP) спектрийн шинж чанарт тохируулан тусгайлан бүтээгдсэн харьцангуй нарийн зурвас бүхий өдөөх болон ялгаруулах (зогсоох) шүүлтүүрийг агуулдаг бөгөөд YFP деривативын флюресцентийг бусад флюресцент уургаас тусад нь үнэлэх боломжийг олгодог.

Хос зурвасын өдөөлт - Nikon-ийн хос зурваст флюресцент шүүлтүүрийн багц нь хоёр флюрофорын ялгаралтыг нэгэн зэрэг сонгон дамжуулдаг хоёр зурваст шүүлтүүр (өдөөх ба ялгаруулах (таслах) шүүлтүүр) -ийн нарийн тэнцвэртэй гурван хослолоос бүрддэг. Шүүлтүүрийн нэгж бүр нь тодорхой флюрохром хостой оновчтой хослуулсан боловч ижил спектрийн шингээлт, ялгаралтын профайлтай бусад хос флюресцент будагтай үр дүнтэй ажиллах боломжтой. Тусгал болон дамжуулах бүсүүдийн хооронд эгц туузан дамжлагын шилжилтийн тусламжтайгаар зурвасын нарийн тохируулгын ачаар янз бүрийн өдөөх болон ялгаруулах дохиог хамгийн бага давхцах хөндлөнгийн оролцоотойгоор тусгаарладаг.

Гурван зурвасын өдөөлт - Nikon-ийн гурван зурваст флюресцент шүүлтүүрүүд нь гурван зурвасын шүүлтүүр (өдөөх ба ялгаруулах (блоклох) шүүлтүүр) зэрэг гурван флюрофорын флюресцент ялгаралтыг нэгэн зэрэг сонгон дамжуулдаг хоёр тэнцвэртэй блокоор төлөөлдөг. Шүүлтүүрийн нэгж бүрийг гурван фторохромын тодорхой багцтай оновчтой хослуулсан боловч ижил спектрийн шингээлт, ялгаралтын профиль бүхий бусад будагч бодисуудтай үр дүнтэй ажиллах боломжтой. Тусгал болон дамжуулах бүсүүдийн хооронд эгц зурвас хоорондын шилжилтийн тусламжтайгаар нарийн зурвасын тохируулгын ачаар янз бүрийн өдөөх болон ялгаруулах дохиог тэдгээрийн хооронд хамгийн бага хөндлөнгийн оролцоотойгоор тусгаарладаг. Гурвалсан шоо.

HYQ Cubes - Nikon-ийн HYQ флюресценцийн шүүлтүүрийн хослолууд нь нарийн тэнцвэртэй, өндөр чанартай дөрвөн блоктой бөгөөд тус бүр нь хязгаарлагдмал хүрээнд флюресценцийг сонгон дамжуулах зурвасын дамжуулалтын ялгаруулалт (блоклох) шүүлтүүрийг агуулсан байдаг. HYQ шүүлтүүрийн тэмдэглэгээ бүр нь түүний зохион бүтээсэн фторохромын нэрийг тусгасан боловч өдөөх хязгаарын хүрээнд хослол бүрийг өөр өөр флюрохромыг харгалзах шинж чанартай ажиглахад ашиглаж болно.

Nikon флюресцент шүүлтүүрийн үндсэн жагсаалт

Nikon-ийн нэрлэх конвенцууд нь 1990-ээд оны эхээр гарч ирсэн холимог нэр томьёо дээр суурилдаг. Тухайн үед Nikon-ийн нэмэлт шүүлтүүрийн бүх хослолыг хатуу бүрэх аргаар үйлдвэрлэдэг байсан бол өнөөдөр зөөлөн бүрэх дэвшилтэт аргуудыг ашиглан олон шүүлтүүр үйлдвэрлэж байна. Хэдийгээр зөөлөн бүрээс нь чийгшил, халуунд илүү мэдрэмтгий бөгөөд илүү болгоомжтой харьцах шаардлагатай (хатуу бүрээстэй харьцуулахад) илүү өндөр оптик нягтралыг харуулдаг бөгөөд тусгай зурвасын өргөнийг нарийн тохируулахад илүү хялбар болгодог. Nikon шүүлтүүрийн хослолуудын тухай ойлголт нь тодорхой флюорофоруудад шаардлагатай шүүлтүүрийг хурдан сонгох боломжийг олгодог.

Nikon-ийн үсэг тоон тэмдэглэгээний системийн эхний үсэг нь өдөөх спектрийн мужийг заадаг (жишээлбэл, UV, V, B, G нь "ultriviolet" - хэт ягаан туяа, "violet" - violet, "blue" - цэнхэр гэсэн англи үгсийн товчлол юм. , ба "ногоон" - тус тус ногоон). Өдөөлтийн спектрийн кодчилолын дараах тоо нь өдөөх шүүлтүүрийн зурвасын өргөнийг заана: 1 нь нарийн зурвасын өдөөлт, 2 нь дунд зурвасын өдөөлт, 3 нь өргөн зурвасын өдөөлттэй тохирч байна. Эцэст нь, өдөөх зурвасын өргөнтэй тохирох тооны дараах нэг буюу хэд хэдэн үсэг нь блоклох шүүлтүүрийн шинж чанарыг илтгэнэ. А үсэг нь хамгийн бага таслах долгионы урттай стандарт өргөн зурвасын таслах шүүлтүүрийг, B нь илүү өндөр таслах долгионы урттай өргөн зурвасын ялгаралтын шүүлтүүрийг заана. Туузан дамжуулалтын ялгаруулалтын шүүлтүүр дэх E (англи хэлнээс "сайжруулсан" - сайжруулсан) гэсэн тэмдэглэгээ нь тусгаарлагдсан дохионы хөндлөнгийн харилцан үйлчлэлийг багасгах утгаараа гүйцэтгэл сайжирч байгааг харуулж байна. E/C тэмдэглэгээ нь DAPI, FITC, TRITC, Texas Red зэрэг тусгай будагч бодисуудтай ажиллахад зориулагдсан зөөлөн хөндлөнгийн бүрээсийн хослолыг заана.

ГЛЮМИНЕСЦЕНЦИЙН МИКРОСКОПИ(Латин lumen, luminis _ гэрэл; Грек, mikros small + skopeo авч үзэх, судлах; syn. флюресцент микроскоп) - бичил биетэн, эс, эд эс эсвэл тэдгээрийг бүрдүүлдэг бие даасан бүтцийн анхдагч эсвэл хоёрдогч гэрэлтэлтийг ажиглах боломжийг олгодог микроскопийн арга. Luminescence (харна уу) нь үзэгдэх гэрлийн богино долгионы (цэнхэр-ягаан) хэсэг эсвэл харагдах гэрлийн ойролцоо долгионы урттай хэт ягаан туяагаар өдөөгддөг. Гэрэлтэлтийн өнгө, өөрөөр хэлбэл, ялгарах гэрлийн долгионы урт нь үүнээс хамаарна. химийн бүтэцмөн микроскопийн объектын физик-химийн төлөв байдал, энэ нь микробиологийн болон цитологийн оношлогооны зорилгоор эсийн бие даасан бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг ялгахад ашиглах боломжийг олгодог. Анхдагч гэрэлтэх нь олон тооны биологийн шинж чанартай байдаг идэвхтэй бодисууд, үнэрт амин хүчил, порфирин, хлорофилл, А, В2, В1 витамин, зарим антибиотик (тетрациклин) болон химийн эмчилгээний бодисууд (акрихин, риванол). Хоёрдогч буюу өдөөгдсөн гэрэлтэлт нь микроскопийн объектуудыг флюресцент будагч бодисоор эмчилсний үр дүнд үүсдэг. Эдгээр будагч бодисуудын зарим нь эсэд тархсан байдаг (жишээлбэл, флуоресцеин), зарим нь эсийн тодорхой бүтцэд эсвэл бүр зарим химийн бодисуудтай сонгомол байдлаар холбогддог. бодисууд. Флюрохромыг сонгон будах чадвар нь флюресцент цитологи хийх боломжийг олгодог. болон флюресцент цитохими. судалгаа.

L. m-ийн хөгжлийн түүхэнд техникийг сайжруулахтай холбоотой хэд хэдэн үе шат байдаг.

1) А.Кёлерийн гэрэлтэгч микроскоп үүсгэх үндсэн боломжийн нотолгоо; 2) 1911 онд Оросын ургамал судлаач М.С.Цвет хлорофилийн гэрэлтэлтийг судлахад ашигласан гэрэлтэгч микроскопыг бүтээсэн. ургамлын эсүүд; 3) тодорхой эсийн бүтцийг сонгон холбодог фторохромын өндөр шингэрүүлсэн уусмалыг ашиглах [Гайтигер (М. Хайтигер, 1933-1935)], мөн бүхнээс илүү акридин жүрж [Haitinger, S. Strugger, 1940]; 4) интерференцийн цацрагийг хуваах хавтанг ашиглан микроскопын линзээр дамжин туссан гэрлээр гэрэлтэлтийг өдөөх аргыг боловсруулах (Е. М. Брумберг ба Г. Н. Крылова, 1953), энэ зарчимд суурилсан гэрлийн микроскоп, төхөөрөмжийг дотоодын үйлдвэрлэл (ML). -1, ML -2, OI-17); 5) микробиологи, дархлаа судлал болон анагаах ухааны биологийн бусад салбарт өргөн хэрэглэгддэг иммунофлуоресценцийн аргыг бий болгох (үзнэ үү). судалгаа [Koons (A. N. Goons), 1942, 1950].

ЗХУ-д анагаах ухаан, биологийн анагаах ухааныг хөгжүүлэх, түгээхэд ихээхэн хувь нэмэр оруулсан. M. N. Meisel-ийн хийсэн судалгаа.

LM-ийг хийхийн тулд тусгай гэрэлтэгч микроскоп эсвэл ердийн биол микроскопуудын хавсралтыг ашигладаг бөгөөд энэ нь бичил биетийн гэрэлтэлтийг ажиглахад ашиглах боломжийг олгодог (Микроскопыг үзнэ үү). Флюресцент микроскопуудын загвар нь зарим физик дээр суурилдаг гэрэлтэлтийн хуулиуд. Үүний нэг нь Стоксын хууль бөгөөд түүний дагуу люминесценцийн спектрийн дээд хэмжээ нь сэтгэл хөдөлгөм гэрлийн спектртэй харьцуулахад урт долгионы муж руу шилждэг. Энэ нь гэрэлтэлтийг өдөөдөг богино долгионы гэрлийн цацрагийг (хэт ягаан, хөх ягаан) урд талд байрлуулсан сэтгэл хөдөлгөм гэрлийн шүүлтүүрээр ялгаруулдаг лазер микроскопийн хувьд хөндлөн гэрлийн шүүлтүүрийн зарчмыг ашиглах боломжтой болгодог. микроскоп гэрэлтүүлэгч. Мансууруулах бодисоор дамжин өнгөрсний дараа гэрэлтэх нь өдөөгдөж, энэ гэрэл нь илүү урт долгионы гэрлийг дамжуулдаг блоклох шүүлтүүрээр бүрэн шингэдэг.

