Taikant žmonėms, genų inžinerija galėtų būti naudojama paveldimų ligų gydymui. Tačiau techniškai yra didelis skirtumas tarp paties paciento gydymo ir jo palikuonių genomo keitimo.

Suaugusio žmogaus genomo keitimo užduotis yra šiek tiek sudėtingesnė nei naujų genetiškai modifikuotų gyvūnų veislių veisimas, nes tokiu atveju reikia pakeisti daugelio jau susiformavusio organizmo ląstelių genomą, o ne tik vieną embrioninį kiaušinį. Norėdami tai padaryti, kaip vektorių siūloma naudoti virusines daleles. Virusinės dalelės gali prasiskverbti į didelę suaugusio žmogaus ląstelių dalį, jas įterpdamos paveldima informacija; galimas kontroliuojamas viruso dalelių dauginimasis organizme. Tuo pačiu metu, siekdami sumažinti šalutinį poveikį, mokslininkai stengiasi išvengti genetiškai modifikuotos DNR patekimo į lytinių organų ląsteles, taip išvengiant poveikio būsimiems paciento palikuonims. Taip pat verta atkreipti dėmesį į reikšmingą šios technologijos kritiką žiniasklaidoje: genetiškai modifikuotų virusų vystymąsi daugelis suvokia kaip grėsmę visai žmonijai.

Genų terapijos pagalba ateityje įmanoma pakeisti žmogaus genomą. Šiuo metu veiksmingi žmogaus genomo modifikavimo metodai yra kuriami ir bandomi su primatais. Ilgą laiką beždžionių genų inžinerija susidūrė su rimtais sunkumais, tačiau 2009 metais eksperimentus vainikavo sėkmė: žurnale „Nature“ pasirodė publikacija apie sėkminga paraiška genetiškai modifikuoti virusiniai vektoriai, skirti suaugusiam beždžionės patinui išgydyti nuo daltonizmo. Tais pačiais metais pirmasis genetiškai modifikuotas primatas (išaugintas iš modifikuoto kiaušinio) susilaukė palikuonių – paprastosios marmozetės.

Nors ir nedideliu mastu, genų inžinerija jau naudojama tam, kad kai kurių nevaisingumo rūšių turinčioms moterims būtų suteikta galimybė pastoti. Šiuo tikslu naudojami sveikos moters kiaušiniai. Dėl to vaikas paveldi genotipą iš vieno tėvo ir dviejų motinų.

Tačiau galimybė atlikti reikšmingesnius žmogaus genomo pokyčius susiduria su daug rimtų etinių problemų.

_____________________________________________________________________________________________

Genų inžinerija (genų inžinerija)

Tai metodų, metodų ir technologijų rinkinys, skirtas rekombinantinei RNR ir DNR gauti, genų išskyrimui iš organizmo (ląstelių), manipuliavimui genais ir jų įvedimui į kitus organizmus.

Genų inžinerija nėra mokslas plačiąja prasme, o įrankis biotechnologijos naudojant biologijos mokslų metodus, tokius kaip molekuliniai ir ląstelių biologija, citologija, genetika, mikrobiologija, virusologija.

