GENETINĖ INŽINERIJA, biochemijos metodų rinkinys ir molekulinė genetika, kurio pagalba atliekamas kryptinis derinys genetinė informacija bet kokie organizmai. Genų inžinerija leidžia įveikti natūralias tarprūšines kliūtis, trukdančias keistis genetine informacija tarp taksonomiškai nutolusių organizmų rūšių, sukurti ląsteles ir organizmus, turinčius gamtoje neegzistuojančių genų derinius su nurodytomis paveldimomis savybėmis. Pagrindinis genų inžinerijos įtakos objektas yra genetinės informacijos nešėja – dezoksiribonukleino rūgštis (DNR), kurios molekulė dažniausiai susideda iš dviejų grandinių. Griežtas purino ir pirimidino bazių poravimo specifiškumas lemia komplementarumo savybę – abipusį nukleotidų atitikimą dviejose grandinėse. Naujų genų derinių kūrimas pasirodė įmanomas dėl esminio DNR molekulių struktūros panašumo visų tipų organizmuose, o tikrasis genetinio kodo universalumas užtikrina svetimų genų raišką (jų funkcinio aktyvumo pasireiškimą). bet kokio tipo ląstelėje. Tai taip pat palengvino žinių kaupimas nukleorūgščių chemijos srityje, genų organizavimo ir veikimo molekulinių ypatybių identifikavimas (įskaitant jų ekspresijos reguliavimo mechanizmų sukūrimą ir galimybę pajungti genus „subordinuoti“) svetimi“ reguliavimo elementai), DNR sekos nustatymo metodų kūrimas, polimerazės atradimas grandininė reakcija, kuri leido greitai susintetinti bet kurį DNR fragmentą. Svarbios prielaidos genų inžinerijai atsirasti buvo: plazmidžių, galinčių autonomiškai replikuotis ir persikelti iš vienos bakterijos ląstelės į kitą, atradimas ir transdukcijos reiškinys – tam tikrų genų perkėlimas bakteriofagais, o tai leido suformuluoti idėją apie vektoriai: molekulės - genų nešėjai. Didžiulį vaidmenį kuriant genų inžinerijos metodiką suvaidino fermentai, dalyvaujantys nukleino rūgščių transformacijoje: restrikcijos fermentai (atpažįsta DNR molekulėse griežtai apibrėžtas sekas – vietas ir šiose vietose „perkerta“ dvigubą grandinę), DNR ligazės (kovalentiškai jungiasi). atskiri DNR fragmentai), atvirkštinė transkriptazė (sintezuoja papildomą DNR kopiją arba cDNR RNR šablone) ir kt. Tik esant jų prieinamumui, dirbtinių struktūrų kūrimas tapo techniškai įmanoma užduotimi. Fermentai naudojami atskiriems DNR fragmentams (genams) gauti ir sukurti molekulinius hibridus – rekombinantinę DNR (recDNR) plazmidžių ir virusų DNR pagrindu. Pastarieji į ląstelę šeimininką pristato norimą geną, užtikrindami ten jo dauginimąsi (klonavimą) ir galutinio geno produkto susidarymą (jo ekspresiją).

Rekombinantinių DNR molekulių kūrimo principai. Terminas „genų inžinerija“ plačiai paplito po to, kai 1972 m. P. Bergas ir jo kolegos pirmą kartą gavo rekombinantinę DNR, kuri buvo hibridas, kuriame buvo Escherichia coli bakterijos DNR fragmentai, jos virusas (bakteriofagas λ) ir pavyzdžio viruso SV40 DNR. kombinuotas (1 pav.). 1973 metais S. Cohenas su bendradarbiais panaudojo pSC101 plazmidę ir restrikcijos fermentą (EcoRI), kuris sulaužo ją vienoje vietoje taip, kad susidaro trumpos komplementarios vienagrandės „uodegėlės“ (dažniausiai 4–6 nukleotidai). dvigrandės DNR molekulės galuose. Jie vadinami „lipniais“, nes gali poruotis (tarsi sulipti) vienas su kitu. Tokią DNR sumaišius su svetimos DNR fragmentais, apdorotais tuo pačiu restrikcijos fermentu ir turinčiais tuos pačius lipnius galus, buvo gautos naujos hibridinės plazmidės, kurių kiekvienoje buvo bent vienas svetimos DNR fragmentas, įterptas į plazmidės EcoRI vietą (1 pav.). 2) . Tapo akivaizdu, kad į tokias plazmides galima įterpti įvairių svetimų DNR fragmentų, gautų tiek iš mikroorganizmų, tiek iš aukštesniųjų eukariotų.

Pagrindinė šiuolaikinė recDNA gavimo strategija yra tokia:

1) į plazmidės ar viruso, galinčio daugintis nepriklausomai nuo chromosomos, DNR įterpiami DNR fragmentai, priklausantys kitam organizmui, turinčiam tam tikrus tyrėją dominančius genus arba dirbtinai gautas nukleotidų sekas;

2) gautos hibridinės molekulės įvedamos į jautrias prokariotines arba eukariotines ląsteles, kur jos yra replikuojamos (dauginamos, amplifikuojamos) kartu su jose įtaisytais DNR fragmentais;

3) ląstelių klonai atrenkami kolonijų pavidalu ant specialių maistinių medžiagų (arba virusai valymo zonų pavidalu – plokštelės ant nuolatinio bakterijų ląstelių ar gyvūnų audinių kultūrų augimo sluoksnio), turinčios reikiamų tipų recDNR molekulių ir subjekto. atlikti išsamius struktūrinius ir funkcinius tyrimus. Siekiant palengvinti ląstelių, kuriose yra recDNR, atranką, naudojami vektoriai, turintys vieną ar daugiau žymenų. Pavyzdžiui, plazmidėse atsparumo antibiotikams genai gali būti tokie žymenys (ląstelės, kuriose yra recDNR, atrenkamos pagal jų gebėjimą augti esant tam tikram antibiotikui). RecDNA, turinti norimus genus, atrenkama ir įvedama į recipiento ląsteles. Nuo šio momento prasideda molekulinis klonavimas - gaunamos recDNR kopijos, taigi ir tikslinių genų kopijos jos sudėtyje. Tik jei įmanoma atskirti visas transfekuotas arba užkrėstas ląsteles, kiekvienas klonas bus atstovaujamas atskira ląstelių kolonija ir turės specifinę recDNR. Paskutiniame etape atliekamas klonų, turinčių norimą geną, identifikavimas (paieška). Jis pagrįstas tuo, kad įterpimas į recDNR lemia tam tikrą unikalią ląstelės, kurioje ji yra, savybę (pavyzdžiui, įterpto geno ekspresijos produktą). Molekulinio klonavimo eksperimentuose laikomasi 2 pagrindinių principų: nė viena iš ląstelių, kuriose vyksta recDNR klonavimas, neturėtų gauti daugiau nei vienos plazmidės molekulės ar viruso dalelės; pastarieji turi gebėti replikuotis.

Daugybė plazmidžių ir virusinių DNR yra naudojamos kaip vektorinės molekulės genų inžinerijoje. Populiariausi klonavimo vektoriai turi keletą genetinių žymenų ir turi vieną skirtingų restrikcijos fermentų veikimo vietą. Tokius reikalavimus, pavyzdžiui, geriausiai atitinka plazmidė pBR322, kuri buvo sukonstruota iš iš pradžių natūraliai pasitaikančios plazmidės, naudojant metodus, naudojamus dirbant su recDNR; jame yra atsparumo ampicilinui ir tetraciklinui genų, taip pat viena atpažinimo vieta 19 skirtingų restrikcijos fermentų. Ypatingas klonavimo vektorių atvejis yra ekspresijos vektoriai, kurie kartu su amplifikacija užtikrina teisingą ir efektyvią svetimų genų ekspresiją recipiento ląstelėse. Kai kuriais atvejais molekuliniai vektoriai gali užtikrinti svetimos DNR integraciją į ląstelės ar viruso genomą (jie vadinami integraciniais vektoriais).

Vienas iš svarbiausias užduotis genų inžinerija – bakterijų ar mielių padermių, gyvūnų ar augalų audinių ląstelių linijų, taip pat transgeninių augalų ir gyvūnų (žr. Transgeniniai organizmai) kūrimas, kuris užtikrintų efektyvią juose klonuotų genų ekspresiją. Aukštas baltymų gamybos lygis pasiekiamas, kai genai klonuojami daugiakopiuose vektoriuose, nes šiuo atveju tikslinio geno ląstelėje bus dideli kiekiai. Svarbu, kad DNR koduojanti seka būtų kontroliuojama promotoriaus, kurį efektyviai atpažįsta ląstelės RNR polimerazė, ir kad gauta mRNR būtų gana stabili ir efektyviai verčiama. Be to, svetimkūnio baltymas, susintetintas recipiento ląstelėse, neturėtų būti sparčiai skaidomas tarpląstelinių proteazių. Kuriant transgeninius gyvūnus ir augalus, dažnai pasiekiama specifinė įvestų tikslinių genų ekspresija.

Kadangi genetinis kodas yra universalus, genų ekspresijos galimybę lemia tik tai, kad jo sudėtyje yra transkripcijos ir transliacijos inicijavimo ir pabaigos signalų, kuriuos teisingai atpažįsta ląstelė-šeimininkė. Kadangi dauguma aukštesniųjų eukariotų genų turi nenutrūkstamą egzon-introno struktūrą, dėl tokių genų transkripcijos susidaro pirmtakas pasiuntinio RNR (pre-mRNR), iš kurios vėlesnio sujungimo metu susidaro nekoduojančios sekos - intronai - atsiskiria ir susidaro subrendusi mRNR. Tokie genai negali būti išreikšti bakterijų ląstelėse, kuriose nėra susijungimo sistemos. Siekiant įveikti šią kliūtį, ant subrendusių mRNR molekulių, naudojant atvirkštinę transkriptazę, sintetinama DNR kopija (cDNR), prie kurios naudojant DNR polimerazę pridedama antroji grandinė. Tokie DNR fragmentai, atitinkantys geną koduojančią seką (nebeatskiriami nitronais), gali būti įterpti į tinkamą molekulinį vektorių.

Žinant tikslinio polipeptido aminorūgščių seką, galima susintetinti jį koduojančią nukleotidų seką, gaunant vadinamąjį ekvivalentinį geną ir integruoti į atitinkamą ekspresijos vektorių. Kurdami lygiavertį geną, dažniausiai atsižvelgiama į genetinio kodo išsigimimą (20 aminorūgščių koduoja 61 kodonas) ir kiekvienos aminorūgšties kodonų atsiradimo dažnumą ląstelėse, į kurias planuojama įvesti šį geną. , nes kodonų sudėtis skirtinguose organizmuose gali labai skirtis. Teisingai parinkti kodonai gali žymiai padidinti tikslinio baltymo gamybą recipiento ląstelėje.

Genų inžinerijos svarba. Genų inžinerija žymiai išplėtė eksperimentines molekulinės biologijos ribas, nes tapo įmanoma įdiegti įvairių tipų ląstelių svetimą DNR ir ištirti jos funkcijas. Tai leido nustatyti bendrus biologinius genetinės informacijos organizavimo ir raiškos modelius įvairūs organizmai. Toks požiūris atvėrė perspektyvas kurti iš esmės naujus mikrobiologinius biologiškai aktyvių medžiagų gamintojus, taip pat gyvūnus ir augalus, turinčius funkciškai aktyvius svetimus genus. Daugelis anksčiau neprieinamų biologiškai aktyvių žmogaus baltymų, įskaitant interferonus, interleukinus, peptidinius hormonus, kraujo faktorius, dideliais kiekiais pradėjo gamintis bakterijų, mielių ar žinduolių ląstelėse ir yra plačiai naudojami medicinoje. Be to, tapo įmanoma dirbtinai sukurti genus, koduojančius chimerinius polipeptidus, turinčius dviejų ar daugiau natūralių baltymų savybių. Visa tai davė galingą impulsą biotechnologijų vystymuisi.