Люминесценцийн микроскоп нь гадаргуугийн өндөр гэрэлтүүлэг бүхий хүчирхэг гэрэлтүүлгийн эх үүсвэрээр тоноглогдсон бөгөөд хамгийн их ялгаралт нь харагдах спектрийн богино долгионы бүсэд байдаг гэрлийн шүүлтүүрийн систем, түүнчлэн хөндлөнгийн цацрагийг задлагч хавтан (эсвэл ийм ялтсуудын багц) туссан гэрлээр люминесценцийг өдөөхөд ашигладаг. Гэрийн гэрэлтэгч микроскопуудад ашигладаг тунгалаг гэрэлтүүлэгчээр дамжуулан гэрэлтэлтийг өдөөх энэхүү систем. сүүлийн үедгадаадын компаниудын үйлдвэрлэсэн гэрэлтэгч микроскопуудад) хэд хэдэн чухал давуу талтай: 1) диэлектрикийн давхарга бүхий хөндлөнгийн цацрагийг хуваах хавтан нь дээжинд гэрэлтэлтийг өдөөдөг гэрлийн 90 гаруй хувийг сонгон тусгаж, бараг бүхэлд нь тусгадаг. илүү урт долгионы гэрэлтдэг гэрлийг дамжуулдаг бөгөөд энэ нь гэрэлтүүлэгчийн тод байдлыг нэмэгдүүлэх боломжтой болгодог; 2) микроскопын линз нь нэгэн зэрэг гэрэлтүүлгийн системийн конденсатор болж үйлчилдэг; иймээс өндөр томруулдаг өндөр диафрагмын дүрэх объектуудыг ашиглах үед бэлтгэлийн гэрэлтүүлэг, үүний дагуу гэрэлтэлтийн тод байдал нь объектив диафрагмын дөрөв дэх хүчин чадалтай пропорциональ хэмжээгээр нэмэгддэг; 3) микроскопын конденсатороор доороос гэрэлтүүлэх үед флюресцент микроскопийг фазын тодосгогч болон интерференцийн микроскоптой хослуулж болно. LM-ийн гэрэлтүүлгийн эх үүсвэр нь ихэвчлэн хэт өндөр даралттай мөнгөн ус-кварцын чийдэн, мөн ксенон чийдэн, кварц-галоген улайсгасан чийдэн юм. Массын өнгөт оптик шилийг гэрлийн шүүлтүүр болгон ашигладаг, эсвэл илүү сайн спектрийн шинж чанартай интерференцийн шүүлтүүрийг ашигладаг.

LM-ийн үед гэрэлтэлтийг өдөөхийн тулд цацраг нь маш хүчтэй, монохроматик байдаг оптик квант генераторууд-лазеруудыг бас ашигладаг. Энэ тохиолдолд сэтгэл хөдөлгөм гэрлийн шүүлтүүр ашиглах шаардлагагүй болно.

Спектрийн урт долгионы хэт ягаан туяа, хөх ягаан, заримдаа ногоон хэсгүүдийг ихэвчлэн гэрлийн микроскоп, ердийн шилэн оптик, ердийн шилэн слайд, бүрхүүлд гэрэлтэлтийг өдөөхөд ашигладаг тул спектрийн энэ хэсэгт цацраг туяа дамжуулдаггүй. өөрийн гэрэлтэх чадвартай, гэрэлтдэг микроскопод ашигладаг. Усанд живүүлэх, хамгаалах хэрэгсэл нь эдгээр шаардлагыг хангасан байх ёстой.

Буферийг мансууруулах бодисыг хадгалах хэрэгсэл болгон ашиглаж болно. глицерин уусмал, түүнчлэн гэрэлтдэггүй полимер (полистирол, поливинил спирт гэх мэт).

Гэрэлтэгч микроскопийн дүрсийг нүдээр үнэлэхийн зэрэгцээ микро фотографи ашигладаг (Микрофотографийг үзнэ үү). Гэрэлтэгч микрофотограф нь хэд хэдэн онцлог шинж чанартай байдаг. Нэг талаас, гэрэлтүүлгийн хангалтгүй гэрэлтүүлэг нь удаан хугацаагаар өртөх шаардлагатай байдаг, нөгөө талаас, сэтгэл хөдөлгөм гэрлийн нөлөөн дор гэрэлтэх эрч хүч хурдан буурч, бэлдмэлүүд бүдгэрч, амьд эсүүд гэмтэж, үхдэг тул үүнийг бүртгэх боломжгүй байдаг. эсэд тохиолддог үйл явцын динамик. Эдгээр бэрхшээлийг даван туулахын тулд ерөнхий болон сонгомол спектрийн өндөр мэдрэмжтэй гэрэл зургийн материал, өндөр диафрагмын линз, хамгийн бага дотоод томруулдаг нүдний шил, объектын дэлгэрэнгүй мэдээллийг дамжуулахад хангалттай, жижиг форматтай микрофото хавсралтуудыг ашиглах шаардлагатай. Бэлдмэлийг бүдгэрэлтийг бууруулдаг бодисоор эмчлэх боломжтой (гидрохинон гэх мэт).

M. Ya Korn болон M. M. Butlov нар. (1968) электрон-оптик гэрэлтүүлэгч өсгөгч ашиглан өнгөт гэрэлтэгч микрофото зураг авалт, зураг авалтын төхөөрөмж, техникийг боловсруулсан бөгөөд энэ нь өртөлтийг хэд хэдэн дарааллаар бууруулж, амьд эсэд тохиолддог үйл явцын динамикийг бүртгэх боломжийг олгодог.

Бичил биетийн бүтцийн гэрэлтэх эрчмийг тоон байдлаар бүртгэхийн тулд цитофлюориметри - голчлон фотоэлектрик аргыг мэдрэмтгий бичлэгийн төхөөрөмж болгон фото үржүүлэгч хоолойг (PMT) ашиглан ашигладаг (Фото үржүүлэгчийг үзнэ үү). Тэд мөн спектрийн тодорхой хэсэг дэх эсүүд болон тэдгээрийн бүтцийг гэрэлтүүлэх эрчмийг бүртгэх аргыг ашигладаг - цитоспектрофлуориметри. Цитофлюориметрийн шингээлтийн цитофотометрээс давуу тал нь түүний өндөр мэдрэмжтэй, эсийн бүтэц дэх бодисын тархалтын шинж чанар нь хэмжилтийн үр дүнд нөлөөлдөггүй явдал юм.

Бичил биетүүдийн гэрэлтэлтийг тоон хэлбэрээр бүртгэх сонголтуудын нэг бол импульсийн цитофлуориметрийн арга (урсгалын цитофлюориметр) ба эсийг гэрэлтэгч шинж чанарын дагуу "ангилах" арга юм. Эдгээр аргууд нь минутанд хэдэн арван мянган эсийн гэрэлтэлтийн эрчмийг шинжилж, гэрэлтэлтийн шинж чанарын дагуу тэдгээрийг салгах боломжийг олгодог. Микрообъектуудыг гэрэлтүүлэх судалгааны аргуудын дотроос хамгийн өргөн хэрэглэгддэг нь шууд флюрохромжуулалт - фторохромын будалт ба иммунофлуоресценц юм.

Дотоодын үйлдвэрлэл нь микроскопийн төрөл бүрийн төхөөрөмж үйлдвэрлэдэг хамгийн өргөн хэрэглэгддэг микроскоп бол хэд хэдэн хувилбараар үйлдвэрлэгдсэн ML-2 юм. "Лумам" цуврал флюресцент микроскоп, кварцын галоген чийдэн бүхий флюресцент гэрэлтүүлэгч (OI-28, OI-30) үйлдвэрлэгддэг.

"Лумам" цувралын микроскопууд нь нэгдмэл хэсгүүдээс бүрдэх бөгөөд тэдгээрийн янз бүрийн хослолууд нь гурван ажлын загвар (P1 - RZ) ба гурван судалгааны загвар (I1 - I3) авах боломжтой бөгөөд тохиргоо, ашиглалтын боломжоороо бие биенээсээ ялгаатай ( Зураг).

OI-28 ба OI-30 гэрэлтүүлэгчийг ердийн биологийн микроскоп дээр суурилуулсан; тэдгээр нь үзэгдэх гэрэлтэлтийг өдөөдөг гэрэл бүхий тунгалаг нүхээр дамжуулан объектуудыг дээрээс нь гэрэлтүүлэхэд зориулагдсан.

OI-30 гэрэлтүүлэгч нь иж бүрдэлд контакт линз оруулдгаараа онцлог юм.

L. m нь вирус судлал, микробиологи, гематологи, шаантаг, цитодиагностик (ялангуяа хорт хавдрын эсийг илрүүлэх), цитогенетикт хромосомыг судлахад өргөн хэрэглэгддэг. Энэ зорилгоор акридин жүржийн фторхромыг удаан хугацаанд хэрэглэж ирсэн; Фторохром этидиум бромид (этидиум бромид) ба пропидиум иодид (припидиум иодид) нь голчлон ДНХ-ийн цитофторометрийн шинжилгээнд, мөн Фейлгений урвалын гэрэлтэгч хувилбаруудад ашиглагддаг. Энэхүү фторхромоор үүсгэгдсэн хоёр хэлхээтэй ДНХ бүхий цогцолборууд нь ногоон гэрэлтдэг, РНХ ба нэг хэлхээтэй ДНХ-тэй цогцолборууд нь улаан гэрэлтдэг тул нуклеопротейнүүдийн гэрэлтдэг микроскопод акридин жүрж өргөн тархсан. Люминесцент цитохимийн аргуудыг бас мэддэг. уураг ба липидийг тодорхойлох арга. Эс дэх уургийн нутагшуулалтын чанарын болон тоон судалгаанд процион будагч бодис, флуорескамин, липид - 3,4-бензпирен, фосфин ZR гэх мэт Тетрациклин ба түүний деривативуудыг ясны эд, зарим өөрчлөлтийг гэрэлтүүлэх микроскопоор судлахад ашигладаг. хорт хавдрын үед эсэд.

L. m тогтмол бэлдмэлийг шууд фторохромжуулахтай хослуулан бактериоскопийн оношлогоонд хүчилд тэсвэртэй микобактер, гонококк, сахуу, хумхаа өвчний үүсгэгчийг цусны т рхэцээс илрүүлэхэд ашигладаг. уламжлалт будгийн аргуудад (жишээлбэл, Ziehl-Neelsen будалт). Фторхром бүрэх нь ариун цэврийн бактериудад бас ашиглагддаг. ус, хөрсөн дэх бичил биетнийг илрүүлэх, тоолох судалгаа. Флюресцент микроскопийн оношлогооны аргуудын нэг нь богино хугацааны өсөлт, флюрохромжилтын дараа мембран шүүлтүүр дээр микроколони илрүүлэх явдал юм.

1940 онд Струггер амьд ба үхсэн бактерийг ялгахын тулд акридин жүрж хэрэглэхийг санал болгосон боловч дараагийн судалгаагаар найдвартай байдал хангалтгүйэнэ арга. Үүнтэй холбогдуулан эсийн амьдрах чадварыг (ялангуяа цитотоксик хүчин зүйлд өртөх үед) тодорхойлохын тулд флуоресцеин диацетат эсвэл түүний этидиум бромидтой хослуулан хэрэглэдэг. Флуоресцеины гэрэлтдэггүй эфир нь амьдрах чадвартай эсийн эстеразагаар задарч, тод гэрэлтдэг ногоон флуоресцеин ялгаруулж, этидиум бромид нь зөвхөн үхсэн эсүүдэд улаан гэрэлтэлтийг үүсгэдэг.