Šiuo metu Escherichia coli (E. coli) tapo tokių svarbių hormonų, kaip insulinas ir somatotropinas, tiekėja. Anksčiau insulinas buvo gaunamas iš gyvūnų kasos ląstelių, todėl jo kaina buvo labai didelė. Norint gauti 100 g kristalinio insulino, reikia 800-1000 kg kasos, o viena karvės liauka sveria 200-250 gramų. Dėl to insulinas buvo brangus ir sunkiai prieinamas daugeliui diabetu sergančių žmonių. 1978 m. mokslininkai iš Genentech buvo pirmieji, kurie pagamino insuliną specialiai sukurtoje Escherichia coli padermėje. Insulinas susideda iš dviejų polipeptidinių grandinių A ir B, kurių ilgis yra 20 ir 30 aminorūgščių. Kai juos sujungia disulfidiniai ryšiai, susidaro natūralus dvigubos grandinės insulinas. Įrodyta, kad jame nėra E. coli baltymų, endotoksinų ir kitų priemaišų, nesukelia šalutinio poveikio, kaip gyvulinis insulinas, ir nesiskiria nuo jo biologiniu aktyvumu. Vėliau E. coli ląstelėse buvo susintetintas proinsulinas, kurio DNR kopija buvo susintetinta ant RNR šablono, naudojant atvirkštinę transkriptazę. Išvalius gautą proinsuliną, jis buvo padalintas į natūralų insuliną, o hormono ekstrahavimo ir išskyrimo etapai buvo sumažinti. Iš 1000 litrų kultūrinio skysčio galima gauti iki 200 gramų hormono, o tai prilygsta insulino kiekiui, išsiskiriančiam iš 1600 kg kiaulės ar karvės kasos.

Somatotropinas yra žmogaus augimo hormonas, kurį išskiria hipofizė. Šio hormono trūkumas sukelia hipofizės nykštukumą. Jei somatotropinas skiriamas po 10 mg/kg kūno svorio tris kartus per savaitę, tai per metus jo trūkumo kenčiantis vaikas gali augti 6 cm. Anksčiau jis buvo gautas iš lavoninės medžiagos, iš vieno lavono: 4-6 mg somatotropino galutiniame farmaciniame produkte. Taigi turimi hormono kiekiai buvo riboti, be to, šiuo metodu gautas hormonas buvo nevienalytis ir galėjo turėti lėtai augančių virusų. 1980 m. įmonė „Genentec“ sukūrė somatotropino gamybos technologiją naudojant bakterijas, kuriai nebuvo šių trūkumų. 1982 m. žmogaus augimo hormonas buvo gautas iš E. coli ir gyvūnų ląstelių kultūros Pasteur institute Prancūzijoje, o nuo 1984 m. pramoninės gamybos insulino SSRS. Interferono gamyboje naudojama ir E. coli, S. cerevisae (mielės), ir fibroblastų ar transformuotų leukocitų kultūra. Panašiais metodais gaunamos ir saugios bei pigios vakcinos.

Rekombinantinės DNR technologija paremta labai specifinių DNR zondų gamyba, kurie naudojami tiriant genų raišką audiniuose, genų lokalizaciją chromosomose, identifikuoti genus su susijusiomis funkcijomis (pavyzdžiui, žmonėms ir vištoms). DNR zondai taip pat naudojami diagnostikoje įvairios ligos.
Rekombinantinės DNR technologija suteikė galimybę taikyti netradicinį baltymų ir genų metodą, vadinamą atvirkštine genetika. Taikant šį metodą, baltymas išskiriamas iš ląstelės, šio baltymo genas klonuojamas ir modifikuojamas, sukuriant mutantinį geną, koduojantį pakitusią baltymo formą. Gautas genas įvedamas į ląstelę. Jei jis ekspresuojamas, jį nešanti ląstelė ir jos palikuonys sintetins pakitusį baltymą. Tokiu būdu galima koreguoti sugedusius genus ir gydyti paveldimas ligas.

Jei hibridinė DNR įvedama į apvaisintą kiaušinėlį, gali atsirasti transgeninių organizmų, kurie ekspresuoja mutantinį geną ir perduoda jį savo palikuonims. Gyvūnų genetinė transformacija leidžia nustatyti atskirų genų ir jų baltymų produktų vaidmenį tiek reguliuojant kitų genų veiklą, tiek įvairiuose patologiniuose procesuose. Genų inžinerijos pagalba sukurtos virusinėms ligoms atsparių gyvūnų linijos, taip pat gyvūnų veislės, turinčios žmogui naudingų savybių. Pavyzdžiui, rekombinantinės DNR, turinčios galvijų somatotropino geną, mikroinjekcija į triušio zigotą leido gauti transgeninį gyvūną, turintį šio hormono hiperprodukciją. Gauti gyvūnai turėjo ryškią akromegaliją.
Dabar net sunku nuspėti visas galimybes, kurios bus realizuotos per artimiausius kelis dešimtmečius.