Pagrindiniai genų inžinerijos objektai yra bakterijos Escherichia coli (Escherichia coli) ir Bacilltis subtilis (bacillus hay), kepimo mielės Saccharomices cerevisiae, įvairios žinduolių ląstelių linijos. Genų inžinerijos įtakos objektų spektras nuolat plečiasi. Intensyviai plėtojamos transgeninių augalų ir gyvūnų kūrimo tyrimų sritys. Kuriant naudojami genų inžinerijos metodai naujausios kartos vakcinos nuo įvairių infekcijų sukėlėjų (pirmoji iš jų buvo sukurta mielių, gaminančių žmogaus hepatito B viruso paviršiaus baltymą, pagrindu). Daug dėmesio skiriama žinduolių virusų pagrindu sukurtų klonavimo vektorių kūrimui ir jų panaudojimui kuriant gyvas polivalentines vakcinas veterinarijos ir medicinos reikmėms, taip pat molekulinius vektorius vėžio navikų ir paveldimų ligų genų terapijai. Sukurtas būdas tiesiogiai įvesti recDNR į žmonių ir gyvūnų organizmą, nukreipiant įvairių infekcinių agentų antigenų gamybą jų ląstelėse (DNR vakcinacija). Naujausia genų inžinerijos kryptis – valgomųjų vakcinų, pagamintų iš transgeninių augalų, tokių kaip pomidorai, morkos, bulvės, kukurūzai, salotos ir kt., kūrimas, gaminančių imunogeninius infekcinių ligų sukėlėjų baltymus.

Susirūpinimas, susijęs su genų inžinerijos eksperimentais. Netrukus po pirmųjų sėkmingų recDNR gavimo eksperimentų, P. Bergo vadovaujama mokslininkų grupė pasiūlė apriboti daugelio genų inžinerijos eksperimentų atlikimą. Šie rūpesčiai buvo pagrįsti tuo, kad organizmų, turinčių svetimą genetinę informaciją, savybes sunku numatyti. Jie gali įgyti nepageidaujamų savybių, sutrikdyti ekologinę pusiausvyrą, sukelti neįprastų žmonių, gyvūnų ir augalų ligų atsiradimą ir plitimą. Be to, buvo pastebėta, kad žmogaus įsikišimas į gyvų organizmų genetinį aparatą yra amoralus ir gali sukelti nepageidaujamų socialinių ir etinių pasekmių. 1975 metais šios problemos buvo aptartos tarptautinėje konferencijoje Asilomare (JAV). Jo dalyviai priėjo prie išvados, kad būtina ir toliau taikyti genų inžinerijos metodus, tačiau privalomas laikymasis tam tikros taisyklės ir rekomendacijos. Vėliau šios taisyklės, nustatytos daugelyje šalių, buvo gerokai sušvelnintos ir sumažintos iki mikrobiologiniuose tyrimuose įprastų metodų, specialių apsauginių priemonių, užkertančių kelią biologinių veiksnių plitimui aplinkoje, kūrimo, saugių vektorių ir recipientų ląstelių, nesidauginti natūraliomis sąlygomis.

Dažnai genų inžinerija suprantama tik kaip darbas su recDNR, o terminai „molekulinis klonavimas“, „DNR klonavimas“ ir „genų klonavimas“ vartojami kaip genų inžinerijos sinonimai. Tačiau visos šios sąvokos atspindi tik atskirų genų inžinerijos operacijų turinį ir todėl nėra lygiavertės terminui „genų inžinerija“. Rusijoje terminas „genų inžinerija“ yra plačiai naudojamas kaip genų inžinerijos sinonimas. Tačiau semantinis šių terminų turinys yra kitoks: genų inžinerija siekiama sukurti organizmus su nauja genetine programa, o terminas „genų inžinerija“ paaiškina, kaip tai daroma – manipuliuojant genais.

Lit.: Shchelkunovas S. N. Genų klonavimas. Novosibirskas, 1986 m.; dar žinomas Genų inžinerija. 2 leidimas, Novosibirskas, 2004 m.; Watson J., Tooze J., Kurtz D. Rekombinantinė DNR. M., 1986; DNR klonavimas. Metodai. M., 1988; Nauja DNR klonavimo srityje: metodai. M., 1989 m.

Genetinė (genetinė) inžinerija

Genetinė (genų) inžinerija– dirbtinis genetinių struktūrų ir paveldimai modifikuotų organizmų konstravimas. Genų inžinerija yra molekulinės genetikos skyrius (taikomoji šaka), susijusi su tiksliniu naujų DNR molekulių, galinčių daugintis šeimininko ląstelėje, kūrimu. Tokiu atveju įvyksta dirbtinis, tikslingas organizmo (mikroorganizmo) genotipo pakeitimas ir naujų savybių bei savybių formavimasis. Genų inžinerija užsiima genų struktūros dekodavimu, jų sinteze ir klonavimu bei genų, išskirtų iš gyvų organizmų ląstelių, įterpimu į augalų ir gyvūnų ląsteles, siekiant konkrečiai pakeisti jų genetines savybes.

Gerai išvystyti genų inžinerijos metodai yra transgenezė, mikrobiologinė sintezė ir kt.

Transgenezė– genų perkėlimas iš vieno organizmo tipo į kitą. Transgenezė atliekama pjaunant ir susiuvant DNR dalis, dalyvaujant fermentams - restrikcijos fermentams ir ligazėms.

Transgenezės etapai:

a) genų (DNR fragmentų) išskyrimas iš bakterijų, augalų ar gyvūnų ląstelių naudojant fermentą restrikcijos fermentai;

b) genų (DNR fragmentų) sujungimas (susiejimas) su plazmide naudojant fermentą ligazės;

c) hibridinės plazmidės DNR, turinčios norimą geną, įvedimą į ląstelę šeimininką;

d) šio geno kopijavimas (klonavimas) šeimininko ląstelėje ir jo veikimo užtikrinimas pagal schemą: „DNR kodas – transkripcija – transliacija – baltymas“

Genų inžinerijos įrankiai yra fermentai, atrasti 1974 m. restrikcijos fermentai (restrikcijos endonukleazės). Restrikcijos fermentai atpažįsta DNR dalis (vietoves) ir įpjauna DNR grandines. Kiekvieno fragmento galuose susidaro vienos grandinės uodegos, vadinamos „ lipnūs galai" nes jie gali tarsi sulipti dėl papildomumo.

Restrikcijos fermentai atpažįsta specifinę DNR nukleotidų seką dvigrandėje DNR. Tada restrikcijos fermentas prisitvirtina prie atpažintos nukleotido vietos ir supjausto ją prisijungimo vietoje. Dažniau restrikcijos fermentai atpažįsta 4–6 nukleotidų porų sritis DNR molekulėje ir nupjauna abi DNR grandines šių regionų viduryje arba dažniausiai su poslinkiu. Restrikcijos fermentų pavyzdžiai: restrikcijos fermentas Eco RI, kuris atpažįsta šešių GAATTC nukleotidų DNR fragmentą (pjovimo vieta tarp abiejų DNR grandinių G ir A nukleotidų); restrikcijos fermentas Hind III atpažįsta AAGCTT sritį (perpjovos vietą tarp abiejų DNR grandinių A ir A nukleotidų); restrikcijos fermentas Bam aš atpažįsta GGATCC sritį (pjovimo vietą tarp abiejų DNR grandinių G ir G nukleotidų); restrikcijos fermentas Hae III atpažįsta GGC vietą (pjovimo vietą tarp abiejų DNR grandinių G ir C nukleotidų); restrikcijos fermentas Hpa II atpažįsta CCGG sritį (pjūvio vietą tarp abiejų DNR grandinių C ir C nukleotidų).

Toliau, norint sukonstruoti genetiškai modifikuotą organizmą, reikia į šio organizmo ląstelę įvesti norimą geną. Svetimų genų įvedimas į organizmą atliekamas naudojant plazmidinis vektorius. Vektorius yra plazmidė – maža žiedinė DNR molekulė kuris išgaunamas iš bakterinės ląstelės citoplazmos. Plazmidės– paveldimumo veiksniai, esantys už chromosomų ribų, atstovaujantys ekstrachromosominė DNR.

Ryžiai. 37.

A– Svetimos DNR įvedimo į bakterijų plazmidę naudojant fermentus (restrikcijos endonukleazę ir ligazę) schema.

B– Žmogaus genų perdavimo schema, atsakinga už hormono insulino sintezę ir vektorinės DNR susidarymą.

Plazmidės savybės: 1) turi galimybę savarankiškai replikuotis; 2) yra genų, koduojančių antibiotikus; 3) geba integruotis į recipiento ląstelės chromosomą; 4) atpažįsta DNR dalis, kurias gali pjauti restrikcijos fermentai; 5) restrikcijos fermentas gali perpjauti plazmidę ir perkelti ją į linijinę būseną. Tyrėjai naudoja šias plazmidės savybes rekombinantinė (hibridinė) DNR.

DNR įvedimo į plazmidę (plazmidės vektorių) seka naudojant restrikcijos fermentą(37 pav. A):

1) apribojimas– DNR molekulės pjovimas restrikcijos fermentu, DNR fragmentų susidarymas ir reikiamo geno išskyrimas;

2) izoliuoto geno įtraukimas į plazmidę t.y., rekombinantinės (hibridinės) DNR gavimas, įvedant svetimos DNR fragmentą į plazmidę;

3) perrišimas– fermentinis kryžminis ryšys ligazė plazmidės (vektoriaus) ir svetimos DNR fragmentai; šiuo atveju vektoriaus ir svetimos DNR galai (vadinamieji „lipni galai“) vienas kitą papildo;

4) transformacija– rekombinantinės plazmidės įvedimas į kitos ląstelės (ląstelės recipiento), ypač bakterinės ląstelės, genomą.

Reikėtų pažymėti, kad plazmidės prasiskverbia tik į dalį apdorotų bakterijų. Transformuotos bakterijos kartu su plazmidėmis įgyja atsparumą tam tikram antibiotikui, todėl jas galima atskirti nuo netransformuotų bakterijų, kurios miršta terpėje, kurioje yra antibiotikas. Kiekviena iš transformuotų bakterijų dedama ant maistinė terpė, dauginasi ir suformuoja daugelio tūkstančių palikuonių koloniją – kloną.

5) atranka– atranka tarp transformuotų bakterijų, turinčių plazmidžių su norimu genu.