Физик, химийн судалгаа хийх эсийн мембраны төлөв байдал гэж нэрлэгддэг. гидрофобик флюресцент дээж. Энэ зорилгоор эсийг уусмалд гэрэлтдэггүй бодисоор эмчилдэг боловч эсийн мембраны гидрофобик хэсгүүдтэй холбогдож гэрэлтэж эхэлдэг бөгөөд гэрэлтэлтийн эрч хүч, өнгө нь химийн бодисоос хамаардаг. бүтэц, физик-химийн эдгээр фторхромуудтай холбоотой бүтцийн төлөв байдал. Энэ төрлийн хамгийн түгээмэл бодисуудын нэг бол 1-анилин-S-нафталин сульфоны хүчил (1.8 ANS) юм.

Физик ба химийн судалгаа хийх аргыг ашиглах Янз бүрийн эсийн бүтцэд фторхромтой холбоотой макромолекулуудын төлөвийг туйлширсан флюресцент микроскоп гэж нэрлэдэг.

Микроскопийн шинжилгээний бусад аргуудаас LM-ийн чухал давуу тал нь фторохромын маш бага, хоргүй концентрацийг ашиглан intravital (өнгөт Зураг 1-3) болон supravital fluorochromization хийх боломж юм. Энэ тохиолдолд янз бүрийн фторохромууд нь эсийн янз бүрийн бүтэцтэй холбогдож болно. Жишээлбэл, акридин жүрж нь амьд эсийн лизосомуудад хуримтлагддаг бөгөөд тэдгээр нь улаан гэрлээр флюресцэж эхэлдэг. Фагосом доторх фагоцитозын бактери ижил гэрэлтэлтийг олж авдаг. Тетрациклин нь эсийн митохондри эсвэл тэдгээрийн бактери дахь аналоги ба шар-ногоон гэрлээр холбогддог ба гэрэлтэх эрч хүч (холбогдсон тетрациклиний хэмжээ) нь энэ антибиотикт нянгийн мэдрэмтгий байдлаас хамаарна.

Мөн контакт L. m ашиглан тэдгээрийг судлахын тулд in situ эс, эдийг фторохромжуулах боломжтой.

Лабораторид вирусын флюресцент микроскопийг ашигладаг. эсэд вирусын эсрэгтөрөгчийг тодорхойлох вирусын өвчний оношлогоо, химийн судалгаа. эсийн доторх вирусын нэгдлүүдийн найрлага, вирусын эсрэгтөрөгчийн харьцангуй концентрацийг тодорхойлох ба нуклейн хүчилтодорхой флюресценцийн эрч хүчээр гэх мэт.Судалгааны зорилгоос хамааран т рхэц, хэвлэмэл, эдийн хусах буюу эсийн өсгөвөрийн бэлдмэлийг объект болгон ашигладаг.

Орчин үеийн вирус судлалын хувьд LM-ийн хамгийн түгээмэл хоёр арга нь: 1) нуклейн хүчлийг тодорхойлох, ялгах. вирусын багцхалдвартай эсүүд болон аминоакридин фторхромыг ашиглан цэвэршүүлсэн вирусын суспензүүдэд; 2) иммунофлуоресцент ашиглан вирусын эсрэгтөрөгчийг илрүүлэх.

Аминоакридинуудаас акридин жүржийг ихэвчлэн ашигладаг бөгөөд энэ нь хоёр судалтай нуклейн хүчлийн молекулуудыг (ихэвчлэн ДНХ) ногоон, нэг судалтай нуклейн хүчлийн (ихэвчлэн РНХ) бадмаараг улаан флюресценцийг өгдөг (өнгөт Зураг 4-8). Энэ аргыг уугуул бэлдмэл, ацетон, Карной шингэн гэх мэтээр бэхэлсэний дараа хэрэглэнэ. Будах үр дүн нь фторохромын концентраци (ихэвчлэн 1: 10,000 - 1: 100,000) болон рН-ээс ихээхэн хамаардаг.

Иммунофлуоресценцийн аргыг эс дэх вирусыг тодорхойлох, эсэд вирусын эсрэгтөрөгчийн хуримтлалын динамикийг судлах, вирусын хуримтлалын эсийн доторх нутагшуулалтыг тодорхойлох, вирусын орцын шинж чанарыг тодорхойлох, вирусын эсрэгтөрөгчийн бүтцийг судлах, хоорондоо нягт холбоотой вирусыг ялгах, эсийн өсгөвөрт вирусыг титрлэх, эд, эс дэх хавдрын вирусын эсрэгтөрөгчийг тодорхойлох, вируст өвчний эмгэг жамыг судлах, эсийн өсгөвөрийн вирусын бохирдлыг хянах, хрон, вирусын халдварыг судлах гэх мэт. Энэ аргыг шууд болон шууд бус өөрчлөлтийн аль алинд нь хэрэглэнэ. Судалгааны үр дүнг зөв тайлбарлахын тулд ашигласан эсрэгбие ба тэдгээрийн фторхромтой коньюгатуудын концентраци, цэвэр байдал, эмийг (ихэвчлэн ацетоноор) бэхлэх хугацаа, температур, эсрэгбиемээр эмчлэх зэргийг харгалзан үзэх нь чухал юм. Ихэнх тохиолдолд эсрэгбиеийг шошгонд оруулахын тулд өвөрмөц ногоон туяа өгдөг флуоресцеин изотиоцианат (FITC), улбар шар-улаан өнгөтэй лиссамин-родамин сульфохлорид B 200 зэргийг ашигладаг.

Мөн иммунофлуоресценцийн арга нь эс, эдэд вирусын эсрэгтөрөгчийн эсрэгбие илрүүлэх боломжийг олгодог.

L. m viruss нь салхин цэцэг, герпес, гахайн хавдар гэх мэт халдварыг оношлоход ашиглагддаг. эсрэгтөрөгчийг тодорхойлох эсвэл нуклейн хүчлийн төрлийг тодорхойлох зорилгоор дээрх аргуудыг ашиглан боловсруулсан. Тэр. Томуугийн А2 эсвэл В вирус, параинфлуенза, аденовирус, амьсгалын замын синцитиал вирус эсвэл эдгээр вирүсийн хослолоор үүсгэгдсэн халдварын хооронд ялган оношлох. Өвчтөний материалаар халдвар авсан эсийн өсгөвөрийг LM-ээр оношлох боломжтой. Бүх тохиолдолд эцсийн оношийг L. m өгөгдлийг өвчтөнүүдийн вирусын болон ийлдэс судлалын үр дүнтэй хослуулсан.

Эрхтэн, эд эсийн гэрэлтэгч микроскоп нь тэдгээрийн нэг юм орчин үеийн аргуудхэвийн болон патолийн гистологид ашигласан судалгаа. L. m-ийн гол давуу талууд нь өндөр мэдрэмжтэй (ердийн цито- болон гистохимийн аргуудаас дор хаяж 1000 дахин илүү мэдрэмтгий), хялбар байдаг. тоон хэмжилтянз бүрийн химийн бодисын агууламж. эдийн бүрэлдэхүүн хэсэг ба эсүүд, тоног төхөөрөмжийн хүртээмж. Эрхтэн, эд эсийн гэрэлтүүлгийн хувьд анхдагч ба хоёрдогч гэрэлтэлтийг ашигладаг. Анхдагч гэрэлтэх (эмийг урьдчилан эмчлэхгүйгээр үүсдэг гэрэлтдэг туяа) нь эс, эд эсийг бүрдүүлдэг зарим бодисоор хангалттай эрчимтэй байдаг: витаминууд (В2 витамин нь шар-ногоон гэрэлтэлтийг өгдөг, шүлтлэг уусмал дахь витамин В1 нь трихром болж хувирдаг. Цэнхэр гэрэлтэх, шар-ногоон гэрэлтэй каротин гэрэлтдэг, А витамин, хэт ягаан туяаны спектрт цацраг туяагаар цацруулж, хөх-цагаан гэрэлтдэг), гормонууд (эстроген, адреналин шар-ногоон гэрэлтдэг, серотонин, норэпинефрин, эмийг уураар эмчлэхэд) төвлөрсөн хүхрийн хүчил, тэдгээр нь шар гэрэлтдэг) , липопигментүүд (липофусцин нь улаан гэрэлтэлтийг өгдөг, ceroid - хөхөвтөр) гэх мэт. Анхдагч гэрэлтэлтийн зарчим нь цитохимийн үндэс суурь бөгөөд эсийн янз бүрийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийн (үндсэн уураг) агуулгыг тоон аргаар судлах явдал юм. Хэт ягаан туяанд гэрэлтэх арга.

Бэлдмэлийг фторхромоор эмчлэх замаар эрхтэн, эд эсийн хоёрдогч гэрэлтэлтийг олж авдаг (үзнэ үү). Акридин жүржийг цитол ба гистол бэлдмэлийн хорт хавдрыг оношлоход ашигладаг. Миокардийн шигдээсийн эхний үе шатыг тодорхойлоход ижил будаг хэрэглэдэг (ишемийн хэсгүүд нь ногоон шар өнгийн гэрэлтдэг). Корифосфин ба акридин жүржийг хүчиллэг мукополисахаридыг тодорхойлоход ашигладаг. Гликогенийг тодорхойлохын тулд кофеин 5, родамин зэрэг фторхромыг ашиглаж болно. Фосфин 3P нь липидийг тодорхойлоход ижил зорилгоор кофеины ханасан уусмал дахь 3,4-бензпирений уусмалыг ашигладаг (липидүүд нь хөхөвтөр цагаан гэрэлтдэг). Тиофлавин Т.С амилоид (ногоон гэрэлтэх) толбо үүсгэдэг тул амилоидозын оношлогоонд өргөн хэрэглэгддэг. дотоод эрхтнүүд. Согтууруулах ундааны морин уусмалыг ашиглан эд эс дэх кальцийг тодорхойлно (ногоон гэрэлтэх). Солохромын хар уусмалаар бэлдмэлийг боловсруулахдаа хөнгөн цагаан (шар-улбар шар өнгийн гэрэлтэлт) илрүүлэх боломжтой. Родамин 6G ашиглан уушгинд гадаргуугийн идэвхтэй бодисыг тодорхойлно (улбар шар өнгийн гэрэлтэлт).

Иммунофлуоресценцийн аргыг ашиглан гормон, эсрэгтөрөгч, эсрэгбиемийг илрүүлж болно (өнгөт Зураг 9), төрөл бүрийн бүтээгдэхүүнсолилцох, гистогенийн хувьд боловсорч гүйцээгүй хавдар, янз бүрийн инф. өвчин гэх мэт. Дархлаа судлалын хөгжил нь энэ аргын чадавхийг улам өргөжүүлсэн. Хиймэл гаптен ашиглан эд, эс дэх уураггүй бодисыг тодорхойлох боломжтой болсон.