Genų inžinerija yra biotechnologijų sritis, apimanti genotipų pertvarkymo veiksmus. Jau šiandien genų inžinerija leidžia įjungti ir išjungti atskirus genus, taip kontroliuojant organizmų veiklą, o taip pat perkelti genetines instrukcijas iš vieno organizmo į kitą, įskaitant ir skirtingų rūšių organizmus. Kadangi genetikai vis daugiau sužino apie genų ir baltymų darbą, galimybę savavališkai užprogramuoti genotipą (pirmiausia žmogaus), lengvai pasiekiant bet kokių rezultatų: pavyzdžiui, atsparumą radiacijai, gebėjimą gyventi po vandeniu, gebėjimą pažeistų organų atsinaujinimą ir net nemirtingumą.

1. Genų inžinerijos galimybės. 4

2. Genų inžinerijos istorija. 6

3. Genų inžinerija kaip mokslas. Genų inžinerijos metodai. 10

4. Genų inžinerijos taikymo sritys. 12

5. Moksliniai faktai apie genų inžinerijos pavojų. 18

Išvada. 22

Literatūra.. 23

Įvadas

Pastaruoju metu genų inžinerijos tema tampa vis populiaresnė. Daugiausia dėmesio skiriama neigiamoms pasekmėms, kurias gali sukelti šios mokslo šakos plėtra, ir labai mažai dėmesio skiriama genų inžinerijos teikiamai naudai.

Perspektyviausia taikymo sritis yra vaistų gamyba naudojant genų inžinerijos technologijas. Pastaruoju metu tapo įmanoma gauti naudingų vakcinų, pagamintų iš transgeninių augalų. Ne mažiau domina gamyba maisto produktai naudojant tas pačias technologijas.

Genų inžinerija yra ateities mokslas. Šiuo metu visame pasaulyje milijonai hektarų žemės yra užsėti transgeniniais augalais, kuriami unikalūs medicininiai preparatai, nauji naudingų medžiagų gamintojai. Laikui bėgant genų inžinerija lems naują medicinos pažangą, žemės ūkis, maisto pramonė ir gyvulininkystė.

Šio darbo tikslas – ištirti genų inžinerijos galimybės ypatumus, raidos istoriją ir taikymo sritis.

1. Genų inžinerijos galimybės

Svarbi biotechnologijų dalis yra genų inžinerija. Gimusi 70-ųjų pradžioje, šiandien ji sulaukė didžiulės sėkmės. Genų inžinerijos metodai paverčia bakterijų, mielių ir žinduolių ląsteles į „fabrikus“, skirtus didelio masto bet kokių baltymų gamybai. Tai leidžia detaliai išanalizuoti baltymų struktūrą ir funkcijas bei naudoti juos kaip vaistus. Šiuo metu Escherichia coli (E. coli) tapo tokių svarbių hormonų, kaip insulinas ir somatotropinas, tiekėja. Anksčiau insulinas buvo gaunamas iš gyvūnų kasos ląstelių, todėl jo kaina buvo labai didelė. Norint gauti 100 g kristalinio insulino, reikia 800-1000 kg kasos, o viena karvės liauka sveria 200-250 gramų. Dėl to insulinas buvo brangus ir sunkiai prieinamas daugeliui diabetu sergančių žmonių. 1978 m. Genentech mokslininkai pirmą kartą pagamino insuliną specialiai sukurtoje Escherichia coli padermėje. Insulinas susideda iš dviejų polipeptidinių grandinių A ir B, kurių ilgis yra 20 ir 30 aminorūgščių. Kai juos sujungia disulfidiniai ryšiai, susidaro natūralus dvigubos grandinės insulinas. Įrodyta, kad jame nėra E. coli baltymų, endotoksinų ir kitų priemaišų, nesukelia šalutinio poveikio, kaip gyvulinis insulinas, ir neturi biologinio aktyvumo.