Transgeniniai gyvūnai ir augalai

Į žinduolių kiaušinėlius arba augalų protoplastus (izoliuotą ląstelę be ląstelės sienelės) mikroinjekcija įvedami klonuoti genai, o vėliau iš jų išauginami gyvūnai ar augalai, kurių genome veikia svetimi genai. Vadinami augalai ir gyvūnai, kurių genomas buvo pakeistas atliekant genų inžinerijos operacijas transgeninės organizacijos (transgeniniai augalai ir gyvūnai), nes jame yra svetimų genų. Buvo gautos transgeninės pelės, triušiai, kiaulės ir avys. Jų genome yra genų iš bakterijų, žinduolių ir žmonių. Buvo gauti transgeniniai augalai (kukurūzai, paprikos, pomidorai, kviečiai, rugiai, ankštiniai augalai, bulvės ir kt.), kuriuose yra negiminingų rūšių genų. Transgeniniai augalai atsparūs herbicidams, vabzdžiams, nepalankioms lietaus sąlygoms ir pan.. Pamažu sprendžiama daugelio žemės ūkio augalų paveldimumo kaitos problema.

Genetinis chromosomų žemėlapis. Genų terapija

Genetinis chromosomų žemėlapis yra diagrama santykinė padėtis genai toje pačioje jungčių grupėje. Tokie žemėlapiai sudaromi kiekvienai homologinių chromosomų porai. Genetiniame žemėlapyje rodoma genų eiliškumas chromosomoje ir atstumai tarp jų (tam tikrų genų perėjimo procentas). Taigi naujų mikroorganizmų padermių, galinčių sintetinti hormonus, baltymus ir vaistus, sukūrimas pagrįstas žiniomis apie mikroorganizmų genetinius žemėlapius. Žmogaus genetiniai žemėlapiai yra būtini medicinos genetikai. Žinios apie geno lokalizaciją konkrečioje chromosomoje naudojamos diagnozuojant daugybę paveldimų ligų, taip pat atliekant genų terapiją, siekiant koreguoti genų struktūrą ir funkcijas.

Genų terapija - defektinių genų pakeitimas nepažeistais arba jų struktūros koregavimas.

Kovai su paveldimomis, vėžio ir su amžiumi susijusiomis ligomis kuriami žmogaus ląstelėms saugūs genų terapijos metodai. Taikant genų terapijos metodus, galima pažeistus organizmo genus, kuriuose įvyko taškinės mutacijos, pakeisti nepažeistais. Šiais laikais mokslininkai įvaldo metodus žmogaus biologinė sauga: būtinų genų įvedimas į žmogaus organizmo ląsteles. Tai leis jums atsikratyti daugelio paveldimų ligų.

Mikrobiologinė sintezė

Genų inžinerijos metodai leido įgyvendinti mikrobiologinė sintezė(37 pav. B). Naudojant genų inžinerijos metodus, mikrobiologams pavyko gauti bakterijų padermes, kurių dėka sėkmingai vykdoma mikrobiologinė sintezė. Tam parenkamos reikiamos bakterinės ląstelės, kuriose nėra plazmidžių. Išskiriamos DNR molekulės su tam tikra nukleotidų seka, kuri lemia vystymąsi norimą ženklą. Į bakterijos ląstelę įvedama plazmidė su integruota DNR sekcija (genomu), kurioje pradeda veikti įmontuota DNR sekcija (vyksta replikacijos, transkripcijos, transliacijos procesai), ir reikalingas baltymas (interferonas, geneferonas, imunoglobulinas, insulinas, somatotropinas ir kt.) sintetinamas bakterijų ląstelėje. Pramoniniais kiekiais gaunami hormonai (insulinas, somatotropinas), daug aminorūgščių, antibiotikų, vakcinų ir kt.

Taikant genetinius metodus, gauta mikroorganizmo Pseudomonas denitrificans padermė, kuri gamina dešimtis kartų daugiau vitamino C ir B grupės vitaminų nei pradinė forma; nauja bakterijos Micrococcus glutamicus padermė išskiria šimtus kartų daugiau aminorūgšties lizino nei pirminė (laukinė) liziną gaminančios bakterijos kultūra.

Ląstelių inžinerija

Ląstelių inžinerija– atskirų ląstelių ar audinių kultivavimas specialiose dirbtinėse terpėse, metodų kūrimas naujo tipo ląstelėms jas hibridizuojant, pakeičiant chromosomas ir iš jų išauginant hibridus.

1. Audinių kultūros metodas

Metodas susideda iš izoliuotų ląstelių arba audinių gabalėlių kultivavimo dirbtinėje maistinėje terpėje tinkamomis mikroklimato sąlygomis. Dėl auginimo augalų ląstelės arba audinių gabalėliai atsinaujina į visą augalą. Mikrokloniniu būdu dauginant atskiras ląsteles ar audinio gabalėlius (dažniausiai tai yra stiebo ar šaknies viršūninė meristema), galima gauti daug naudingų augalų. Eksperimentiškai parenkamos mikroklimato sąlygos ir maistinės terpės dekoratyvinių, kultūrinių ir vaistinių augalų regeneracijai. Gauti taip pat naudojama audinių kultūra diploidiniai augalai po pirminių haploidinių formų gydymo kolchicinu.

2. Somatinė hibridizacija

Somatinė hibridizacija apima hibridinių ląstelių gamybą, o iš jų – naujų formų; dirbtinis kiaušinėlių apvaisinimas.

Naujų hibridinių augalų gavimas suliejus įvairių ląstelių protoplastus (branduolys ir citoplazma) audinių kultūroje. Norint sulieti protoplastus, fermentų pagalba sunaikinama augalo ląstelės sienelė ir gaunamas izoliuotas protoplastas. Auginant tokius protoplastus skirtingų tipų augalai susilieja ir formuoja formas su naujomis naudingomis savybėmis. Dirbtinis kiaušialąsčių apvaisinimas atliekamas naudojant apvaisinimo in vitro (IVF) metodą, kuris leidžia apvaisinti kiaušialąstes in vitro, vėliau implantuojant embrioną ankstyvoje vystymosi stadijoje, ir įveikti kai kurias žmonių nevaisingumo formas.

3. Chromosomų inžinerija– atskirų chromosomų pakeitimas augalų ląstelėse arba pridėjimas naujomis. Diploidai turi homologinių chromosomų poras ir tokie organizmai vadinami disomikais. Jei vienoje poroje lieka viena chromosoma, susidaro monosomija. Jei prie bet kurios poros pridedate trečią homologinę chromosomą, susidaro trisomika ir pan. Galima atskiras vienos rūšies chromosomas pakeisti kitos rūšies chromosomomis. Gauta formos vadinamos pakeistomis.

.(Šaltinis: „Biologija. Šiuolaikinė iliustruota enciklopedija“. Vyriausiasis redaktorius A. P. Gorkinas; M.: Rosman, 2006 m.)

Pažiūrėkite, kas yra „genų inžinerija“ kituose žodynuose:

Genų inžinerija- molekulinės genetikos šaka, susijusi su tikslinga naujų genetinės medžiagos (rekombinantinės DNR) derinių, galinčių daugintis ir funkcionuoti ląstelėje-šeimininkėje, kūrimu in vitro. Šaltinis… Norminės ir techninės dokumentacijos terminų žodynas-žinynas

Tas pats kaip genų inžinerija... Didysis enciklopedinis žodynas

Pagal 1996 m. birželio 5 d. Federalinio įstatymo dėl valstybinio reguliavimo genų inžinerijos veiklos srityje apibrėžimą, technikų, metodų ir technologijų rinkinys, įskaitant. rekombinantinių ribonukleino ir dezoksiribonukleino rūgščių gamybos technologijos, pagal ... Teisės žodynas

GENETINĖ INŽINERIJA – DNR (dezoksiribonukleino rūgšties) molekulės su norimu genu sukūrimo technika, kuri vėliau įvedama į bakterijos, grybelio (mielių), augalo ar žinduolio ląstelę, kad ji gamintų norimą baltymą. Metodika...... Mokslinis ir techninis enciklopedinis žodynas

Genetikos šaka, kurianti manipuliavimo NK metodus ir naudojanti šiuos metodus genetiniams tyrimams bei mišrių genomų organizmams, įskaitant naudingus medicinai ir šalies ekonomikai, gavimui. (Šaltinis: „Terminų žodynėlis... ... Mikrobiologijos žodynas

Genų inžinerija- metodų ir technologijų rinkinys, įskaitant rekombinantinių ribonukleino ir dezoksiribonukleino rūgščių gamybos technologijas, skirtas genams išskirti iš organizmo, manipuliuoti genais ir įvesti juos į kitus organizmus;... Šaltinis ... Oficiali terminija

genų inžinerija- - Biotechnologijų temos EN biomolekulinė inžinerija ... Techninis vertėjo vadovas

GENETINĖ INŽINERIJA- technikų, metodų ir technologijų rinkinys, įskaitant. rekombinantinių ribonukleino (RNR) ir dezoksiribonukleino (DNR) rūgščių gamybos, genų išskyrimo iš organizmo, manipuliavimo genais ir jų įvedimo į kitus... Teisės enciklopedija

Terminas genų inžinerija Terminas anglų kalba genų inžinerija Sinonimai genų inžinerija Santrumpos Susiję terminai genų pristatymas, bioinžinerija, biologiniai varikliai, genomas, DNR, RNR, oligonukleotidas, plazmidė, fermentas, genų terapija ... Enciklopedinis nanotechnologijų žodynas

Tas pats, kas genų inžinerija. * * * GENETINĖ INŽINERIJA GENETINĖ INŽINERIJA, tokia pati kaip genų inžinerija (žr. GENETINĖ INŽINERIJA) ... Enciklopedinis žodynas

genų inžinerija- Genų inžinerija Genų inžinerija Rekombinantinės DNR technologija. Keičiant, naudojant biocheminius ir genetinius metodus, chromosominė medžiaga – pagrindinė paveldima ląstelių medžiaga. Chromosominė medžiaga susideda iš... Aiškinamasis anglų-rusų nanotechnologijų žodynas. – M.

Knygos

• Genetinė inžinerija biotechnologijoje. Vadovėlis, Zhuravleva Galina Anatolyevna. Vadovėlis „Genų inžinerija biotechnologijoje“ parengtas pagal Federalinį valstybinį aukštojo profesinio išsilavinimo standartą specialybės 020400 „Biologija“ pagrindu ir paremtas daugiau nei 10 metų Biologijos fakultete skaitytomis paskaitomis...

Rusijos Federacijos žemės ūkio ministerija

Federalinė valstybinė aukštojo profesinio mokymo įstaiga „Uralo valstybinė žemės ūkio akademija“

disciplinoje „Veterinarinė genetika“

tema: „Genų inžinerija – dabartis ir ateitis“

Užbaigta:

FVM studentas

2 kursas 2 grupė 3 grupė

Šmakova T.S.

Patikrinta:

Erofejeva L.F.

Jekaterinburgas 2008 m

Įvadas

1. Genų inžinerijos metodai

2. Genų inžinerijos pasiekimai

3. Genų inžinerija: privalumai ir trūkumai

4. Genų inžinerijos perspektyvos

Naudotos literatūros sąrašas

Įvadas

Genų inžinerija– rekombinantinės RNR ir DNR gavimo, genų išskyrimo iš organizmo (ląstelių), manipuliavimo genais ir jų įvedimo į kitus organizmus metodų, metodų ir technologijų visuma. Genų inžinerija padeda pasiekti norimas modifikuoto organizmo savybes.

Genų inžinerija nėra mokslas plačiąja prasme, bet yra biotechnologijos įrankis, naudojant tokius tyrimus biologijos mokslai, pavyzdžiui, molekulinė biologija, citologija, genetika, mikrobiologija. Labiausiai ryškus įvykis Didžiausio dėmesio sulaukęs ir savo pasekmėmis labai svarbus buvo atradimų serija, kurios rezultatas – sukurti gyvų organizmų paveldimumo kontrolės ir kontrolės prasiskverbiant į „šventųjų šventumą“ metodus. gyva ląstelė – į jos genetinį aparatą.