Ном зүй:Барский I. Ya., Polyakov N. I. and Yakubenas V. A. V. Контакт микроскоп, М., 1976, библиогр.; Ershov F.I. Халдвар авсан эс дэх нуклейн хүчил ба липидийн анхны өөрчлөлтийг Luminescent микроскопоор илрүүлэх, Vopr, virusol., .No 1, p. 3, 1964, библиогр.; 3еленин А.В. Акридины амин деривативуудын эстэй харилцан үйлчлэл, М., 1971, библиогр.; 3 at b-zhitsky Yu N. Гэрэлтүүлэх микроскопийн арга, Л., 1964, библиогр.; К а р-мышева В.Я. Вирус судлалын флюресцент эсрэгбиеийн аргыг хэрэглэх, М., 1979; M e y s e l M. N. Ерөнхий микробиологийн флюресцент микроскопи ба цитохими, номонд: Usp. микробиол., ed. A. A. Imshenetsky, 7-р боть, х. 3, М., 1971; Михайлов I. F. болон Dyakov S. I. Luminescent микроскоп, М., 1961, библиогр.; Струков А.И., Кондратьев В.С. Эмгэг судлалын практикт гэрэлтдэг микроскопийн арга, Арх. pathol., t 28, no 8, p. 77, 1966, библиогр.; Фридман И.А., Кустаров Н.П. Эх барих, эмэгтэйчүүдийн практикт гэрэлтсэн цитологийн судалгаа, Л., 1974, библиогр.; Микробиологи ба дархлаа судлалын автоматжуулалт, ed. C.-G. Hed£n a. T. Illeni, N. Y., 1975; Умайн хорт хавдрын цитологийн автоматжуулалт, ed. G. L. Wied a.o., Чикаго, 1976; s-хүнтэй T. a.o. Метафазын цөмийн зохион байгуулалтыг судлах ДНХ-тэй холбох фтор-хромууд, Exp. Cell Res., v. 58, х. 141, 1969; Эсийн биологи дахь флюресценцийн техник, ed. A. A. Thaer a. M. Sernetz, N.Y., 1973; Vaillier J. a. Vaillier D. Гидрофобик флюресцент датчик, l-anilino-8-naph-thalene sulfonate, Clin-ийн тусламжтайгаар тимус эсийн дэд популяцийн шинж чанар. exp. Иммунол v. 30, х. 283, 1977.

М.Я Корн; В.А.Варшавский (пат. ан.), Я.Е.Кхесин (вир.).

) — гэрлийн (оптик) микроскоп ашиглан флюресцент бичил биетийг илрүүлэх арга. Материалын шинжлэх ухаан, биоанагаахын салбарт өргөн хэрэглэгддэг.

Тодорхойлолт

Биологийн материалДүрмээр бол өөрөө маш сул флюресцент үүсгэдэг боловч эд эсийн янз бүрийн бүтэц, бүтцийг тусгайлан будах чадвартай тод, олон янзын флюресцент молекулуудыг (флюрофор) ашигласны ачаар флюресцент микроскопийн арга нь биоанагаахын шинжлэх ухаанд маш үнэ цэнэтэй болох нь батлагдсан. .

Уламжлалт флюресцент микроскопийн аргууд нь эсвэл харьцуулахад хамаагүй бага нарийвчлалтай байдаг. Гэсэн хэдий ч сүүлийнхээс ялгаатай нь оптик микроскоп нь зөвхөн суурин төдийгүй амьд организмын эсүүд, тэр ч байтугай жижиг организмуудын дотоод бичил бүтцийг ажиглах боломжийг олгодог. Үүний ачаар флюресценцийн микроскоп нь организмын үйл ажиллагааны механизмыг эсийн, дэд эс, эсэд судлах хамгийн сайн арга юм. молекулын түвшин.

Флюресцент микроскоп нь флюрофорыг өдөөдөг гэрлийн эх үүсвэрээс бүрдэнэ; флюрофорын цацрагийг бүртгэх детектор; гэрлийг төвлөрүүлж, объектыг томруулдаг оптик систем. Э.Аббегийн сонгодог бүтээлүүдийн дагуу линз ашиглахад суурилсан оптик системийн нарийвчлал нь гэрлийн дифракцийн шинж чанараар хязгаарлагддаг. Хоёр объектыг ялгах хамгийн их зай ( г), гэрлийн долгионы урт, линзний өнцгийн нүх, орчны хугарлын илтгэгчээр тодорхойлогддог. n:

Учир нь ихэвчлэн n < 1,56, < 70 o , а длина волны используемого излучения находится в диапазоне 350–600 нм, то лучшее разрешение традиционных составляет более 200 нм в фокусной плоскости и более 450 нм вдоль оптической оси.

20-21-р зууны эхэн үед флюресценцийн микроскопийн эрчимтэй хөгжил нь шинэ аргууд, түүнчлэн оптик нарийвчлалын дифракцийн саадыг даван туулах, урьд өмнө хэзээ ч байгаагүй нано нягтралд хүрэх боломжийг олгосон хэд хэдэн арга барилыг бий болгоход хүргэсэн. ().

Зохиогч

• Борисенко Григорий Геннадьевич

Эх сурвалжууд

1. Kassens M. et al. Гэрлийн микроскоп ба дүрслэлийн үндэс. - GIT Verlag GmbH & Co. KG, 2006. - 52 х.
2. Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der Mikroskopischen Wahrnehmung // Arch. Микроск. Анат. Entwicklungsmech. 1873. Бд. 9. S. 413–468.

Цагаан будаа. 1. Эпи-флюресцент микроскоп

Уламжлалт тодосгогч бодис бүхий оптик микроскопоор хүрэхэд хэцүү хэд хэдэн онцлог шинж чанаруудын улмаас флюресцент микроскоп нь биологийн болон биоанагаахын судалгаа, материал судлалын аль алинд нь чухал хэрэгсэл болсон. Флюрохромуудын багцыг ашигласнаар флюресцент бус бодисоос өндөр өвөрмөц эсүүд болон микроскопийн доорх эсийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг тусгаарлах боломжтой болсон. Флюресценцийн микроскопоор үнэндээ бие даасан молекулуудыг ч илрүүлж болно. Флюресцент олон будгийг ашиглан янз бүрийн будагч бодисууд нь олон зорилтот молекулуудыг нэгэн зэрэг тодорхойлох боломжтой. Флюресцент микроскопын орон зайн нарийвчлал нь дээжийн өвөрмөц шинж чанараас хамаардаг дифракцийн хязгаараар хязгаарлагддаг боловч энэ хязгаараас доогуур флюресцент молекулуудыг илрүүлэх бүрэн боломжтой.

Олон дээж нь цацраг туяагаар (фторхром ашиглахгүйгээр) автофлуоресценцийг харуулдаг бөгөөд энэ үзэгдэл нь ургамал судлал, петрологи, хагас дамжуулагчийн үйлдвэрлэлд өргөн хэрэглэгддэг. Үүний эсрэгээр, амьтны эд эс эсвэл эмгэг төрүүлэгч организмыг судлах нь ихэвчлэн маш сул эсвэл эсрэгээр хүчтэй өвөрмөц бус автофлуоресценцээр төвөгтэй байдаг. Энэ тохиолдолд илүү чухал зүйл бол тодорхой долгионы уртад өдөөгдөж, шаардлагатай эрчимтэй гэрэл ялгаруулдаг фторхромыг (эсвэл флюорофорыг) эдэд нэвтрүүлэх явдал юм. Фторхромууд нь харагдахуйц эсвэл үл үзэгдэх бүтцэд бие даан наалддаг будагч бодисууд бөгөөд зорилтот чиглэлд өндөр сонгомол, өндөр квантын гарцтай байдаг (ягарсан гэрэл шингэсэн фотоны тоонд харьцуулсан харьцаа). Флюресценцийн микроскопийн хэрэглээний хурдацтай өсөлт нь тусгай өдөөлт, ялгаралтын эрчмтэй, өгөгдсөн биологийн зорилтод "онилогдсон" шинэ синтетик болон байгалийн флуорофорууд гарч ирсэнтэй нягт холбоотой юм.

Өдөөлт ба ялгаруулалтын үйл явцын үндэс

Зураг 1-д дамжуулсан болон ойсон гэрлийн аль алинд нь ажиглалт хийхэд зориулагдсан орчин үеийн эпифлуоресценцийн микроскопын бүдүүвч хөндлөн огтлолыг үзүүлэв. Төв хэсэгт байрлах босоо гэрэлтүүлэгч нь нэг төгсгөлд гэрлийн эх үүсвэртэй (диаграммд эпископийн модуль гэж заасан), нөгөө талдаа шүүлтүүрийн хавсралттай байна. Энэхүү загвар нь туссан гэрлийн долгионы урт нь өдөөх долгионы уртаас их байдаг микроскоп дээр суурилдаг. Ойсон гэрлийн флюресцент микроскопийн босоо гэрэлтүүлэгчийн зохиогч нь Йохан С.Плоем гэж тооцогддог. Сонгомол өдөөх шүүлтүүрээр дамждаг нуман чийдэн эсвэл бусад эх үүсвэрийн олон давтамжийн гэрлийг флюресцент босоо гэрэлтүүлэгчээр тодорхой долгионы урттай (эсвэл өгөгдсөн долгионы интервалд) ихэвчлэн хэт ягаан, хөх, ногоон хэсгүүдээс гэрэл болгон хувиргадаг. спектрийн. Өдөөлтийн шүүлтүүрээр дамжсан урсгал нь дихромат (мөн дихроик гэж нэрлэдэг) толин тусгал эсвэл цацраг задлагчийн гадаргуугаас тусгаж, объективээр дамжин дээжийг хүчтэй гэрлээр гэрэлтүүлдэг. Хэрэв дээж нь флюресцэж байвал объектив цуглуулсан гэрэл дахин дихроик толин тусгалаар дамжин өнгөрч, дараа нь өдөөх долгионы уртад гэрлийг блоклодог (эсвэл ялгаруулах) шүүлтүүрээр шүүдэг. Оптик микроскопийн цорын ганц горим бол флюресценц бөгөөд дээж нь цацрагийн дараа өөрийн гэрлийг ялгаруулдаг. Цацраасан гэрлийн эх үүсвэрийн байршлаас үл хамааран бүх чиглэлд бөмбөрцөг хэлбэрээр дахин ялгардаг.

Эпифлуоресценцийн гэрэлтүүлэг нь орчин үеийн микроскопийн зонхилох арга юм. Босоо ойсон гэрлийн гэрэлтүүлэгч нь ажиглалтын хоолой ба линзний эргэдэг толгойн хооронд байрладаг. Гэрэлтүүлэгч нь зураг руу очих зам болон дээжээс гарах өдөөх гэрэл нь микроскопын ижил объектоор дамждаг байхаар зохион бүтээгдсэн бөгөөд энэ тохиргоонд эхлээд конденсатор болж, буцах зам дээр ялгарах флюресцент гэрлийг цуглуулдаг. Энэ төрлийн асаагуур нь хэд хэдэн давуу талтай байдаг. Флюресценцийн микроскопын линз нь нэгдүгээрт, сайн тохируулсан конденсатор, хоёрдугаарт, дүрс үүсгэх гэрэл цуглуулах төхөөрөмжийн үүрэг гүйцэтгэдэг. Ижил бүрэлдэхүүн хэсэг болох линз/конденсатор нь үргэлж төгс нийцдэг. Дээжинд хүрч буй өдөөх гэрлийн ихэнх хэсэг нь харилцан үйлчлэлгүйгээр дамжин өнгөрч, объект руу буцаж ирдэггүй бөгөөд гэрэлтүүлсэн хэсэг нь нүдний шилээр (ихэнх тохиолдолд) ажиглагддаг дээжийн хэсэгт хязгаарлагддаг. Хэрэв микроскопыг Көллерийн гэрэлтүүлэгт зориулж зөв тохируулсан бол зарим тодосгогчийг сайжруулах аргуудаас ялгаатай нь объектив линзний бүрэн тоон нүхийг ажиглах боломжтой. Нэмж дурдахад энэ нь дамжуулсан болон ойсон гэрлийн ажиглалтын горим, дижитал дүрс үүсгэх горимыг хослуулах эсвэл тэдгээрийн аль нэгийг сонгох боломжийг олгодог.