skirtinga. Vėliau E. coli ląstelėse buvo susintetintas proinsulinas, kurio DNR kopija buvo susintetinta ant RNR šablono, naudojant atvirkštinę transkriptazę. Išvalius gautą proinsuliną, jis buvo padalintas į natūralų insuliną, o hormono ekstrahavimo ir išskyrimo etapai buvo sumažinti. Iš 1000 litrų kultūrinio skysčio galima gauti iki 200 gramų hormono, o tai prilygsta insulino kiekiui, išsiskiriančiam iš 1600 kg kiaulės ar karvės kasos.

Somatotropinas yra žmogaus augimo hormonas, kurį išskiria hipofizė. Šio hormono trūkumas sukelia hipofizės nykštukumą. Jei somatotropinas skiriamas po 10 mg/kg kūno svorio tris kartus per savaitę, tai per metus jo trūkumo kenčiantis vaikas gali augti 6 cm. Anksčiau jis buvo gautas iš lavoninės medžiagos, iš vieno lavono: 4-6 mg somatotropino galutiniame farmaciniame produkte. Taigi turimi hormono kiekiai buvo riboti, be to, šiuo metodu gautas hormonas buvo nevienalytis ir galėjo turėti lėtai augančių virusų. 1980 m. Genentec kompanija sukūrė somatotropino gamybos naudojant bakterijas technologiją, kuri neturėjo šių trūkumų. 1982 metais Pasteur institute Prancūzijoje žmogaus augimo hormonas buvo gautas E. coli ir gyvūnų ląstelių kultūroje, o 1984 metais SSRS pradėta pramoninė insulino gamyba. Interferono gamyboje naudojama ir E. coli, S. cerevisae (mielės), ir fibroblastų ar transformuotų leukocitų kultūra. Panašiais metodais gaunamos ir saugios bei pigios vakcinos.

Rekombinantinės DNR technologija suteikė galimybę taikyti netradicinį baltymų ir genų metodą, vadinamą atvirkštine genetika. Taikant šį metodą, baltymas išskiriamas iš ląstelės, šio baltymo genas klonuojamas ir modifikuojamas, sukuriant mutantinį geną, koduojantį pakitusią baltymo formą. Gautas genas įvedamas į ląstelę. Jei jis ekspresuojamas, jį nešanti ląstelė ir jos palikuonys sintetins pakitusį baltymą. Tokiu būdu galima koreguoti sugedusius genus ir gydyti paveldimas ligas.

Genų materialinio pagrindo nešėjai yra chromosomos, kurios apima DNR ir baltymus. Tačiau formavimosi genai yra ne cheminiai, o funkciniai. Funkciniu požiūriu DNR susideda iš daugybės blokų, kuriuose saugomas tam tikras informacijos kiekis – genai. Geno veikimas pagrįstas jo gebėjimu nustatyti baltymų sintezę per RNR. DNR molekulėje yra tarsi informacija, kuri lemia baltymų molekulių cheminę struktūrą. Genas – svetainė DNR molekulės kuriame yra informacija apie bet kurio vieno baltymo pirminę struktūrą (vienas genas – vienas baltymas). Kadangi organizmuose yra dešimtys tūkstančių baltymų, yra dešimtys tūkstančių genų. Visų ląstelės genų visuma sudaro jos genomą. Visose kūno ląstelėse yra tas pats genų rinkinys, tačiau kiekvienas iš jų įgyvendina skirtinga dalis saugomą informaciją. Todėl, pavyzdžiui, nervų ląstelės yra struktūriškai funkcinės ir biologinės savybės skiriasi nuo kepenų ląstelių.