Dabartinis mūsų biochemijos, molekulinės biologijos ir genetikos žinių lygis leidžia tikėtis sėkmingos naujų biotechnologijų plėtros. genų inžinerija, t.y. metodų rinkinys, leidžiantis atliekant in vitro operacijas genetinę informaciją perkelti iš vieno organizmo į kitą. Genų perkėlimas leidžia įveikti tarprūšinius barjerus ir perkelti individualias vieno organizmo paveldimas savybes kitam. Genų inžinerijos tikslas yra ne mitus paversti realybe, o gauti ląsteles (pirmiausia bakterines), galinčias pramoniniu mastu gaminti kai kuriuos „žmogaus“ baltymus.

1. Genų inžinerijos metodai

Labiausiai paplitęs genų inžinerijos metodas yra rekombinantinio gavimo būdas, t.y. turintis svetimą geną – plazmidę. Plazmidės yra apskritos dvigrandės DNR molekulės, susidedančios iš kelių nukleotidų porų. Plazmidės yra autonominiai genetiniai elementai, kurie bakterijos ląstelėje replikuojasi (t.y. dauginasi) kitu laiku nei pagrindinė DNR molekulė. Nors plazmidės sudaro tik nedidelę ląstelių DNR dalį, jos turi gyvybiškai svarbius bakterijoms genus, pavyzdžiui, atsparumo vaistams genus. Skirtingos plazmidės turi skirtingus antibakterinio atsparumo genus.

Dauguma šių vaistų, antibiotikų, naudojami kaip vaistai daugelio žmonių ir naminių gyvūnų ligų gydymui. Skirtingas plazmides turinti bakterija tampa atspari įvairiems antibiotikams ir druskoms sunkieji metalai. Kai tam tikras antibiotikas veikia bakterijų ląsteles, plazmidės, suteikiančios jam atsparumą, greitai pasklinda tarp bakterijų, išlaikydamos jas gyvas. Naudojamas plazmidžių paprastumas ir tai, kaip jos lengvai įsiskverbia į bakterijas genų inžinieriai genų įvedimui į bakterijų ląsteles aukštesni organizmai.

Fermentai – restrikcijos endonukleazės arba restriktazės – yra galingi genų inžinerijos įrankiai. Apribojimas pažodžiui reiškia „ribojimas“. Bakterijų ląstelės gamina restrikcijos fermentus, kad sunaikintų svetimą, pirmiausia fagų, DNR, o tai būtina virusinei infekcijai apriboti. Restrikcijos fermentai atpažįsta tam tikras nukleotidų sekas ir vienodais atstumais nuo atpažinimo vietos centro DNR grandinėse įveda simetriškus, įstrižai pertraukas. Dėl to kiekvieno ribotos DNR fragmento galuose susidaro trumpos vienos grandinės „uodegos“ (dar vadinamos „lipniais“ galais).

Visas bakterijų gavimo procesas, vadinamas klonavimu, susideda iš nuoseklių etapų:

1. Restrikcijos – žmogaus DNR supjaustymas restrikcijos fermentu į daugybę skirtingų fragmentų, bet su tais pačiais „lipniais“ galais. Tie patys galai gaunami pjaunant plazmidinę DNR tuo pačiu restrikcijos fermentu.

2. Ligacija – žmogaus DNR fragmentų įtraukimas į plazmides dėl „lipnių galų susiejimo“ su fermentu ligaze.

3. Transformacija – rekombinantinių plazmidžių įvedimas į bakterijų ląsteles, apdorotas specialiu būdu – kad jos trumpas laikas tapo pralaidūs makromolekulėms. Tačiau plazmidės prasiskverbia tik į dalį apdorotų bakterijų. Transformuotos bakterijos kartu su plazmide įgyja atsparumą tam tikram antibiotikui. Tai leidžia jas atskirti nuo netransformuotų bakterijų, kurios miršta terpėje, kurioje yra šio antibiotiko. Norėdami tai padaryti, bakterijos sėjamos ant maistinės terpės, prieš tai praskiestos taip, kad sėjant ląstelės būtų dideliu atstumu viena nuo kitos. Kiekviena iš transformuotų bakterijų dauginasi ir sudaro daugelio tūkstančių palikuonių koloniją – kloną.

4. Atranka – atranka tarp klonų tų bakterijų, kurios turi norimą žmogaus geną. Tam visos bakterijų kolonijos uždengiamos specialiu filtru. Kai jis pašalinamas, jis palieka kolonijų įspaudą, nes kai kurios kiekvieno klono ląstelės prilimpa prie filtro. Tada atliekama molekulinė hibridizacija. Filtrai panardinami į tirpalą, kuriame yra radioaktyviai pažymėtas zondas. Zondas yra polinukleotidas, papildantis norimo geno dalį. Jis hibridizuojasi tik su tomis rekombinantinėmis plazmidėmis, kuriose yra norimas genas. Po hibridizacijos rentgeno fotojuostos dedamos ant filtro tamsoje ir po kelių valandų išryškinamos. Apšviestų plotų padėtis ant plėvelės leidžia tarp daugelio transformuotų bakterijų klonų rasti tuos, kurie turi plazmides su norimu genu.

Ne visada įmanoma iškirpti norimą geną naudojant restrikcijos fermentus. Todėl kai kuriais atvejais klonavimo procesas prasideda tikslingai gavus norimą geną. Tam iš žmogaus ląstelių išskiriama mRNR, kuri yra šio geno transkripcijos kopija, o fermento atvirkštinės transkriptazės pagalba susintetinama jai komplementari DNR grandinė. Tada mRNR, kuri buvo DNR sintezės šablonas, sunaikinama specialiu fermentu, kuris gali hidrolizuoti RNR grandinę, suporuotą su DNR grandine. Likusi DNR grandinė naudojama kaip šablonas sintezei naudojant atvirkštinę transkriptazę, kuri papildo antrąją DNR grandinę.

Gauta DNR dviguba spiralė vadinama c-DNR (papildoma DNR). Tai atitinka geną, iš kurio buvo nuskaityta mRNR ir paleidžiama į sistemą su atvirkštine transkriptaze. Ši c-DNR įterpiama į plazmidę, kuri transformuoja bakterijas ir gamina klonus, kuriuose yra tik atrinkti žmogaus genai.

Norėdami atlikti genų perdavimą, turite atlikti šias operacijas:

· Tų genų, kurie yra skirti pernešimui, išskyrimas iš bakterijų, gyvūnų ar augalų ląstelių.

·Specialių genetinių konstrukcijų, kuriose numatyti genai bus įvesti į kitos rūšies genomą, sukūrimas.

· Genetinių konstrukcijų įvedimas iš pradžių į ląstelę, o paskui į kitos rūšies genomą ir modifikuotų ląstelių auginimas į ištisus organizmus.

2. Genų inžinerijos pasiekimai

genų inžinerija biotechnologija paveldimumas

Dabar jie gali sintetinti genus, o tokių susintetintų genų pagalba, įvedant į bakterijas, gaunama nemažai medžiagų, ypač hormonų ir interferono. Jų gamyba buvo svarbi biotechnologijos šaka.

Taigi 1980 metais augimo hormonas – somatotropinas – buvo gautas iš Escherichia coli bakterijos. Prieš genų inžinerijos vystymąsi jis buvo izoliuotas iš lavonų hipofizės. Specialiai sukurtose bakterinėse ląstelėse sintetinamas somatotropinas turi akivaizdžių pranašumų: jo yra dideliais kiekiais, jo preparatai yra biochemiškai gryni, be virusinių teršalų.

1982 metais hormonas insulinas buvo pradėtas gaminti pramoniniu mastu iš bakterijų, turinčių žmogaus insulino geną. Iki tol insulinas buvo izoliuojamas iš paskerstų karvių ir kiaulių kasos, o tai buvo sunku ir brangu.

Interferonas – baltymas, kurį organizmas sintetina reaguodamas į virusinę infekciją, dabar tiriamas kaip galimas vėžio ir AIDS gydymo būdas. Norint gauti tokį interferono kiekį, kokį suteikia vos vienas litras bakterijų kultūros, prireiktų tūkstančių litrų žmogaus kraujo. Akivaizdu, kad masinės šios medžiagos gamybos nauda yra labai didelė. Labai svarbų vaidmenį atlieka ir mikrobiologinės sintezės pagrindu gaunamas insulinas, būtinas diabetui gydyti. Genų inžinerija taip pat buvo panaudota kuriant daugybę vakcinų, kurios dabar bandomos siekiant patikrinti jų veiksmingumą prieš AIDS sukeliantį žmogaus imunodeficito virusą (ŽIV).

Kita perspektyvi medicinos sritis, susijusi su rekombinantine DNR, yra genų terapija. Šiuose darbuose, kurie dar nepaliko eksperimentinės stadijos, į organizmą įvedama genetiškai modifikuota geno kopija, koduojanti galingą priešnavikinį fermentą, siekiant kovoti su naviku. Genų terapija taip pat pradėta taikyti kovojant su paveldimais imuninės sistemos sutrikimais.

Žemės ūkyje dešimtys maistinių ir pašarinių augalų buvo genetiškai modifikuoti. Gyvulininkystėje biotechnologiškai pagaminto augimo hormono naudojimas padidino primilžį; Vakcina nuo kiaulių herpeso buvo sukurta naudojant genetiškai modifikuotą virusą.

3. Genų inžinerija: privalumai ir trūkumai

Nepaisant akivaizdžios genetinių tyrimų ir eksperimentų naudos, pati „genų inžinerijos“ sąvoka sukėlė įvairių įtarimų ir baimių, tapo nerimo ir net politinių ginčų objektu. Daugelis baiminasi, kad, pavyzdžiui, koks nors virusas, sukeliantis vėžį žmonėms, bus patekęs į bakteriją, kuri paprastai gyvena žmogaus organizme arba ant odos, ir tada ši bakterija sukels vėžį. Taip pat gali būti, kad plazmidė turi atsparumo geną vaistai, bus suleista į pneumokoką, ko pasekoje pneumokokas taps atsparus antibiotikams ir plaučių uždegimas nebus gydomas. Tokie pavojai neabejotinai egzistuoja.

Genų inžinerija yra galingas būdas pakeisti gyvenimą, tačiau jos potencialas gali būti pavojingas, pirmiausia atsižvelgiant į sudėtingą ir sunkiai nuspėjamą poveikį, susijusį su galimas poveikis apie aplinką. Įsivaizduokite nuodą, kurį pagaminti pigiau nei sudėtingus selektyvius herbicidus, bet kurių negalima naudoti žemės ūkio technologijoje, nes naikina naudingus augalus ir piktžoles. Dabar įsivaizduokite, kad, tarkime, į kviečius buvo įvestas genas, dėl kurio jie atsparūs šiems nuodams. Ūkininkai, apsėję savo laukus transgeniniais kviečiais, gali nebaudžiami juos apdulkinti mirtinais nuodais, padidindami savo pajamas, bet padarydami nepataisomą žalą aplinkai. Kita vertus, genetikai gali pasiekti priešingą efektą, jei išaugins pasėlius, kuriems nereikia herbicidų.