Цагаан будаа. 2. Флюресцент шүүлтүүр

Дикроик толинд хүрч буй тархсан өдөөх гэрлийн ихэнх хэсэг нь гэрлийн эх үүсвэрт буцаж тусдаг боловч багахан хэсэг нь толины дотоод бүрхүүлээр дамжин өнгөрч эсвэл шингэж болно. Гэхдээ ялгарсан флюресцент нь нүдний шил эсвэл детекторт хүрэхээс өмнө блоклох эсвэл татгалзах шүүлтүүрээр дамжин өнгөрөх ёстой. Ихэнх ойсон гэрлийн гэрэлтүүлэгч нь өдөөх шүүлтүүр, дихроик толь, зогсоох шүүлтүүрийг 2-р зурагт үзүүлсэн шиг оптик нэгж (ихэвчлэн шоо гэж нэрлэдэг) болгон нэгтгэдэг. Орчин үеийн флюресцент микроскопууд нь дөрвөөс зургаан шүүлтүүр шоо (ихэвчлэн тойруулга эсвэл шургуулга дээр) багтаах боломжтой. хавсралт).

Босоо гэрэлтүүлэгчийн загвар нь хэрэглэгчдэд микроскопыг Köller-ийн гэрэлтүүлэгт тохируулах боломжийг олгох ёстой бөгөөд энэ нь бүх харах талбарт тод, жигд гэрэлтүүлгийг өгдөг. Оптик системийн залруулсан конденсатор линз нь төвлөрсөн диафрагмын дүрсийг фокусын линзний арын нүхтэй нийцүүлэхийг баталгаажуулдаг. Орчин үеийн гэрэлтүүлэгчийн хувьд урьдчилан төвлөрсөн, төвлөрсөн талбайн диафрагмын дүрс нь нүдний шилний тогтмол диафрагмын төвлөрсөн дүрс ба хавтгайтай нийлдэг.

Гэрэлтүүлгийн чийдэнгийн хэсэг нь ихэвчлэн хэт улаан туяаны гэрлийг хаадаг зогсоох шүүлтүүр агуулдаг. Дэнлүүний хэсэг нь өөрөө хэт ягаан туяаг гадагш дамжуулах ёсгүй. Ашиглалтын явцад нээгдэх тохиолдолд суурилуулсан таслууртай байх нь зүйтэй юм. Дэнлүүний нэгж нь үйл ажиллагааны явцад нуман чийдэнгийн болзошгүй дэлбэрэлтийг тэсвэрлэх хангалттай хүчтэй байх ёстой. Орчин үеийн чийдэнгийн төхөөрөмжүүдийн хувьд чийдэнгийн залгуур нь нуман чийдэнгийн дүрсийг линзний арын нүхэнд төвлөрүүлэхийн тулд тохируулагч товчлууруудаар тоноглогдсон байдаг (Келлерийн гэрэлтүүлгийн дор эдгээр онгоцууд нэгддэг). Дээжийг ажиглаагүй тохиолдолд өдөөх гэрлийг бүрэн хаахын тулд гэрлийн замд, ихэвчлэн чийдэнгийн нэгжийн ойролцоо боловч өдөөх шүүлтүүрийн өмнө хаалтыг байрлуулахыг зөвлөж байна. Нэмж дурдахад гэрэлтүүлэгчийн төхөөрөмж нь сэтгэл хөдөлгөм гэрэлтүүлгийн эрчмийг багасгахын тулд төвийг сахисан нягтын шүүлтүүрийг (бөмбөр, тойруулга эсвэл эвхэгддэг төрлийн хавсралт) агуулсан байх ёстой.

Стоксын шилжилт

Флуорофорын ялгаралтын оргил эрчим нь ихэвчлэн түүний шингээлтийн оргил эрчмээс бага байдаг ба илүү урт долгионы урттай үед тохиолддог. Ялгарлын муруй (спектрийн муруй) нь ихэвчлэн өдөөх муруйны толин тусгал дүрс (эсвэл үүнтэй ойролцоо) байдаг боловч 3-р зурагт үзүүлсэн шиг урт долгионы урт руу шилжсэн бөгөөд энэ нь Alexa Fluor 555 будгийн ашигтай спектрийн шинж чанарыг харуулж байна. шар-ногоон, шар-улбар шар бүсэд ялгардаг. Флюресценцийн хамгийн их эрчмийг бий болгохын тулд флюрофорыг (ихэвчлэн будагч бодис гэж нэрлэдэг) өдөөх муруйн оргилд ойрхон эсвэл ойролцоо долгионы уртад өдөөгдөж, ялгарах гэрлийг ялгаралтын оргилыг багтаасан хамгийн өргөн хүрээнд илрүүлдэг. Сэтгэл хөдөлгөм ба ялгарах долгионы уртыг сонгохдоо хөндлөнгийн шүүлтүүр ашиглан гүйцэтгэнэ (Зураг 2). Нэмж дурдахад микроскопын оптик системийн спектрийн шинж чанар нь шилний дамжуулалт (энэ нь тусгалын эсрэг бүрхүүлд нөлөөлдөг), линз ба толины тоо, мэдрэгчийн мэдрэмжээс хамаардаг гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй.

Цагаан будаа. 3. Флюорофорын шингээлт ба ялгаралтын муруй

Спектрийн хэт ягаан туяа, үзэгдэх болон ойрын хэт улаан туяаны бүсэд тодорхой долгионы урттай гэрлийг хааж, эсвэл эсрэгээр дамжуулдаг гэрлийн шүүлтүүрийг зөв сонгосноор өдөөлт ба ялгаралтын долгионы уртыг ялгах, бүртгэх үр ашгийг флюресценцийн микроскопоор олж авдаг. Босоо флюресцент гэрэлтүүлэгчд өдөөх гэрлийг хянадаг тул тэдгээрийн загвар нь дээж рүү гэрлийн зам дагуу, дээж ба ажиглалтын хоолойн хооронд буцах замд суурилуулсан хялбар солих шүүлтүүрийг (саармаг ба хөндлөнгийн өдөөх шүүлтүүр) ашиглах боломжийг олгодог. эсвэл дохио хүлээн авах систем. Флюресцент ялгаруулалтын бага эрчимтэй (дээр дурдсанчлан) өдөөх гэрлийн эх үүсвэр нь сул ялгардаг гэрлийг нэмэгдүүлэхийн тулд хангалттай гэрэлтэй байх шаардлагатай бөгөөд флюрохромууд нь зохих шингээлтийн шинж чанар, квант үр ашигтай байх шаардлагатай. Энэ нь магадгүй флюресцент микроскопийн гол шалгуур юм.

Бие даасан флюорофор нь өдөөх гэрлийн фотоныг шингээх үр ашиг нь түүний үр дүнтэй молекулын хөндлөн огтлолоос хамаардаг бөгөөд ийм үзэгдэл үүсэх магадлалыг шингээлтийн коэффициент гэж нэрлэдэг. Шингээлтийн коэффициентийн том утга нь тухайн долгионы уртын интервалд фотон (эсвэл квант) шингээх магадлал өндөр байгааг харуулж байна. Квантын гарц гэдэг нь ялгарсан тоог шингээсэн квантуудын тоонд харьцуулсан харьцаа юм (ихэвчлэн энэ нь 0.1-1.0 хооронд хэлбэлздэг). Квантын гарц нь 1-ээс бага утгыг авдаг нь цацраг идэвхт бус аргаар, жишээлбэл, дулаан эсвэл фотохимийн урвалаар дахин ялгаруулалт үүсэхгүй байх үед флюресцент үүсэхэд хүргэдэг эрчим хүчний үр дагавар юм. Шингээлтийн коэффициент, квант гарц, гэрлийн дундаж эрчим, өртөх хугацаа нь флюресценцийн эрчимд нөлөөлж, энэ аргыг ашиглах боломжийг тодорхойлох чухал хүчин зүйлүүд юм.

Бүдгэрэх, бүдгэрч, гэрэлтэх

Цагаан будаа. 4. Олон өнгийн дээжийг фото цайруулах хурд

Флюресценцийн эрчмийг бууруулахад хүргэдэг өдөөлтөөс тайвширч, янз бүрийн цацраг идэвхт бус аргаар явагддаг бөгөөд ихэвчлэн исэлдүүлэгч бодис эсвэл давс, хүнд металл, галоген нэгдлүүд байгаатай холбоотой байдаг. Зарим тохиолдолд унтрах нь өдөөгдсөн флюорофор (донор) -той ойрхон байгаа өөр молекул (акцептор гэж нэрлэгддэг) руу энерги шилжүүлсний үр дүнд үүсдэг. Энэ үзэгдлийг флюресцент резонансын энергийн дамжуулалт (FRET) гэж нэрлэдэг. Энэ механизм нь оптик микроскопын нарийвчлалаас хамаагүй бага зайд молекулын харилцан үйлчлэл, холбоог судлах үр дүнтэй аргын үндэс болсон юм.

Флюресцент гэрлийн эх үүсвэрүүд

Микроскопын гадаад нуман чийдэнгийн тэжээлийн хангамж нь ихэвчлэн ажилласан цагийн тоог хянах таймераар тоноглогдсон байдаг. Нуман чийдэн нь ашиглалтын хугацаанаас (200-300 цаг) хэтэрсэн тохиолдолд гэрлийн хүчийг алдаж, ихэвчлэн эвдэрдэг. Мөнгөн усны чийдэн нь хэт ягаан туяанаас IR хүртэлх спектрийн мужид жигд эрч хүчийг өгдөггүй. Тэдний хамгийн их эрчим нь хэт ягаан туяаны ойролцоо тохиолддог. Тодорхой эрчим хүчний оргилууд 313, 334, 365, 406, 435, 546, 578 нанометрт тохиолддог. Үзэгдэх спектрийн бусад долгионы уртад эрчим нь тийм ч өндөр биш боловч тогтвортой байдаг (гэхдээ ихэнх хэрэглээнд хангалттай). Гэхдээ чийдэнгийн хүч нь өөрөө гэрэлтүүлгийн үр ашгийг тодорхойлох үзүүлэлт биш юм. Үүний эсрэгээр, хамгийн түрүүнд анхаарах ёстой чухал параметр бол эх үүсвэрийн тод байдал, нумын геометр, цацрагийн өнцгийн тархалтыг харгалзан үзэх дундаж гэрэлтэлт юм.

Цагаан будаа. 5. Нуман флюресцент ламп

Шүүлтүүрийн тэмдэг

Үйлдвэрлэгчид өдөөх шүүлтүүрийн шинж чанарыг тодорхойлохын тулд өөр өөр товчлолыг ашигладаг. Жишээлбэл, хэт ягаан туяаны шилийг UG, цэнхэр шилийг BG гэж нэрлэдэг. Нарийн зурвасын шүүлтүүр дээр та KP (Герман хэлнээс "kurz" -аас "богино" гэж орчуулсан K) эсвэл зүгээр л SP гэсэн тэмдэглэгээг харж болно. Зарим үйлдвэрлэгчид хөндлөнгийн шүүлтүүрийг IF гэсэн товчлолоор тэмдэглэдэг. Нарийн зурвасын хөндлөнгийн өдөөх шүүлтүүрүүд нь ялангуяа Стоксын бага шилжилтэд үр дүнтэй байдаг.