Dabar net sunku nuspėti visas galimybes, kurios bus įgyvendintos per artimiausius kelis dešimtmečius.

2. Genų inžinerijos istorija

Aukštųjų biomedicinos technologijų, genetinių tyrimų metodų, o taip pat ir pačios genų inžinerijos istorija tiesiogiai susijusi su amžinu žmogaus noru tobulinti žmonių auginamas naminių gyvulių ir kultūrinių augalų veisles. Atrinkdamas tam tikrus individus iš gyvūnų ir augalų grupių ir kryžmindamas juos tarpusavyje, žmogus, neturėdamas teisingo supratimo apie vidinė esmė gyvų būtybių viduje vykstančių procesų, tačiau daugelį šimtų ir tūkstantmečių jis kūrė patobulintas gyvūnų ir augalų veisles, kurios turėjo tam tikrų žmonėms naudingų ir reikalingų savybių.

XVIII–XIX amžiuje buvo daug bandoma išsiaiškinti, kaip bruožai perduodami iš kartos į kartą. Vieną svarbų atradimą 1760 m. padarė botanikas Koelreutheris, sukryžminęs dviejų rūšių tabaką, pernešdamas žiedadulkes iš vienos rūšies kuokelių į kitos rūšies piesteles. Augalai, gauti iš hibridinių sėklų, turėjo tarpinių savybių tarp abiejų tėvų savybių. Koelreuteris iš to padarė logišką išvadą, kad tėvų savybės perduodamos ir per žiedadulkes (sėklų ląsteles), ir per kiaušialąstes (ovules). Tačiau nei jam, nei jo amžininkams, kurie dalyvavo augalų ir gyvūnų hibridizacijoje, nepavyko atskleisti paveldimumo perdavimo mechanizmo prigimties. Tai iš dalies paaiškinama tuo, kad tuo metu dar nebuvo žinomas šio mechanizmo citologinis pagrindas, o daugiausia tuo, kad mokslininkai bandė tirti visų augalų savybių paveldėjimą vienu metu.

Mokslinį požiūrį į tam tikrų bruožų ir savybių paveldėjimo tyrimą sukūrė austrų katalikų vienuolis Gregoras Mendelis, kuris 1865 m. vasarą savo vienuolyno teritorijoje pradėjo augalų hibridizacijos eksperimentus (kryžminant skirtingų veislių žirnius). Jis pirmasis atrado pagrindinius genetikos dėsnius. Gregoras Mendelis pasiekė sėkmės, nes tyrinėjo individualių, aiškiai išsiskiriančių (kontrastingų) bruožų paveldėjimą, skaičiavo kiekvieno tipo palikuonių skaičių ir kruopščiai saugojo išsamius visų savo kryžminimo eksperimentų įrašus. Matematikos pagrindų išmanymas leido teisingai interpretuoti gautus duomenis ir iškelti prielaidą, kad kiekvieną požymį lemia du paveldimi veiksniai. Talentingas vienuolis-tyrėjas vėliau sugebėjo aiškiai parodyti, kad paveldimos savybės nėra maišomos, o perduodamos palikuonims tam tikrų vienetų pavidalu. Ši nuostabi išvada vėliau buvo visiškai patvirtinta, kai buvo galima pamatyti chromosomas ir sužinoti įvairių rūšių ypatybes. ląstelių dalijimasis: mitozė (somatinės ląstelės – kūno ląstelės), mejozė (reprodukcinė, reprodukcinė, gemalinė) ir apvaisinimas.

Mendelis pranešė apie savo darbo rezultatus Bruno gamtininkų draugijos susirinkime ir paskelbė juos šios draugijos veikloje. Jo rezultatų reikšmės nesuprato amžininkai, o šie tyrimai beveik 35 metus nepatraukė augalų selekcininkų ir gamtininkų dėmesio.