Genų inžinerija žmonijai pateikė unikalų iššūkį. Ką mums atneša genų inžinerija – laimę ar nelaimę? APIE galimas pavojus Visas pasaulis jau trimituoja apie genetiškai modifikuotus produktus žmonių sveikatai. Šiuo klausimu tarp mokslininkų nėra aiškios ir vieningos nuomonės. Vieni mano, kad genų inžinerija išgelbės žmoniją nuo bado, kiti mano, kad genetiškai modifikuotas maistas sunaikins visą gyvybę žemėje kartu su žmonėmis. Su šiuo teiginiu susiję mokslininkai teigia, kad genetiškai modifikuoti augalai yra produktyvesni, atsparesni pesticidams ir ekonomiškai pelningesni nei įprastiniai. Todėl jie yra ateitis. Tačiau su šio gaminio gamintojais nesusiję ekspertai toli gražu nėra optimistiški.

Numatyti ilgalaikes pasekmes, kurios gali kilti dėl genetiškai modifikuotų produktų vartojimo, šiuo metu visiškai neįmanoma. Gana ramus požiūris į GM produktus (genetiškai modifikuotus) vyrauja JAV, kur šiandien užauginama apie 80 procentų viso maisto. genetiniai augalai. Europa į tai žiūri itin neigiamai. Spaudžiamos visuomenės ir vartotojų organizacijų, norinčių sužinoti, ką valgo, kai kurios šalys įvedė moratoriumą tokių produktų importui (Austrija, Prancūzija, Graikija, Didžioji Britanija, Liuksemburgas).

Kiti priėmė griežtą reikalavimą ženklinti genetiškai modifikuotą maistą, kuris, natūralu, tiekėjams nelabai patiko. 2000 metų liepos 1 dieną Rusija uždraudė prekiauti genetiškai modifikuotais produktais be specialios įspėjamosios etiketės ant pakuotės. Vienas pirmųjų mokslininkų, paskelbusių pavojaus signalą apie galimą GM produktų pavojų, buvo britų profesorius Arpadas Pusztai. Jis pavadino juos „zombių maistu“. Tokios išvados buvo padarytos remiantis eksperimentų su žiurkėmis, maitinamomis genetiškai modifikuotu maistu, rezultatais. Gyvūnai patyrė daugybę rimtų virškinimo trakto, kepenų, strumos ir blužnies pokyčių. Didžiausią susirūpinimą kėlė tai, kad sumažėjo žiurkių smegenų tūris.

Mokslininkai mano, kad genetiškai modifikuotų augalų pagalba galima sumažinti derliaus nuostolius. Šiandien Rusijoje baigiami Kolorado vabalui atsparių amerikietiškų bulvių bandymai. Galbūt šiemet tam bus gautas leidimas. pramoninės gamybos. Tokios veislės turi vieną reikšmingą „bet“. Gavus augalą su smarkiai padidintu atsparumu kenkėjui, po dviejų ar trijų kartų šis kenkėjas prisitaikys prie augalo ir dar labiau jį prarys. Vadinasi, atsparios bulvės gali sukelti agresyvių kenkėjų, su kuriais pasaulis dar nebuvo susidūręs.

4. Genų inžinerijos perspektyvos

Tikras radinys genetikams buvo gintaras, iškastinė medžio sakai. Priešistoriniais laikais joje dažnai sušaldavo vabzdžiai, žiedadulkės, grybų sporos, augalų liekanos. Tekanti sakai hermetiškai apgaubė savo belaisvius, ir biologinė medžiaga laukia sveiki ir sveiki šiuolaikiniai tyrinėtojai. O 1990 metais George'as O. Poinaras iš Kalifornijos universiteto padarė sensacingą atradimą. Tyrinėdamas termitus, įstrigusius gintare prieš 40 milijonų metų, jis rado gerai išsilaikiusią genetinę informaciją. Vėliau Poinarui pavyko iš gintaro išskirti prieš 120 milijonų metų gyvenusio straubliuko DNR! Dabar daugelis mokslininkų stengiasi prikelti dinozaurus, senovės driežus ir mamutus. Ir tai nebeatrodo fantastiška, kaip buvo prieš keletą metų. Tačiau mokslininkai neketina sustoti ties gyvūnų prisikėlimu. Jei galite juos prikelti, tai tą patį galima padaryti ir su žmonėmis.

Mokslo plėtra suteikia mums potencialą ir blogam, ir gėriui. Taigi svarbu, ką mes darome teisingas pasirinkimas. Pagrindinis sunkumas yra politinio pobūdžio - išspręsti klausimą, kas yra „mes“ šiame sakinyje. Jei šis klausimas bus paliktas rinkos elementams, greičiausiai nukentės ilgalaikiai aplinkos interesai. Tačiau tai galima pasakyti apie daugelį kitų gyvenimo aspektų.

Naudotos literatūros sąrašas

1. Neiman B.Ya. Mikrobų pramonė. – Žinios, 1983 m.

2. Ruvinsky A.O. Bendroji biologija. – Švietimas, 1994 m.

3. Čebyševas N.V. Biologija. − Naujoji banga, 2005 m.

GENETINĖ INŽINERIJA(sin. genų inžinerija) - molekulinės biologijos ir genetikos tyrimų kryptis, galutinis tikslas Tai yra organizmų, turinčių naujų, įskaitant ir neaptinkamus gamtoje, paveldimų savybių derinių, gamyba naudojant laboratorinius metodus. G. širdyje ir. slypi galimybė tikslingai manipuliuoti nukleorūgščių fragmentais dėl naujausių molekulinės biologijos ir genetikos pasiekimų. Šie pasiekimai apima genetinio kodo universalumo nustatymą (žr.), t. y. tai, kad visuose gyvuose organizmuose tų pačių aminorūgščių įtraukimas į baltymo molekulę yra koduotas tomis pačiomis nukleotidų sekomis DNR grandinėje; genetinės enzimologijos sėkmė, kuri suteikė tyrėjui fermentų rinkinį, leidžiantį gauti atskirus genus ar nukleino rūgšties fragmentus izoliuota forma, atlikti nukleino rūgšties fragmentų sintezę in vitro ir sujungti gautus fragmentus į viena visuma. Taigi keičiant paveldimas organizmo savybes su G. ir. susideda iš naujos genetinės medžiagos konstravimo iš įvairių fragmentų, šios medžiagos įvedimo į recipiento organizmą, sąlygų jo funkcionavimui ir stabiliam paveldėjimui sudarymą.

Vienas iš būdų gauti genus yra cheminis. sintezė. Po to, kai A. Holli JAV, A. A. Baev SSRS ir kiti tyrinėtojai sugebėjo iššifruoti įvairių transportinių RBHA (tRNR) struktūrą, X. Korana ir kt. kepimo mielių alanino tRNR koduojančios DNR sintezė.

Bet veiksmingiausias dirbtinės genų sintezės metodas siejamas su fermento RNR priklausomos DNR polimerazės (atvirkštinės transkriptazės), atrasto D. Baltimorės ir H. Temino, panaudojimu onkogeniniuose virusuose (žr.). Šis fermentas buvo išskirtas ir išgrynintas iš ląstelių, užkrėstų tam tikrais RNR turinčiais onkogeniniais virusais, įskaitant paukščių mieloblastozės virusą, Rous sarkomos virusą ir pelių leukemijos virusą. Atvirkštinė transkriptazė užtikrina DNR sintezę pasiuntinio RNR (mRNR) šablone. MRNR molekulių naudojimas kaip DNR sintezės šablonas labai palengvina dirbtinę aukštesniųjų organizmų atskirų struktūrinių genų sintezę, nes seka azoto bazės mRNR molekulėje yra tiksli atitinkamų struktūrinių genų azotinių bazių sekos kopija, o įvairių mRNR molekulių išskyrimo technika yra gana gerai išvystyta. Pažanga išskiriant globino baltymo mRNR, kuris yra žmonių, gyvūnų ir paukščių hemoglobino dalis, akies lęšio baltymo mRNR, imunoglobino mRNR, specifinio baltymo mRNR piktybinis navikas(mieloma) leido, naudojant atvirkštinę transkriptazę, susintetinti kai kuriuos iš šių baltymų koduojančių genų struktūrinę dalį.

Tačiau organizme struktūriniai genai funkcionuoja kartu su reguliuojančiais genais, kurių nukleotidų sekos neatkuria iRNR molekulė. Todėl nė vienas iš šių metodų neleidžia sintezuoti struktūrinių ir reguliavimo genų rinkinio. Šios problemos sprendimas tapo įmanomas sukūrus atskirų genų išskyrimo metodus. Bakterijų genams išskirti naudojamos mažos DNR turinčios citoplazminės struktūros, kurios gali replikuotis (žr. Replikacija) nepriklausomai nuo bakterijos chromosomos. Šios struktūros sudaro vieną ekstrachromosominių bakterijų genetinių elementų grupę – plazmides (žr. Plazmidės). Kai kurios iš jų gali būti įtrauktos į bakterijų chromosomą ir vėliau spontaniškai arba veikiamos indukuojančių medžiagų, pvz. Apšvitinus UV spinduliais, iš chromosomos pereina į citoplazmą, pasiimdamas su savimi gretimus šeimininko ląstelių chromosomų genus. Tokias savybes turinčių bakterijų ekstrachromosominiai genetiniai elementai vadinami episomomis [F. Jacob, Wollman (E. Wollman)]. Episomos (žr.) apima vidutinio klimato fagus (žr. Bakteriofagas), bakterijų lytinį faktorių, mikroorganizmų atsparumo vaistams veiksnius (žr.), bakteriocinogeninius veiksnius (žr.). Citoplazmoje genai, užfiksuoti episomomis, yra replikuojami jose ir dažnai sudaro kelias kopijas. Sukurti veiksmingą metodą, skirtą plazmidžių, ypač vidutinio klimato fagų, turinčių bakterijų chromosomos genetinę medžiagą, išskyrimui ir į bakteriofago genomą įtrauktos bakterinės ląstelės chromosomos fragmento išskyrimą, leido J. Beckwith ir kt., 1969 m. išskirti laktozės operoną – genų grupę, kuri kontroliuoja E. coli laktozės absorbcijai reikalingų fermentų sintezę. Panašus metodas buvo naudojamas tirozino sintezę kontroliuojančiam genui išskirti ir išvalyti pernešti RNR Escherichia coli (žr. Ribonukleino rūgštys).

Plazmidžių naudojimas leidžia gauti beveik bet kokius bakterijų genus izoliuota forma, taigi ir galimybę sukurti DNR molekules iš įvairių šaltinių. Tokios hibridinės struktūros gali kauptis ląstelėse dideliais kiekiais, nes daugelis plazmidžių tam tikromis sąlygomis intensyviai replikuojasi bakterijų citoplazmoje, sudarydamos dešimtis, šimtus ir net tūkstančius kopijų.