Шүүлтүүрийг хаах товчлол, товчлол нь дараах байдалтай байна: LP эсвэл L нь өргөн зурвасын шүүлтүүр, Y эсвэл GG шар (Германы "gelb" - шар) шил, R эсвэл RG улаан шил, OG эсвэл O улбар шар шил, K. слот шүүлтүүр (Герман хэлнээс "kante" - ирмэг), шүүлтүүрийг хаах зориулалттай BA. Шүүлтүүрийг BA515 гэх мэт тоогоор тэмдэглэсэн бол энэ нь хамгийн их дамжуулалтынхаа тал хувийг эзэлдэг долгионы уртыг (нанометрээр) заана.

Dichroic beam splitters-ийг мөн өөр өөр товчлолоор тэмдэглэсэн байдаг: CBS нь chromatic beam splitter, DM нь dichroic толь, TK нь slot splitter (Герман хэлнээс "teiler kante"), FT нь өнгө ялгагч (Герман хэлнээс "farb teiler" гэсэн үг юм. ”), мөн RKP нь нарийн зурвасын цацруулагчийг илэрхийлдэг. Үүнээс гадна, бүх орчин үеийн dichroic цацраг задлагчдын оптик шил нь үргэлж интерференцийн бүрээстэй байдаг (органик эсвэл металл будагч бодисууд). богино долгионы өндөр тусгал болон урт долгионы урттай өндөр дамжуулалт нь ойсон гэрлийн флюресцент гэрэлтүүлэгчээр дамжуулан оптик блок дээр өдөөх гэрлийн тусгалтай харьцуулахад 45 градусын өнцгөөр хазайсан байна. богино) линз болон түүний ард байрлах дээж рүү өдөөх долгионууд Эдгээр тусгай шүүлтүүрүүд нь илүү урт флюресценцийн долгионыг хаах шүүлтүүр рүү дамжуулж, тархсан өдөөлтийг чийдэнгийн хэсэг рүү буцаан тусгадаг.

Цагаан будаа. 6. Nikon B-2E дунд зурвасын цэнхэр өдөөх шүүлтүүр

Nikon-ийн нэрлэх конвенцууд нь 1990-ээд оны эхээр гарч ирсэн холимог нэр томьёо дээр суурилдаг. Тухайн үед Nikon-ийн нэмэлт шүүлтүүрийн бүх хослолыг хатуу бүрэх аргаар үйлдвэрлэдэг байсан бол өнөөдөр зөөлөн бүрэх дэвшилтэт аргуудыг ашиглан олон шүүлтүүр үйлдвэрлэж байна. Хэдийгээр зөөлөн бүрээс нь чийгшил, халуунд илүү мэдрэмтгий бөгөөд илүү болгоомжтой харьцах шаардлагатай (хатуу бүрээстэй харьцуулахад) илүү өндөр оптик нягтралыг харуулдаг бөгөөд тусгай зурвасын өргөнийг нарийн тохируулахад илүү хялбар болгодог. Nikon шүүлтүүрийн хослолуудын тухай ойлголт нь тодорхой флюорофоруудад шаардлагатай шүүлтүүрийг хурдан сонгох боломжийг олгодог.

Nikon-ийн үсэг тоон тэмдэглэгээний системийн эхний үсэг нь өдөөх спектрийн мужийг заадаг (жишээлбэл, UV, V, B, G нь "хэт ягаан туяа" - хэт ягаан туяа, "виолет" - ягаан, "цэнхэр" ба " гэсэн англи үгсийн товчлол юм. ногоон" - тус тус ногоон). Өдөөлтийн спектрийн кодчилолын дараах тоо нь өдөөх шүүлтүүрийн зурвасын өргөнийг заана: 1 нь нарийн зурвасын өдөөлт, 2 нь дунд зурвасын өдөөлт, 3 нь өргөн зурвасын өдөөлттэй тохирч байна. Эцэст нь, өдөөх зурвасын өргөнтэй тохирох тооны дараах нэг буюу хэд хэдэн үсэг нь блоклох шүүлтүүрийн шинж чанарыг илтгэнэ. А үсэг нь хамгийн бага таслах долгионы урттай стандарт өргөн зурвасын таслах шүүлтүүрийг, B нь илүү өндөр таслах долгионы урттай өргөн зурвасын таслах шүүлтүүрийг заана. Туузан дамжуулалтын ялгаруулалтын шүүлтүүр дэх E (англи хэлнээс "сайжруулсан" - сайжруулсан) гэсэн тэмдэглэгээ нь тусгаарлагдсан дохионы хөндлөнгийн харилцан үйлчлэлийг багасгах утгаараа гүйцэтгэл сайжирч байгааг харуулж байна. E/C тэмдэглэгээ нь DAPI, FITC, TRITC, Texas Red зэрэг тусгай будагч бодисуудтай ажиллахад зориулагдсан зөөлөн хөндлөнгийн бүрээсийн хослолыг заана.

Флюресцент гэрлийн тэнцвэр

1.4 тоон нүхтэй 100x объективийн хувьд харааны талбайн диаметрийг ойролцоогоор 40 микрометр гэж үзвэл дээжийн гэрэлтүүлсэн талбай нь 12 × 10 E(-6) квадрат сантиметр байна. Дараа нь дээж дээрх гэрлийн урсгал нь квадрат см тутамд 150 ватт байх бөгөөд энэ нь нэг см квадрат тутамд 3.6 × 10 E (20) фотоны урсгалын нягттай тохирч байна. Тиймээс дээжийн гэрэлтүүлгийн эрчим нь ердийн нартай өдөр дэлхийн гадаргуугийн гэрэлтүүлгийн эрчмээс ойролцоогоор 1000 дахин их байдаг.

Ийм гэрлийн урсгал дахь флюресцент ялгаруулалт нь флюрофорын шингээлт, ялгаруулах шинж чанар, дээж дэх концентраци, дээжийн оптик замын уртаас хамаарна. Математикийн аргаар үүсгэсэн флюресценцийг (F) тэгшитгэлээр тодорхойлно.

F = σ Q I

Энд σ нь молекул шингээлтийн хөндлөн огтлол, Q нь квантын гарц, I нь дээр дурдсан гэрлийн урсгал юм. Флуоресцеин нь 3 × 10 E(-16) квадрат см-ийн шингээлтийн хөндлөн огтлолтой (σ) флуорофор гэж үзвэл бид 0.99 Q-ийг олж авах бөгөөд энэ нь молекул тутамд секундэд 100,000 фотон флюресцент F-ийг бий болгодог. 40 микрометр диаметртэй, 10 микрометр зузаантай (12 пиколитртэй тэнцэх эзэлхүүнтэй) дискэнд жигд тархсан нэг литрт 1 микромоль будгийн концентраци нь ойролцоогоор 1.2 x 10 E(-17) моль будагч бодис буюу 7.2 сая. оптик зам дахь молекулууд. Хэрэв бүх молекулууд нэгэн зэрэг өдөөгдвөл флюресценцийн хурд нь секундэд 7.2 x 10 E(11) фотон байх болно (энэ нь F ба будгийн молекулын тооны бүтээгдэхүүн юм). Асуулт гарч ирнэ: хэдэн ялгарсан фотон бүртгэгдэх вэ, энэ ялгаралтын хурд хэр удаан үргэлжлэх вэ?

Хүснэгт 1. Төрөл бүрийн гэрлийн эх үүсвэрийн гэрлийн энергийн нягтрал

Фотон илрүүлэх үр ашгийг тэдгээрийн цуглуулгын үр ашиг, детекторын квант гарцаар тодорхойлно. Тоон диафрагм 1.4 ба 100 хувийн дамжуулалттай линз (энэ нь бодит бус нөхцөл) фотон цуглуулах хамгийн их үр ашиг нь 30 орчим хувийн хүлээн авах өнцгөөр хязгаарлагддаг. Дихрой толины дамжуулалт 85 хувь, блоклох шүүлтүүр 80 хувь байна. Энэ тохиолдолд цуглуулах үр ашиг нь 20 хувь буюу секундэд 140 тэрбум фотон юм. Хэрэв уламжлалт цэнэгтэй хосолсон төхөөрөмжийг (CCD) детектор болгон ашиглавал ногоон флуоресцеины долгионы уртад (525 нанометр) квантын гарц 50 хувь болно. Ийнхүү секундэд 70 тэрбум фотон буюу флюресценцээр ялгардаг фотонуудын 10 орчим хувийг илрүүлэх болно. Хамгийн тохиромжтой детектор ч (100 хувийн квант үр ашигтай) флюресценцийн фотонуудын 20 орчим хувийг л барьж чаддаг.

Флюресцент гэрлийн үргэлжлэх хугацаа нь гэрэл гэгээтэй цайралтын үр дагавар болох флюрофорыг устгах хурдаас хамаардаг. Хүчилтөрөгч агуулсан давсны уусмал дахь флуоресцеины молекул бүр устахаасаа өмнө 36,000 орчим фотон ялгаруулж чаддаг болохыг хэмжилтүүд харуулж байна. Хүчилтөрөгчгүй орчинд фото устгалын хурд ойролцоогоор арав дахин буурдаг. Тиймээс флуоресцеины молекул нь 360,000 фотон үүсгэж чаддаг. Бидний жишээн дээрх бүх будагч бодисууд (7.2 сая молекул) хамгийн багадаа 2.6 x 10 E(11), дээд тал нь 2.6 x 10 E(12) фотон ялгаруулах чадвартай. Секундэд 100,000 фотоны нэг молекулын ялгаруулалтын хурдаар (дээрх тооцооллын дагуу) бид фото устгалын өмнөх флюресцент ялгарлын үргэлжлэх хугацааг 0.3-3 секундтэй тэнцүү болгодог. Хэрэв ялгарсан фотонуудын 10 хувийг илрүүлбэл детекторын дохио нь секундэд 7.2 × 10 E(10) электрон байх болно.

Тиймээс хэрэв CCD нь 1000x1000 пикселийн камертай бол энэ дохио нь нэг сая гэрэл мэдрэмтгий элементүүдийн дунд, өөрөөр хэлбэл тус бүрт ойролцоогоор 72,000 электрон хуваарилагдах болно. 9 микрометрийн гэрэл мэдрэмтгий элемент бүхий судалгааны CCD-ийн хувьд цэнэгийн багтаамж нь ойролцоогоор 80,000 электрон, унших чимээ нь 10 электроноос бага байна. Энэ тохиолдолд дохио ба дуу чимээний харьцааг голчлон дохионы квадрат язгууртай тэнцэх фотоны хэлбэлзлийн шуугианаар тодорхойлно, өөрөөр хэлбэл ойролцоогоор 268. Бараг бүх тохиолдолд ийм өндөр дохионы түвшин богино хугацаанд л үргэлжилнэ. фото устгал үүсэхээс өмнө. Ажиглалтын хугацааг уртасгахын тулд ихэнх микроскопчид цацрагийн урсгалын эрчмийг бууруулж, фторфорын молекулуудын нийт тооны зөвхөн нэг хэсгийг өдөөдөг тул устгадаг. Тиймээс дохио-дуу чимээний харьцаа нь онолын дээд хэмжээнд хүрэх нь ховор бөгөөд флюресценцийн микроскопоор ихэвчлэн 10-20 хооронд байдаг.