1900 m., kai tapo žinoma informacija apie ląstelių dalijimąsi pagal mitozės, mejozės ir paties apvaisinimo tipą, trys tyrinėtojai - de Vriesas Olandijoje, Corrensas Vokietijoje ir Chermakas Austrijoje - atliko daugybę eksperimentų ir savarankiškai atrado paveldimumo dėsnius. antrą kartą, anksčiau aprašytą Mendelio. Vėliau, atradę Mendelio straipsnį, kuriame šie dėsniai buvo aiškiai suformuluoti prieš 35 metus, šie mokslininkai vienbalsiai pagerbė vienuolį mokslininką, jo vardu pavadindami du pagrindinius paveldimumo dėsnius.

Pirmajame XX amžiaus dešimtmetyje buvo atlikti eksperimentai su įvairiausiais augalais ir gyvūnais, atlikta daugybė stebėjimų, susijusių su žmonių charakterio paveldėjimu, kurie aiškiai parodė, kad visuose šiuose organizmuose paveldimumas paklūsta tiems patiems pagrindiniams dėsniams. Nustatyta, kad Mendelio aprašyti veiksniai, lemiantys atskiras ženklas, yra ląstelės branduolio chromosomose. Vėliau, 1909 m., danų botanikas Johansenas šiuos vienetus pavadino genais (iš graikų kalbos žodžio „ge-nos“ - gentis, kilmė), o amerikiečių mokslininkas Williamas Suttonas pastebėjo stebėtiną chromosomų elgesio panašumą formuojantis. gametos (lytinės ląstelės), jų apvaisinimas ir Mendelio paveldimumo faktorių – genų perdavimas. Remiantis šiais genialūs atradimai ir buvo sukurta vadinamoji chromosomų paveldimumo teorija.

Tiesą sakant, pati genetika, kaip mokslas apie gyvų organizmų paveldimumą ir kintamumą bei jų valdymo būdus, atsirado XX amžiaus pradžioje. Amerikiečių genetikas T. Morganas kartu su bendradarbiais atliko daugybę eksperimentų, kurie leido atskleisti genetinį lyties nustatymo pagrindą ir paaiškinti daugybę neįprastų paveldėjimo formų, kuriose bruožo perdavimas priklauso nuo individo lyties. (vadinamieji su lytimi susiję bruožai). Kitas svarbus žingsnis į priekį žengtas 1927 m., kai G. Mölleris nustatė, kad apšvitinus vaisinę muselę Drosophila ir kitus organizmus rentgeno spinduliai, galite dirbtinai sukelti juose genų pokyčius, tai yra mutacijas. Tai leido gauti daug naujų mutantinių genų – papildomos medžiagos paveldimumui tirti. Duomenys apie mutacijų pobūdį buvo vienas iš raktų į supratimą ir pačių genų struktūrą.

Mūsų amžiaus 20-aisiais sovietų mokslininkai iš A.S. Serebrovskis atliko pirmuosius eksperimentus, kurie parodė, koks sudėtingas yra genas. Šias idėjas panaudojo J. Watsonas ir F. Crickas, kuriems 1953 metais Anglijoje pavyko sukurti DNR modelį ir iššifruoti genetinį kodą. Vėliau išplėstas tiriamasis darbas, susijęs su tikslinga naujų derinių kūrimu genetinė medžiaga, ir paskatino pačios genų inžinerijos atsiradimą.

Tuo pačiu metu, 40-aisiais, buvo pradėtas eksperimentinis genų ir fermentų santykių tyrimas. Tam buvo plačiai naudojamas kitas objektas – pelėsis Neurospora, iš kurio buvo galima dirbtinai gauti ir ištirti nemažai biocheminių mutacijų, susijusių su vieno ar kito specialaus fermento (baltymo) praradimu. Per du paskutiniais dešimtmečiais dažniausiai pasitaikantys objektai genetiniai tyrimai buvo Escherichia coli ir kai kurie bakteriofagai, kurie užkrečia šią bakteriją.