Sėkmės G. ir. susijęs su skirtingų genetinių struktūrų derinimo metodų kūrimu šaltinių vienoje DNR molekulėje. Konstruojant hibridines molekules in vitro lemiamas veiksnys buvo restrikcijos endonukleazių – specialių fermentų, galinčių perpjauti DNR molekules griežtai apibrėžtose srityse, naudojimas. Tokie fermentai buvo rasti Escherichia coli ląstelėse, turinčiose R tipo plazmides, kurios lemia bakterijų atsparumą tam tikriems vaistams, Haemophilus influenzae, Serratia marcescens ir kitų mikroorganizmų ląstelėse. Vienas iš dažniausiai naudojamų tokio tipo fermentų yra restrikcijos endonukleazė EcoRI, sintezuojama RI plazmidės E. coli ląstelėse. Fermentas atpažįsta DNR atkarpą su unikalia šešių nukleotidų porų seka ir šioje sekcijoje perpjauna dvigrandės DNR struktūrą taip, kad iš abiejų pusių susidaro viengrandžiai keturių nukleotidų galai (vadinamieji lipnūs galai). Kadangi fermentas pjauna DNR molekules, nepaisant jų kilmės, griežtai apibrėžtu būdu, visi dėl fermento veikimo susidarę DNR fragmentai turės vienodus lipnius galus. Bet kurių DNR fragmentų papildomi lipnūs galai yra sujungti vandeniliniais ryšiais, sudarydami hibridinę žiedinę DNR (pav.). Hibridinei DNR molekulei stabilizuoti naudojamas kitas fermentas – polinukleotidų ligazė, kuri redukuoja kovalentiniai ryšiai, sulaužytas restrikcijos fermento. EcoRI specifiškai atpažįstama seka DNR atsiranda ne dažniau kaip po 4000–16 000 bazinių porų. Vadinasi, DNR fragmentas, susidaręs veikiant EcoRI, gali apimti bent vieną geną, kuris nėra pažeistas fermento (viename gene vidutiniškai yra 1000-1500 nukleotidų porų).

Restrikcijos endonukleazių ir daugelio kitų fermentų naudojimas leidžia gauti sudėtingą rekombinantinę DNR. JAV mokslininkų grupei, vadovaujamai P. Bergo, pavyko sujungti genetinę informaciją iš trijų šaltinių į vieną DNR molekulę: visą onkogeninio pamynių viruso SV40 genomą (žr.), vidutinio klimato bakteriofago λ genomo dalį ir E. coli genų grupė, atsakinga už galaktozės asimiliaciją. Sukurtos rekombinantinės molekulės funkcinis aktyvumas nebuvo išbandytas, nes šio darbo autoriai sustojo galimas pavojus onkogeninių gyvūnų virusų plitimas žmogaus žarnyne gyvenančių bakterijų populiacijoje. Yra žinoma, kad išgryninta viruso DNR gali prasiskverbti į įvairias žinduolių ląsteles ir būti jų stabiliai paveldima.

Pirmą kartą funkciškai aktyvias hibridines DNR molekules sukonstravo JAV S. Cohen ir kt. Coheno grupė nuosekliai sprendė DNR molekulių, išskirtų iš rūšių, kurios filogenetiškai vis labiau nutolsta viena nuo kitos, telkimo ir klonavimo (selektyvaus kaupimo) problemą. Klonavimo procedūra paprastai susideda iš įvairių šaltinių DNR fragmentavimo naudojant restrikcijos endonukleazes, po to šiuos fragmentus sujungiant in vitro į bendra struktūra ir suleidžiama į recipiento organizmą, kuris Coheno eksperimentuose yra Escherichia coli. Nustatyta, kad kelių tipų bakterijų (įskaitant Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus) ląsteles galima transformuoti (žr. Transformacija) naudojant rekombinantines DNR molekules. Šiuo atveju hibridinės molekulės plazmidinė dalis (arba viena iš plazmidžių, jei hibridinėje molekulėje sujungtos dvi skirtingų šaltinių plazmidės) atlieka vektorius, t.y. užtikrina filogenetiškai svetimos genetinės medžiagos perkėlimą į recipiento ląsteles. ir jos dauginimasis juose. Pirmoji plazmidė, kurią Cohenas ir kt. naudojo kaip vektorių, buvo jo in vitro gauta pSC101 plazmidė, kuri kontroliuoja bakterijų atsparumą tetraciklinui. Šią mažą plazmidę sudaro tik 8000 bazinių porų. EcoRI fermentas jį atakuoja tik vienoje vietoje, o fermentas nepažeidžia plazmidės gebėjimo vėliau daugintis E. coli ląstelėse ir kontroliuoti atsparumą tetraciklinui. Šios savybės leido jį panaudoti hibridinėms DNR molekulėms in vitro konstruoti. Pirmuosiuose etapuose prie pSC101 buvo prijungta plazmidinė DNR, išskirta iš įvairių tipų bakterijų, o vėliau iš aukštesnių organizmų. Taigi buvo sukurtos „chimerinės“ plazmidės (t. y. negalinčios atsirasti natūraliomis sąlygomis), savo sudėtyje sujungusios Escherichia coli genetinę medžiagą, DNR dalį iš nagotosios varlės Xenopus laevis oocitų, kuri kontroliuoja varlių sintezę. ribosomų RNR ir DNR dalis jūros ežiukas, kuri kontroliuoja histono baltymų arba pelės mitochondrijų DNR sintezę. E. coli ląstelėse, į kurias buvo įvestos tokios hibridinės, „chimerinės“ plazmidės, buvo užfiksuotas aukštesniųjų organizmų genų funkcionavimas.

Priešingai nei pSC101, kurio ląstelėje yra tik 4–6 kopijos, kai kurios kitos plazmidės, naudojamos kaip vektoriai, tam tikromis sąlygomis gali daugintis kelis kartus, sukurdamos kelis tūkstančius kopijų vienoje ląstelėje. Tokias savybes, pavyzdžiui, turi ColEI plazmidė, kuri kontroliuoja kolicino sintezę (žr. Bakteriocinogenija). Kaip ir pSC101, ColEI pjauna EcoRl fermentas tik vienoje vietoje, o svetima DNR, taip pat apdorota EcoRI, lengvai prijungiama prie gautos linijinės molekulės lipniais galais. Taigi buvo galima „susieti“ Escherichia coli triptofano operono genus su ColEI. Ląstelėse, turinčiose daugybę sukurtos hibridinės plazmidės kopijų, fermentų baltymų, kuriuos kontroliuoja triptofano biosintezės genai, gamyba smarkiai padidėjo. In vitro sistemoje ColEI plazmidę buvo galima prijungti prie tam tikrų R faktorių ir vidutinio klimato fago. Panašus darbas pirmą kartą buvo atliktas SSRS, vadovaujant akademikui A. A. Bajevui ir profesoriui S. I. Alikhanyan. ColEI ir R faktorių suformuotos kombinuotos vektorinės plazmidės gali intensyviai daugintis bakterijų ląstelėse, tokiose kaip ColEI, ir tuo pačiu nustatyti ląstelių atsparumą antibiotikams, o tai labai supaprastina hibridines plazmides nešiojančių bakterijų atranką.

Vidutinio klimato fagai taip pat naudojami kaip vektoriai. In vitro sistemoje buvo sukonstruotos hibridinės bakteriofagų dalelės, kurios į savo struktūrą įtraukė bakterijų genus, kitų fagų ar aukštesnių organizmų DNR (pavyzdžiui, vaisinės muselės Drosophila DNR).

Hibridinių DNR funkcinį aktyvumą nulemia jų pernešimo į organizmų recipientų ląsteles ir tolesnio dauginimosi (amplifikacijos) galimybė šiose ląstelėse. Ne tik bakterijos, kaip minėta aukščiau, bet ir aukštesniųjų organizmų ląstelės jau efektyviai naudojamos kaip recipientai, tačiau kol kas tik audinių kultūros, auginamos už kūno ribų, pavidalu. Yra požymių, kad DNR iš fagų, pernešančių bakterijų genus, gali prasiskverbti į ląsteles jungiamojo audiniožmonių (fibroblastų), į protoplastus arba į nediferencijuotą augalų ląstelių kultūrą (kalusą). 1971 metais Amer. tyrėjas S. R. Merril ir kt. pranešė apie eksperimentus, skirtus ištaisyti paveldimą defektą - galaktozemiją (žr.), įvedant į „sergančias“ ląsteles bakterijų, įtrauktų į transdukuojančio fago DNR, galaktozės genus. Dėl to paciento, sergančio galaktozemija, turinčios fermento beta-D-galaktozės-1-fosfato uridiltransferazės defektus ir negalinčios metabolizuoti galaktozės, ląstelės atkūrė normalų gebėjimą augti esant galaktozei ir buvo užfiksuotas anksčiau nebuvęs fermentinis aktyvumas. jų ištraukose. Panašų rezultatą gavo J. Horstas ir kt., kai į paciento, sergančio generalizuota gangliozidoze, kuriai būdingas didelis šio fermento trūkumas, fibroblastus įvedęs bakterinį geną, kuris kontroliuoja beta-galaktozidazės sintezę. Munyon (W. Munyon) ir jo bendradarbiai. naudojant herpeso virusą, jie perkėlė geną, kontroliuojantį timidinkinazės sintezę iš žmogaus ląstelių į pelių ląsteles, taip atkurdami defektuotų pelių fibroblastų gebėjimą sintetinti šį fermentą.

Vienas iš genetinės informacijos perdavimo būdų žmogaus, gyvūnų ir augalų ląstelių kultūroje yra hibridizacija somatinės ląstelės, sukūrė Ephrussi (V. Ephrussi) ir Barskis (G. Barski). Šio metodo veiksmingumas labai padidėjo, kai buvo nustatyta, kad inaktyvuotos Sendai paragripo viruso dalelės padidina ląstelių susiliejimo iš įvairių šaltinių dažnį. Įrodyta galimybė perkelti atskirus genus iš izoliuotų kininių žiurkėnų chromosomų į pelių jungiamojo audinio ląsteles. Aprašyti žmogaus ir pelės ląstelių hibridai, kuriuose dalis žmogaus chromosomų pašalinama, o dalis išlieka funkciškai aktyvios. Ląstelių mikrochirurgijos metodų tobulėjimas leido persodinti ląstelių branduoliai iš somatinių ląstelių į apvaisintus kiaušinėlius ir dėl to gauti absoliučiai identiškus organizmus. Ląstelių hibridizacija leido paskatinti žmogaus globino sintezę varlių gemalo ląstelėse. Visi šie pavyzdžiai parodo galimas G. ir galimybes.

Praktinė G. reikšmė ir. medicinai siejama su perspektyvomis koreguoti paveldimus žmogaus medžiagų apykaitos defektus (žr. Genų terapija), sukurti mikroorganizmus, praradusius patogeniškumą, tačiau išlaikančius imunitetą, antibiotikų, aminorūgščių, hormonų, vitaminų, fermentų, imunoglobulinų sintezę. ir tt, remiantis mikroorganizmų, įtraukusių atitinkamus genus, naudojimu. Išskirtinių rezultatų artimiausiu metu gali pasiekti G. ir. augalai. Naudojant G. metodus ir. Jie bando sukurti augalus, kurie galėtų absorbuoti atmosferos azotą ir pagerinti augalinio maisto baltymų sudėtį. Sėkmingas šių problemų sprendimas žymiai padidins augalų produktyvumą, sumažins mineralinio azoto gamybą ir suvartojimą, o tai žymiai pagerins aplinką (žr.). Tiriama galimybė sukurti visiškai naujas gyvūnų ir augalų formas, įveikiant tarprūšines kryžminimosi kliūtis. Tačiau vertinant G. ir. Kaip nauja forma kuriant gyvąją gamtą reikėtų atsižvelgti ne tik į galimą revoliucinį jos vaidmenį biologijoje, medicinoje ir žemės ūkyje, bet ir į naujų formų patogeninių mikroorganizmų atsiradimo galimybę, atsirandančius dėl jos vystymosi, hibridinės DNR plitimo pavojų. Onkogeniniai virusai žmonių bakterijų populiacijose ir tt Žinoma, sąmoningai panaudoti mokslo, įskaitant geologiją, pasiekimus nežmoniškiems, mizantropiniams tikslams galima tik visuomenėje, kurioje žmogaus gėris aukojamas siekiant pelno ir agresija.