Нэг молекул илрүүлэх

Тохиромжтой нөхцөлд нэг молекулын флюресцент ялгаруулалтыг илрүүлэх боломжтой байдаг бөгөөд мэдээжийн хэрэг оптик дэвсгэр болон детекторын дуу чимээ хангалттай бага байх тохиолдолд. Дээр дурьдсанчлан, нэг флюресцеины молекул гэрэл цайруулах замаар устгагдахаасаа өмнө 300,000 хүртэл фотон ялгаруулж чаддаг. 20% цуглуулах, илрүүлэх үр ашигтай үед ойролцоогоор 60,000 фотон илрэх болно. Энэ төрлийн туршилтанд нуранги фотодиод эсвэл электрон үржүүлэхэд суурилсан CCD-г ашигласнаар судлаачид бие даасан молекулуудын үйл ажиллагааг секунд, тэр байтугай минутын хугацаанд хянах боломжтой болсон. Ийм тохиолдолд гол асуудал бол оптик дэвсгэр чимээ шуугианыг дарах явдал юм. Микроскопийн линз, шүүлтүүрийг бүтээхэд ашигласан олон материал нь тодорхой хэмжээний автофлюресценцийг харуулдаг тул эхний хүчин чармайлтыг бага флюресценцтэй бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг үйлдвэрлэхэд чиглүүлсэн. Гэсэн хэдий ч флюресценцийн микроскоп дахь нийт дотоод тусгалыг (TIR) ​​ашиглан бага фон, өндөр эрчимтэй өдөөх гэрлийн шаардлагатай хослолыг олж авах боломжтой болох нь удалгүй тодорхой болов.

Цагаан будаа. 7. Урвуу болон TIRF микроскопуудын тохиргоо

Нийт дотоод ойлтын флюресценцийн микроскоп (англи товчлолоор TIRFM эсвэл TIRFM) нь хугарлын өөр өөр үзүүлэлт бүхий хоёр мэдээллийн хэрэгслийн интерфэйс дэх нийт дотоод тусгалын үед үүсдэг тархдаггүй эсвэл хурдан муудах долгионы үзэгдлийг ашигладаг.

Гадны гэрлийн эх үүсвэрийг ашигладаг хэлхээг Зураг 7(а)-д үзүүлэв. Энэ аргын хувьд гэрлийн туяа (ихэвчлэн өргөтгөсөн лазер туяа) нь шил эсвэл хугарлын бага илтгэгч усан уусмалын хажууд байрлах өндөр хугарлын илтгэгч призм (шил эсвэл индранил гэх мэт) дамжин өнгөрдөг. Хэрэв гэрлийг эгзэгтэй өнцгөөс их өнцөгт призм рүү чиглүүлбэл цацраг нь интерфейсээс бүрэн тусгагдана. Тусгалын үзэгдэл нь интерфэйс дээр тархдаггүй долгион үүсгэдэг, тухайлбал, хугарлын бага илтгэгчтэй орчинд 200 нанометрээс илүүгүй зайд нэвтэрдэг цахилгаан соронзон орон үүсдэг. Унтраах долгион дахь гэрлийн эрч хүч нь флюорофорыг өдөөхөд хангалттай боловч түүний гүн нь маш гүехэн тул өдөөх хэмжээ маш бага байдаг. Үүний үр дүнд цацраг туяанд өртсөн дээжийн эзэлхүүн нь маш бага (гадаргуугаас 200 нм зайд байгаа хэсэг) тул бага түвшний дэвсгэр юм.

Нийт дотоод тусгалын флюресценцийн микроскопийг өргөн талбайн микроскопод ашигладаг өөрчилсөн эпи-гэрэлтүүлгийн техник ашиглан хийж болно (Зураг 7(b)-д үзүүлэв). Энэ арга нь маш өндөр NA зорилго (дор хаяж 1.4, гэхдээ 1.45-1.6) ба хэсэгчилсэн гэрэлтүүлэгтэй микроскопын талбар шаарддаг бөгөөд үүнийг жижиг толбо эсвэл гэрэлтүүлгийн жигд байдлыг хангахын тулд гэрлийн хэсгийг хаадаг нимгэн цагираг ашиглан олж авдаг. урсгал. Нийт дотоод тусгал үүсэх эгзэгтэй өнцөгт хүрэхийн тулд линз болон микроскопын бүрхүүлийн шилэнд дүрэх орчин нь хугарлын өндөр индекстэй байх шаардлагатай. Зураг 7(b)-д үзүүлснээр урд талын линзийг эгзэгтэй өнцгөөс бага өнцгөөр орхиж буй гэрлийн туяа (зураг дээр үүнийг A(1) гэж тодорхойлсон) микроскоп руу буцаж ирдэггүй. Критик өнцөгт хүрэх буюу хэтэрсэн үед (Зураг 7(b)-ийн A(2) өнцөг) нийт дотоод тусгал үүснэ.

Судалгаанд нэмэлт мэдээлэл өгөхийн тулд нийт дотоод тусгалыг флюресценцийн резонансын энерги дамжуулах (FRET), гэрэл гэгээтэй цайруулсаны дараа флюресценцийг сэргээх (FRAP), спектроскопи зэрэг бусад алдартай дэвшилтэт флюресценцийн аргуудтай хослуулдаг. Эдгээр аргууд нь бие даасан флюрофор болон флюресцент өнгөтэй молекулуудыг судлах хүчирхэг хэрэгсэл юм. Ганц молекулуудыг судлахын ашиг тус одоо л хэрэгжиж эхэлж байна. Тиймээс өнөөдөр оптик микроскопийн судалгааны хүрээ нь нэг молекулаас эхлээд бүхэл бүтэн амьтад хүртэл байдаг.

Дүгнэлт

Орчин үеийн флюресцент микроскопууд нь өндөр чанарын оптик бүрэлдэхүүн хэсгүүдийн хүчийг компьютержсэн удирдлага, дижитал дүрслэлтэй хослуулж, энгийн харааны ажиглалтаас хамаагүй илүү боловсронгуй түвшинд хүрдэг. Өнөөдөр микроскоп нь гэрлийн дохионы бага түвшинд эсвэл нүдээр илрүүлэх боломжгүй долгионы урттай мэдээллийг хурдан олж авахын тулд цахим дүрслэлийн арга техникт ихээхэн тулгуурладаг. Эдгээр техникийн сайжруулалтууд нь зөвхөн гадаад дизайны элементүүд биш, харин нарийн төвөгтэй хэмжих систем болох оптик микроскопын чухал бүрэлдэхүүн хэсэг юм.

Оптик микроскоп нь зөвхөн дүрслэх ухаан эсвэл оюуны тоглоом байсан цаг өнгөрсөн. Өнөөдөр оптик дүрслэл нь өгөгдөлд дүн шинжилгээ хийх эхний алхам юм. Энэхүү эхний алхамыг микроскопоор электрон илрүүлэгч, дүрс процессор, дэлгэцтэй хамт хийдэг бөгөөд үүнийг дүрслэх системийн өргөтгөл гэж үзэж болно. Түгээмэл хэрэглээнд байгаа фокус, тайзны байрлал, оптик эд анги, хаалт, шүүлтүүр, детекторыг компьютержүүлсэн удирдлага нь механик микроскоп дээр ажиллахад хүний ​​хувьд ердөө л боломжгүй байсан туршилтын явцад ийм зохицуулалт хийх боломжийг олгодог. Флюресценцийн микроскопод оптоэлектроникийн хэрэглээ нэмэгдэж байгаа нь эсийн доорх бүтэц, тоосонцорыг удирдах, бие даасан молекулуудыг ажиглах, өргөн хүрээний нарийн спектроскопийн хэрэглээнд зориулагдсан оптик хясаа хөгжүүлэхэд хүргэсэн.

Флюресцент шүүлтүүрийн хослолууд

Эпи-флюресценцийн интерференц ба шингээлтийн шүүлтүүрүүдийн хослолыг шүүлтүүрийн куб (эсвэл оптик нэгж) дотор байрлуулсан бөгөөд өдөөх шүүлтүүр, дихроик цацраг задлагч (ихэвчлэн толин тусгал гэж нэрлэдэг) болон блоклох (эсвэл ялгаруулах) шүүлтүүрийг Зураг 1-д үзүүлэв. (a). Энэхүү гарын авлага нь өргөн талбайн флюресценцийн микроскопод хэрэглэгддэг хромофорын шингээлт ба ялгаралтын спектрийн шинж чанарт тохирсон шүүлтүүрийн хослолыг сонгоход тустай байж болох юм. Цэнхэр өдөөх муж дахь өндөр хүчин чадалтай зурвасын шүүлтүүрүүдийн ердийн хослолын спектрийн муруйг Зураг 1(b)-д үзүүлэв. Nikon флюресцент шүүлтүүрийн хослолууд нь нарийн зурвасын, дунд зурвасын болон өргөн зурвасын өдөөх шүүлтүүрүүд болон тэдгээрийн харгалзах тусгай буюу өргөн зурвасын ялгаралтын шүүлтүүртэй байдаг.

Цагаан будаа. 8. Флюресцент гэрлийн шүүлтүүрийн блокийн спектрийн муруй

Хэт ягаан туяаны өдөөлт - Nikon-ийн хэт ягаан туяаны өдөөлтийн флюресценцийн шүүлтүүрийн багц нь ердийн зурвасын дамжуулалт эсвэл өргөн зурвасын ялгаруулалтыг (хориглох) шүүлтүүрийг багтаасан нарийн тэнцвэртэй дөрвөн хослолыг агуулдаг бөгөөд флюресцент ялгаралтыг харагдах спектрийн цэнхэр, ногоон, улаан хэсгүүдийн нарийн эсвэл өргөн хүрээнд дамжуулж чаддаг. Эдгээр шүүлтүүрийн хослолууд нь 10, 40, 50 нанометрийн зурвасын өргөнтэй 330-380 нанометрийн өдөөх хүрээг хамардаг. Гурван хослол нь ижил dichroic толин тусгалыг ашигладаг бөгөөд дөрөв дэх нь нарийн өдөөх зурваст тохирох долгионы уртыг багасгадаг. Хэт ягаан туяаны шүүлтүүрийн хослолууд нь тогтмол эсвэл өргөн зурвасын ялгаруулалтын шүүлтүүрийг агуулдаг.

Нил ягаан өдөөлт - Nikon-ийн нил ягаан өдөөх флюресцент шүүлтүүрийн багц нь спектрийн нарийн эсвэл өргөн хүрээний цэнхэр, ногоон, улаан бүсэд флюресцент ялгаралтыг сонгон дамжуулж чаддаг ердийн зурвасын дамжуулалт эсвэл өргөн зурвасын ялгаруулагч (хаалт) шүүлтүүрийг багтаасан гурван хослолыг агуулдаг. Эдгээр шүүлтүүрийн хослолууд нь 10, 22, 40 нанометрийн зурвасын өргөнтэй 379-420 нанометрийн өдөөх хүрээг хамардаг. Хоёр хослол нь ижил dichroic толин тусгалыг ашигладаг бөгөөд гурав дахь нь богино долгионы урттай өдөөх зурваст тааруулахын тулд бага таслах долгионы урттай байдаг.

Цэнхэр ягаан өдөөлт - Nikon-ийн Цэнхэр ягаан өдөөх флюресценцийн шүүлтүүрийн багц нь ердийн зурвасын дамжуулалт эсвэл өргөн зурвасын ялгаруулагч (хаалт) шүүлтүүрийг агуулсан дөрвөн хослолыг агуулдаг бөгөөд энэ нь харагдахуйц цэнхэр, ногоон, улаан хэсгүүдийн нарийхан эсвэл өргөн хүрээнд флюресцент ялгаралтыг дамжуулж чаддаг. спектр. Эдгээр нэмэлт шүүлтүүрүүд нь 10, 20, 40 нанометрийн зурвасын өргөнтэй 400-аас 446 нанометрийн өдөөх хүрээг хамардаг. Гурван хослол нь ижил дихроик толин тусгалыг ашигладаг бол дөрөв дэх нь бусад бүрэлдэхүүн хэсгүүдтэй тохирох долгионы урттай (5 нанометрээр) илүү өндөр байдаг.