Iš papildomų medžiagų

Genų inžinerija ir toliau yra sparčiai tobulėjantis molekulinės biologijos ir genetikos tyrimų metodas. Pažymėtina, kad sąvokos „genų inžinerija“ ir „genų inžinerija“ nėra visiški sinonimai, nes su genų inžinerija susiję tyrimai neapsiriboja vien manipuliavimu genais kaip tokiais. Šiuo metu genų inžinerijos metodai leidžia atlikti kuo nuodugniausius ir išsamią analizę natūralios nukleorūgštys – medžiagos, atsakingos už genetinės informacijos saugojimą, perdavimą ir įgyvendinimą (žr. Nukleino rūgštys.), taip pat sukurti modifikuotus arba visiškai naujus, gamtoje nebūnamus genus (žr. Genas), genų derinius ir dideliu efektyvumu juos išreikšti gyvoje ląstelėje (žr. Genų ekspresyvumas). Iš konkretaus praktiniai pasiekimai genų inžinerija in praėjusį dešimtmetį Svarbiausia turėtų būti biologiškai aktyvių baltymų – insulino (žr.), interferono (žr.), augimo hormono (žr. Somatotropinis hormonas) ir kt. – gamintojų sukūrimas, taip pat genų inžinerijos metodų, skirtų toms metabolizmo dalims aktyvuoti, sukūrimas. , kuris siejamas su mažos molekulinės masės biologiškai aktyvių medžiagų susidarymu. Tokiu būdu buvo gauti tam tikrų antibiotikų, amino rūgščių ir vitaminų gamintojai, daug kartų efektyvesni nei šių medžiagų gamintojai, išvesti tradiciniais genetikos ir selekcijos metodais. Kuriami grynų baltymų vakcinų nuo hepatito, gripo, herpeso, snukio ir nagų ligos virusų gavimo metodai, įgyvendinta vakcinacijos vakcinos virusu, kurio genome yra genų, koduojančių kitų virusų (pavyzdžiui, hepatito ar gripo virusų) baltymų sintezė: paskiepijus tokiu būdu pagamintu virusu, organizme susidaro imunitetas ne tik nuo raupų, bet ir nuo hepatito, gripo ar kitos to viruso sukeltos ligos. , kurio baltymą koduoja įmontuotas genas.

Pasaulinė restrikcijos endonukleazių, restrikcijos fermentų – pagrindinių genų inžinerijos manipuliacijų „įrankių“ – kolekcija gerokai išaugo. Išskirta daugiau nei 400 restrikcijos fermentų, kurie „atpažįsta“ apytiksliai. 100 struktūriškai skirtingų specifinių regionų (vietų) DNR molekulėse (žr. Dezoksiribonukleino rūgštys) ir šiose vietose suskaido DNR polinukleotidinę grandinę. Naudojant vieną tokį fermentą arba kelių restrikcijos fermentų derinį, iš vieno ar kelių DNR fragmentų (vadinamųjų restrikcijos fragmentų) galima išskirti beveik bet kurį geną. Tai praplėtė genų inžinerijos galimybes ne tik genų išskyrimo, bet ir jų darbo aktyvinimo, genų struktūros ir jų molekulinės aplinkos analizės požiūriu. Sukurti ištisų genų su tam tikra nukleotidų seka sintezės metodai, atsirado galimybė susintetintus ir natūralius genus aprūpinti įvairiomis reguliuojančiomis nukleotidų sekomis, griežtai apibrėžtose geno dalyse pakeisti, įterpti, ištrinti pavienius nukleotidus, sutrumpinti arba užbaigti; jo nukleotidų grandinę vieno nukleotido tikslumu.

Genų inžinerijos pasiekimas buvo jos įsiskverbimas į aukštesniųjų organizmų, įskaitant žmones, ląstelių paveldimumo mechanizmų organizavimą ir funkcionavimą. Būtent apie aukštesniuosius eukariotus buvo gauti patys įdomiausi duomenys naudojant genų inžinerijos metodus. Genų inžinerijos sėkmė daugiausia siejama su naujų specializuotų vektorių, leidžiančių efektyviai klonuoti (atgaminti) atskirus DNR fragmentus (genus) ir sintetinti šių genų koduojamus baltymus, gamyba.

Restrikcijos fragmentai, susieti su DNR vektoriais, klonuojami į gyvą ląstelę, pasinaudojant tokių vektorių galimybe daugintis (replikuotis) ląstelėje keliomis kopijomis. Priklausomai nuo klonuojamų fragmentų dydžio ir tyrimo tikslo, naudojami vieno iš keturių tipų vektoriai – plazmidės (žr.), fagai (žr. Bakteriofagas), kosmidai arba fagų dariniai su vienagrande DNR.

Palyginti mažiems DNR fragmentams (iki 10 tūkst. bazinių porų) klonuoti naudojami plazmidiniai vektoriai (pBR322, pAT 153, pUR250, pUC19 ir kt.). Genų inžinerijos pasiekimai pastaraisiais metais buvo vektorių, pagrįstų X fagu (Charon 4A, gtwes-B), gamyba, kurioje dalis genomo buvo pakeista svetimos DNR fragmentu. Hibridinis genomas yra dirbtinai "supakuotas" į baltymo apvalkalą, o bakterijos yra užkrėstos šiuo rekonstruotu fagu. Reprodukcijos metu ląstelėje susidaręs kelis tūkstančius kopijų, rekonstruotas fagas ją lizuoja ir išleidžiamas į auginimo terpę. Naudojant tokius vektorius, klonuojami 10-25 tūkstančių bazinių porų ilgio DNR fragmentai.

Kosmidų vektoriai (pIB8, MUA-3) yra fago X ir plazmidės hibridas. Juose yra vadinamųjų. Fago DNR COS sekos, reikalingos fago genomams supakuoti į baltymo apvalkalą, ir plazmidinės DNR dalis, leidžianti kosmidiniams vektoriams daugintis bakterijose taip pat, kaip tai daro plazmidės. Taigi, gautas rekombinantinis genomas užkrečia bakterijas labai efektyviai kaip bakteriofagas, tačiau dauginasi jose kaip plazmidė, nesukeldamas bakterinės ląstelės mirties. Kosmidai naudojami iki 35-45 tūkstančių bazinių porų ilgio DNR fragmentų klonavimui.

Vektoriai, kurie yra fagų, turinčių vienagrandę DNR (M13 mp8, M13, mp73 ir kt.) dariniai, yra sukonstruoti remiantis žiedine bakteriofago M13 DNR molekule. Norint integruoti svetimą DNR, naudojama replikacinė dvigrandė fago DNR molekulė. Vektorius, turintis svetimą DIC, įvedamas į bakterijų ląsteles, kur rekombinantinės molekulės dauginasi nelizuodamos ląstelės ir „nukrenta“ į auginimo terpę kaip virusinė dalelė su vienagrandė DNR molekule. Šie vektoriai naudojami DNR fragmentų (iki 300-400 nukleotidų porų) klonavimui.

Genų inžinerijos manipuliacijoms reikalingas genas gaunamas klonuojant atitinkamas rekombinantinės DNR molekules ir atrenkant tokius klonus. Tais atvejais, kai klonuojami aukštesniųjų organizmų ir žmonių genai, o ekspresija E. coli (dažniausiai naudojami tokiems tikslams) neįmanoma, klonavimo ir atrankos procedūra atliekama keliais etapais. Pirmajame etape jie sukuria vadinamąjį. genų biblioteka iš DNR fragmentų (klonuotų tiesiai iš ląstelės genomo) arba iš atitinkamos pasiuntinio RNR klonuotų DNR kopijų (cDNR). Lyginant genomo DNR fragmentų struktūrą ir atitinkamą kDNR, gaunama svarbi informacija apie genetinės medžiagos sandarą, o paveldimų ligų atveju – apie genetinės medžiagos anomalijų pobūdį, kurių pasekmė yra ši. liga. Iš genų bibliotekos, naudojant šiuolaikines technikas, galima išskirti reikiamą geną su jį supančiais genomo regionais. Šiuo metu yra sukurtos išbaigtos daugelio mikroorganizmų, augalų ir gyvūnų (įskaitant žinduolius ir žmones) genų bibliotekos. Keli šimtai genų ir kitų nukleotidų sekų žmogaus DNR jau buvo klonuoti ir vienaip ar kitaip ištirti.

Genų inžinerijos tyrimų galimybės neapsiriboja vien genų klonavimu ir gavimu didelis skaičius jo kopijų. Dažnai reikia ne tik klonuoti geną, bet ir užtikrinti jo ekspresiją ląstelėje, tai yra, jame esančią informaciją įdiegti į šio geno koduojamo baltymo polipeptidinės grandinės aminorūgščių seką. Jei į bakterijų ląstelę įvestas genas yra gautas iš tos pačios (ar panašios) rūšies bakterijų, tuomet pakanka išskirti geną su reguliavimo elementais, kurie kontroliuoja jo ekspresiją. Tačiau, išskyrus keletą išimčių, evoliuciniu požiūriu viena nuo kitos nutolusių organizmų reguliavimo nukleotidų sekos nėra keičiamos. Todėl siekiant, pavyzdžiui, eukarioto geno ekspresijos E. coli ląstelėse, iš jos pašalinama reguliavimo sritis, o tokio geno struktūrinė dalis (tam tikru atstumu) prijungiama prie reguliavimo srities. bakterinio geno. Didelė pažanga kuriant šią techniką buvo pasiekta atradus Ba131 nukleazės fermentą, turintį unikalią savybę hidrolizuoti abi dvigrandės linijinės DNR molekulės grandines pradedant nuo molekulės galo, t.y. šis fermentas pašalina „papildomas medžiagas“. “ bet kokio ilgio nukleotidų sekos nuo DNR fragmento galo . Šiuo metu struktūrinės ir reguliavimo sritys išskiriamos atskirai, naudojant tuos restrikcijos fermentus, kurių „atpažinimo“ vietos sėkmingiausiai išsidėsčiusios polinukleotidų grandinėje, tada pašalinamos „papildomos“ nukleotidų sekos ir sujungiama eukarioto geno struktūrinė sritis. į bakterinio geno reguliavimo sritį. Tokiu būdu galima pasiekti ne tik eukariotų genų ekspresiją bakterijų ląstelėse, bet ir atvirkščiai – bakterijų genų aukštesnių ir žemesnių eukariotų ląstelėse.

Genų inžinerijos sėkmė yra glaudžiai susijusi su nukleotidų sekos nustatymo (sekvenavimo) metodų DNR molekulėse sukūrimu ir tobulinimu. Nemažai tyrėjų dispozicijoje esančių restrikcijos fermentų leidžia išskirti tam tikrus DNR fragmentus su absoliučiu specifiškumu, o klonavimo metodų tobulinimas ir tobulinimas leidžia gauti net unikalių genų fragmentus tokiais kiekiais, kiek reikia analizei. DNR sekos nustatymo metodai pasirodė esą tokie veiksmingi, kad dažnai, nustatant DNR nukleotidų seką, gaunami duomenys apie nukleotidų seką atitinkamose RNR molekulėse ir aminorūgščių liekanų seką susintetinto baltymo molekulėje. Apdorojant DNR sekos nustatymo rezultatus, plačiai naudojami kompiuteriai. Išsamesniam ir greitesniam gautų eksperimentinių duomenų interpretavimui yra kuriami nacionaliniai ir tarptautiniai kompiuteriniai nukleotidų sekų „bankai“. Šiuo metu yra nustatytos pilnos daugelio bakterijų plazmidžių ir virusų genomų nukleotidų sekos, o pirmųjų atskirų chromosomų, o vėliau ir viso aukštesniųjų organizmų, įskaitant žmones, genomo pilnų nukleotidų sekos nustatymo problema jau sprendžiama. išspręsta.