Цэнхэр өдөөлт - Nikon-ийн цэнхэр өдөөх флюресцент шүүлтүүр нь спектрийн ногоон, шар, улаан, хэт улаан туяаны хэсгүүдийн нарийхан эсвэл өргөн хүрээнд флюресцент ялгаралтыг сонгон дамжуулж чаддаг ердийн зурвасын дамжуулалт эсвэл өргөн зурвасын ялгаруулагч (хаалт) шүүлтүүрийг багтаасан зургаан тэнцвэртэй хослолоос бүрддэг. . Эдгээр шүүлтүүрийн хослолууд нь 20, 30, 40, 70 нанометрийн зурвасын өргөнтэй 420-495 нанометрийн өдөөх хүрээг хамардаг. Таван хослол нь ижил дихроик толин тусгалыг ашигладаг бөгөөд зургаа дахь нь хүлээн авсан дохиог нэмэгдүүлэхийн тулд таслах долгионы урт багатай байдаг. Nikon цэнхэр өдөөх шүүлтүүрийн иж бүрдэлд зориулсан бүх зурвас зогсолтын шүүлтүүрүүд нь 40 нанометрийн спектрийн өргөнтэй. Шүүлтүүрүүдийн нэг (B-3A) нь вольфрамын галоген чийдэнгийн гэрэлтүүлэгт ашиглах зориулалттай.

Ногоон өдөөлт - Nikon-ийн ногоон өдөөлтийн флюресцент шүүлтүүр нь зургаан блокоос бүрдэх ба үүнд ердийн зурвасын дамжуулалт эсвэл өргөн зурвасын ялгаруулалтыг (блоклох) шүүлтүүрүүд нь шар, улбар шар, улаан, ойрын хэт улаан туяаны бүсэд нарийхан эсвэл өргөн хүрээнд флюресцент ялгаралтыг дамжуулах чадвартай. спектр. Эдгээр шүүлтүүрийн хослолууд нь 10, 25, 30, 50 нанометрийн зурвасын өргөнтэй (нарийн, дунд, өргөн өдөөх зурвасыг оруулаад) 510-560 нанометрийн өдөөх хүрээг хамардаг. Гурван хослол нь ижил дихроик толин тусгалыг ашигладаг (565 нанометр), нөгөө гурав нь илүү урт долгионы урттай (570 ба 575 нанометр). Nikon-ийн зургаан ногоон өдөөх шүүлтүүрийн хоёр иж бүрдэл нь 60 ба 75 нанометрийн туузан шүүлтүүрийг агуулдаг.

Шар өдөөлт - Nikon-ийн шар өдөөх флюресцент шүүлтүүрийн багц нь спектрийн улбар шар болон улаан хэсэгт флюресцент ялгаралтыг сонгон дамжуулах чадвартай, нэг тодорхой нэвтрүүлэх зурвас бүхий ялгаруулах (блоклох) шүүлтүүрийг багтаасан хоёр тэнцвэртэй хослолоос бүрдэнэ. Эдгээр нэмэлт шүүлтүүрийн хослолууд нь 40 ба 55 нанометрийн зурвасын өргөнтэй 532-587 нанометрийн өдөөх хүрээг хамардаг. Энэ хоёр хослол нь ижил дихроик толин тусгалыг агуулдаг (595 нанометрийн зүсэлттэй). Nikon-ийн шар өдөөх шүүлтүүрийн хоёр иж бүрдэлд 60 ба 75 нанометрийн туузан дамжуургын шүүлтүүр орно.

Улаан өдөөлт - Nikon-ийн улаан өдөөх флюресцент шүүлтүүрийн хослол нь спектрийн алс улаан болон ойрын хэт улаан туяаны бүсэд флюресцент ялгаруулалтыг сонгон дамжуулах чадвартай зурвасын ялгаруулалт (блоклох) шүүлтүүрийг агуулсан нэг нэгжээр илэрхийлэгддэг. Блоклох шүүлтүүрийн нэвтрүүлэх зурвасын төв нь 700 нанометр, өргөн нь 75 нанометр (663-аас 738 нанометр) юм. 590-аас 650 нм хүртэлх 60 нм өдөөх өргөн зурвас нь улбар шар, улаан долгионы уртыг хамардаг. Cy5 HYQ хослол нь 660 нанометрийн огтлолтой дихроик толин тусгалыг агуулдаг бөгөөд энэ нь өдөөх зурвасын хязгаараас 10 нанометрээр өндөр байна.

Шар флюресцент уургийн (YFP) өдөөлт - YFP-д зориулж Nikon нь урт долгионы урттай GFP хувилбаруудад (YFP) шүүлтүүр ашиглан флюресцент уураг илрүүлэх чадварыг (3 Ногоон Флюресцент уураг (GFP) шүүлтүүрийн иж бүрдэлээр хангагдсан) сайжруулдаг нэг өндөр чанартай, тэнцвэртэй хослолыг боловсруулсан. болон EYFP). YFP HYQ шүүлтүүрийн сан нь сайжруулсан шар флюресцент уургийн (YFP) спектрийн шинж чанарт тохируулан тусгайлан бүтээгдсэн харьцангуй нарийн зурвас бүхий өдөөх болон ялгаруулах (зогсоох) шүүлтүүрийг агуулдаг бөгөөд YFP деривативын флюресцентийг бусад флюресцент уургаас тусад нь үнэлэх боломжийг олгодог.

Хос зурвасын өдөөлт - Nikon-ийн хос зурваст флюресцент шүүлтүүрийн багц нь хоёр флюрофорын ялгаралтыг нэгэн зэрэг сонгон дамжуулдаг хоёр зурваст шүүлтүүр (өдөөх ба ялгаруулах (таслах) шүүлтүүр) -ийн нарийн тэнцвэртэй гурван хослолоос бүрддэг. Шүүлтүүрийн нэгж бүр нь тодорхой флюрохром хостой оновчтой хослуулсан боловч ижил спектрийн шингээлт, ялгаралтын профайлтай бусад хос флюресцент будагтай үр дүнтэй ажиллах боломжтой. Тусгал болон дамжуулах бүсүүдийн хооронд эгц туузан дамжлагын шилжилтийн тусламжтайгаар зурвасын нарийн тохируулгын ачаар янз бүрийн өдөөх болон ялгаруулах дохиог хамгийн бага давхцах хөндлөнгийн оролцоотойгоор тусгаарладаг.

Гурван зурвасын өдөөлт - Nikon-ийн гурван зурваст флюресцент шүүлтүүрүүд нь гурван зурвасын шүүлтүүр (өдөөх ба ялгаруулах (блоклох) шүүлтүүр) зэрэг гурван флюрофорын флюресцент ялгаралтыг нэгэн зэрэг сонгон дамжуулдаг хоёр тэнцвэртэй блокоор төлөөлдөг. Шүүлтүүрийн нэгж бүрийг гурван фторохромын тодорхой багцтай оновчтой хослуулсан боловч ижил спектрийн шингээлт, ялгаралтын профиль бүхий бусад будагч бодисуудтай үр дүнтэй ажиллах боломжтой. Тусгал болон дамжуулах бүсүүдийн хооронд эгц зурвас хоорондын шилжилтийн тусламжтайгаар нарийн зурвасын тохируулгын ачаар янз бүрийн өдөөх болон ялгаруулах дохиог тэдгээрийн хооронд хамгийн бага хөндлөнгийн оролцоотойгоор тусгаарладаг. Гурвалсан шоо.

HYQ Cubes - Nikon-ийн HYQ флюресценцийн шүүлтүүрийн хослолууд нь нарийн тэнцвэртэй, өндөр чанартай дөрвөн блоктой бөгөөд тус бүр нь хязгаарлагдмал хүрээнд флюресценцийг сонгон дамжуулах зурвасын дамжуулалтын ялгаруулалт (блоклох) шүүлтүүрийг агуулсан байдаг. HYQ шүүлтүүрийн тэмдэглэгээ бүр нь түүний зохион бүтээсэн фторохромын нэрийг тусгасан боловч өдөөх хязгаарын хүрээнд хослол бүрийг өөр өөр флюрохромыг харгалзах шинж чанартай ажиглахад ашиглаж болно.

Nikon флюресцент шүүлтүүрийн үндсэн жагсаалт

Nikon-ийн нэрлэх конвенцууд нь 1990-ээд оны эхээр гарч ирсэн холимог нэр томьёо дээр суурилдаг. Тухайн үед Nikon-ийн нэмэлт шүүлтүүрийн бүх хослолыг хатуу бүрэх аргаар үйлдвэрлэдэг байсан бол өнөөдөр зөөлөн бүрэх дэвшилтэт аргуудыг ашиглан олон шүүлтүүр үйлдвэрлэж байна. Хэдийгээр зөөлөн бүрээс нь чийгшил, халуунд илүү мэдрэмтгий бөгөөд илүү болгоомжтой харьцах шаардлагатай (хатуу бүрээстэй харьцуулахад) илүү өндөр оптик нягтралыг харуулдаг бөгөөд тусгай зурвасын өргөнийг нарийн тохируулахад илүү хялбар болгодог. Nikon шүүлтүүрийн хослолуудын тухай ойлголт нь тодорхой флюорофоруудад шаардлагатай шүүлтүүрийг хурдан сонгох боломжийг олгодог.

Nikon-ийн үсэг тоон тэмдэглэгээний системийн эхний үсэг нь өдөөх спектрийн мужийг заадаг (жишээлбэл, UV, V, B, G нь "ultriviolet" - хэт ягаан туяа, "violet" - violet, "blue" - цэнхэр гэсэн англи үгсийн товчлол юм. , ба "ногоон" - тус тус ногоон). Өдөөлтийн спектрийн кодчилолын дараах тоо нь өдөөх шүүлтүүрийн зурвасын өргөнийг заана: 1 нь нарийн зурвасын өдөөлт, 2 нь дунд зурвасын өдөөлт, 3 нь өргөн зурвасын өдөөлттэй тохирч байна. Эцэст нь, өдөөх зурвасын өргөнтэй тохирох тооны дараах нэг буюу хэд хэдэн үсэг нь блоклох шүүлтүүрийн шинж чанарыг илтгэнэ. А үсэг нь хамгийн бага таслах долгионы урттай стандарт өргөн зурвасын таслах шүүлтүүрийг, B нь илүү өндөр таслах долгионы урттай өргөн зурвасын ялгаралтын шүүлтүүрийг заана. Туузан дамжуулалтын ялгаруулалтын шүүлтүүр дэх E (англи хэлнээс "сайжруулсан" - сайжруулсан) гэсэн тэмдэглэгээ нь тусгаарлагдсан дохионы хөндлөнгийн харилцан үйлчлэлийг багасгах утгаараа гүйцэтгэл сайжирч байгааг харуулж байна. E/C тэмдэглэгээ нь DAPI, FITC, TRITC, Texas Red зэрэг тусгай будагч бодисуудтай ажиллахад зориулагдсан зөөлөн хөндлөнгийн бүрээсийн хослолыг заана.