Taikant genų inžinerijos metodus, buvo aptikti tam tikrų žmogaus genų dalių struktūros nukrypimai, kurie buvo paveldimų ligų priežastis. Dažniausiai šis metodas yra vadinamasis. b partijos analizė. Išskirta ląstelinė DNR yra hidrolizuojama restrikcijos fermentu, o gauti fragmentai atskiriami pagal dydį, naudojant elektroforezę agarozės arba poliakrilamido gelyje. Atskirti fragmentai perkeliami ("perspausdinami") ant specialiai apdoroto chromatografinio popieriaus, nitroceliuliozės arba nailono filtro ir vėl atskiriami elektroforetiniu būdu. Išpjaunamos elektroforegramos sritys, atitinkančios atskiras frakcijas ir turinčios panašių DNR fragmentų; nupjautos elektroferogramų atkarpos inkubuojamos su anksčiau klonuotu genu ar jo dalimi arba su chemiškai gautu. sintezė naudojant nukleotidų seką, turinčią radioaktyvią žymę. Pažymėta DNR jungiasi tik prie tų analizuojamos ląstelės DNR fragmentų, kurie turi komplementarias nukleotidų sekas. Fiksuotos etiketės pasiskirstymo ir kiekio pokytis, palyginti su norma, leidžia spręsti apie netoliese esančių analizuojamo geno ar nukleotidų sekų pertvarkymus.

Tam tikrų restrikcijos fermentų „atpažinimo“ vietos DNR molekulėje išsidėstę netolygiai, todėl hidrolizuojant šių fermentų DNR molekulė suskaidoma į daugybę įvairaus ilgio fragmentų. DNR struktūros pertvarkymas, dėl kurio išnyksta esamos „atpažinimo“ sritys arba atsiranda naujos „atpažinimo“ sritys, lemia šių fragmentų (vadinamųjų restrikcijos fragmentų) rinkinio pasikeitimą, t.y. atsiradimą. restrikcijos fragmento ilgio polimorfizmo (RFR). Pertvarkymai DNR molekulėje gali sukelti arba nesukelti pakitimų sintezės procese arba koduojamo baltymo struktūroje; pertvarkymų, kurie nesukelia pokyčių, yra dauguma, ir jie sukelia įprastą RFLP. Paaiškėjo, kad RFLP yra aiškus genetinis bruožas. Šiuo metu RFLP analizė tapo vienu tiksliausių metodų, naudojamų žmogaus genetikoje ir medicininėje genetikoje. Daugeliui paveldimų ligų buvo aprašytos RFLP formos, kurios tiesiogiai rodo ligos buvimą arba patologiškai pakitusio geno nešimą.

Genų inžinerija pažymėjo naujos tyrimų krypties, vadinamos „atvirkštine genetika“, pradžią. Tradicinė genetinė analizė (žr.) atliekama tokia seka: parenkamas požymis, nustatomas požymio ryšys su genetiniu determinantu ir nustatoma šio determinanto lokalizacija jau žinomų atžvilgiu. „Atvirkštinėje genetikoje“ viskas vyksta atvirkštine tvarka: parenkamas nežinomos funkcijos DNR fragmentas, nustatomas šio DNR fragmento ryšys su kitais genomo regionais ir ryšys su tam tikrais požymiais. Šis metodas leido sukurti ankstyvos diagnozės ir ligų, tokių kaip Huntingtono chorėja, Diušeno liga, cistinė fibrozė, diagnozavimo ir nustatymo metodus, kurių paveldimų defektų biocheminis pobūdis dar nėra žinomas. Taikant genealoginį Hantingtono chorėjos paveldimo perdavimo modelių nustatymo metodą, buvo įrodyta, kad G8 DNR fragmentas, išskirtas iš žmogaus genomo, yra glaudžiai susijęs su genu, lemiančiu ligą, ir naudojant G8 fragmento RFLP formą tam tikrame. populiacijos, galima diagnozuoti šią ligą ir nustatyti sugedusių genų nešiotojus.

Kelyje į įgyvendinimą medicinos praktika Vis dar yra daug techninių sunkumų, susijusių su genų inžinerijos metodais. Daugelis laboratorijų visame pasaulyje aktyviai kuria praktiškai tinkamus genų inžinerijos diagnostikos metodus ir galima tikėtis, kad tokie metodai artimiausiu metu ras pritaikymą, jei ne masiniam genetiniam sijojimui (atrankai) atliekant gyventojų medicininę apžiūrą, tai bent jau. atrankinis didelės rizikos grupių tyrimas dėl paveldimų ligų.

Genų inžinerija leidžia ne tik kopijuoti natūralius junginius ir procesus, bet ir juos modifikuoti bei padaryti efektyvesnius. To pavyzdys yra nauja tyrimų sritis, vadinama baltymų inžinerija. Skaičiavimai, atlikti remiantis duomenimis apie aminorūgščių seką ir baltymų molekulių erdvinį organizavimą, rodo, kad kai kurių fermentų molekulėse pakeitus tam tikrus aminorūgščių likučius, galimas reikšmingas jų fermentinio aktyvumo padidėjimas. Išskirtame gene, koduojančiame specifinio fermento sintezę, griežtai kontroliuojamas tam tikrų nukleotidų pakeitimas atliekamas naudojant genų inžinerijos metodus. Vykdant fermentinio baltymo sintezę, kontroliuojant tokį modifikuotą geną, polipeptidinėje grandinėje įvyksta iš anksto suplanuotas griežtai apibrėžtų aminorūgščių liekanų pakeitimas, dėl kurio fermentinis aktyvumas daug kartų padidėja, palyginti su natūralaus prototipo aktyvumu. .

Tikimasi, kad žemės ūkio srityje genų inžinerija daug prisidės prie naujų derlingų, sausrai, ligoms ir kenkėjams atsparių augalų veislių atrankos bei naujų labai produktyvių žemės ūkio veislių kūrimo. gyvūnai.

Kaip ir bet kuris mokslo laimėjimas, genų inžinerijos sėkmė gali būti panaudota ne tik naudos, bet ir žmonijos nenaudai. Specialiai atlikti tyrimai parodė, kad nekontroliuojamo rekombinantinės DNR plitimo pavojus nėra toks didelis, kaip manyta anksčiau. Paaiškėjo, kad rekombinantinė DNR ir jas pernešančios bakterijos yra labai nestabilios aplinkos poveikiui ir nėra gyvybingos žmonių ir gyvūnų organizmuose. Yra žinoma, kad gamtoje ir be žmogaus įsikišimo yra sąlygos, užtikrinančios aktyvų genetinės informacijos mainus, tai yra vadinamasis. genų srautas. Tačiau gamta sukūrė daug veiksmingų kliūčių svetimos genetinės informacijos prasiskverbimui į organizmą. Dabar akivaizdu, kad dirbant su dauguma rekombinantinių DNR molekulių visiškai pakanka įprastų atsargumo priemonių, kurias taiko, pavyzdžiui, mikrobiologai dirbdami su infekcine medžiaga. Už ypatingomis progomis Sukurti veiksmingi metodai tiek biologinei apsaugai, tiek fizinei eksperimentinių objektų izoliacijai nuo žmogaus ir aplinkos. Todėl labai griežtos pirmosios darbo su rekombinantine DNR taisyklių versijos buvo peržiūrėtos ir gerokai sušvelnintos. Kalbant apie tyčinį genų inžinerijos laimėjimų panaudojimą kenkti žmonėms, tiek mokslininkai, tiek visuomenė turi aktyviai kovoti, kad šis pavojus išliktų tik teoriškai įmanomas.

Taip pat žiūrėkite Biotechnologija.

Bibliografija: Alikhanyan S.I. Genų inžinerijos pažanga ir perspektyvos, Genetics, 12 t., Jvft 7, p. 150, 1976, bibliogr.; AlikhanyanS. I. et al. Veikiančių rekombinantinių (hibridinių) DNR molekulių paruošimas, in vitro, toje pačioje vietoje, I t., Nr. 11, p. 34, 1975, bibliogr.; Baev A. A. Genų inžinerija, Gamta, M1, p. 8, 1976; Tikhomirova L.P. ir kt. Fago X ir plazmidės ColEl hibridinės DNR molekulės, Dokl. SSRS mokslų akademija, t. 223, nr. 995, 1975, bibliogr.; Ruda D. D. a. S t e r n R. Genų išskyrimo metodai, Ann. Rev. Biochem., v. 43, p. 667, 1974, bibliogr.; C h a n g A. C. Y. a. o. Pelės mitochondrijų DNR tyrimai Escherichia coli, Cell, v. 6, p. 231,1975, bibliogr.; Hedgpethas J., Goodmanas H. M. a. B o y e r H. W. DNR nukleotidų seka, apribota R1 endonukleazės, Proc. nat. Akad. Sci. (skalbti.), v. 69, p. 3448, 1972, bibliogr.; Hershfield V. a. o. Plazmidė ColEl kaip molekulinė priemonė DNR klonavimui ir amplifikacijai, ten pat, v. 71, p. 3455, 1974; Rytoj J. F. a. o. Eukariotinės DNR replikacija ir transkripcija Escherichia coli, ten pat, p. 1743 m.; T e m i n H. M. a. Mizu-t ani S. Nuo RNR priklausoma DNR polimerazė Rous sarkomos viruso virionuose, Gamta (Lond.), v. 226, p. 1211 m., 1970 m.

Biotechnologija, red. A. A. Baeva, M., 1984; B o h k o v N. P., Zacharovas A. F. ir Ivanovas V. I. Medicininė genetika, M., 1984; M a n i a-tis G., FritschE. ir Sambrookas J. Genų inžinerijos metodai. Molekulinis klonavimas, trans. iš anglų k., M., 1984; A n t o n a r a k i s S. E. a. o. Žmogaus globino genų grupių DNR polimorfizmas ir molekulinė patologija, Hum. Genet., v. 69, p. 1, 1985; Beaudet A. L. Klonuotų žmogaus ir kitų pasirinktų DNR bibliografija, Amer. J. hum. Genet., v. 37, p. 386, 1985; V o t s t e i n D. a. o. Žmogaus genetinio ryšio žemėlapio sudarymas naudojant restrikcijos fragmento ilgio polimorfizmus, ten pat, v. 32, p. 314, 1980; G u s e 1 1 a J. E. a. o. DNR žymenys nervų sistemos ligoms, Mokslas, v. 225, p. 1320, 1984; Motulsky A. G. Genetinės manipuliacijos poveikis visuomenei ir medicinai, ten pat, v. 219, p. 135, 1983; Baltasis R. a. o. Glaudžiai susijęs genetinis cistinės fibrozės žymuo, Nature (Lond.), v. 318, p. 382, 1985; Wo o S. L. C., L i d s k y A. S. a. Guttler F. Prenatalinė klasikinės fenilketonurijos diagnozė genų kartografavimo būdu, J. Amer. med. As., v. 251, p. 1998, 1984 m.

L. S. Černinas, V. N. Kalininas.