Nuo pat XX amžiaus pradžios buvo nuolat domimasi tam tikrų (specifinių) savybių paveldėjimo žmonėms tyrimais ir pageidaujamų bei nepageidaujamų savybių perdavimu naminiams gyvūnams ir kultūriniams augalams. Remdamiesi vis gausėjančiomis žiniomis apie genetinius modelius, genetikos mokslininkai ir veisėjai išmoko beveik pagal užsakymą veisti gyvulių veisles, kurios gali išgyventi karštame klimate, karves, kurios duoda daug riebaus pieno, viščiukus, kurie deda didelius. kiaušinių plonais lukštais ir kukurūzų bei kviečių veislių, kurios yra labai atsparios tam tikroms ligoms.

1972 metais JAV P. Bergo laboratorijoje buvo gauta pirmoji hibridinė (rekombinantinė) DNR. Įdomios idėjos žmogaus genetikos ir genetinių tyrimų metodų srityje pradėtos plačiai plėtoti ir taikyti pačioje medicinoje. 70-aisiais prasidėjo žmogaus genomo dekodavimas. Jau daugiau nei dešimtmečius buvo vykdomas projektas, vadinamas Žmogaus genomu. Iš 3 milijardų nukleotidų porų, išdėstytų nenutrūkstamais ištraukimais, iki šiol buvo perskaityta tik apie 10 milijonų simbolių. Tuo pačiu metu kuriami nauji genetiniai metodai, kurie padidina DNR skaitymo greitį. Medicininės genetikos centro direktorius Rusijos akademija medicinos mokslai V.I. Ivanovas tikrai tiki, kad „visas genomas bus perskaitytas apie 2020 m.“.

3. Genų inžinerija kaip mokslas. Genų inžinerijos metodai

Genų inžinerija – tai funkciškai aktyvių genetinių struktūrų (rekombinantinės DNR) konstravimas in vitro arba, kitaip tariant, dirbtinių genetinių programų kūrimas (Baev A.A.). Pasak E.S. Piruzyan genų inžinerija - eksperimentinių metodų sistema, leidžianti laboratorijoje (in vitro) sukurti dirbtinius. genetinės struktūros vadinamųjų rekombinantinių arba hibridinių DNR molekulių pavidalu.

Mes kalbame apie nukreiptą, pagal iš anksto nustatytą programą, molekulinių genetinių sistemų kūrimą už kūno ribų ir vėlesnį jų įvedimą į gyvą organizmą. Šiuo atveju rekombinantinė DNR tampa neatsiejama recipiento organizmo genetinio aparato dalimi ir suteikia jam naujų unikalių genetinių, biocheminių, o vėliau ir fiziologinių savybių.

Taikomosios genų inžinerijos tikslas – suprojektuoti tokias rekombinantines DNR molekules, kurios, patekusios į genetinį aparatą, suteiktų organizmui žmogui naudingų savybių.

Rekombinantinėje DNR technologijoje naudojami šie metodai:

Specifinis DNR skilimas restrikcijos nukleazėmis, pagreitinant atskirų genų išskyrimą ir manipuliavimą;

Greitas visų nukleotidų sekos nustatymas išgrynintame DNR fragmente, leidžiantis nustatyti geno ribas ir jo koduojamą aminorūgščių seką;

Rekombinantinės DNR konstravimas;

Hibridizacija nukleino rūgštys, leidžianti tiksliau ir jautriau aptikti specifines RNR arba DNR sekas, remiantis jų gebėjimu surišti komplementarias nukleorūgščių sekas;

DNR klonavimas: amplifikacija in vitro naudojant polimerazės grandininę reakciją arba DNR fragmento įvedimą į bakterijos ląstelę, kuri po tokios transformacijos atkuria šį fragmentą milijonais kopijų;

Rekombinantinės DNR įvedimas į ląsteles ar organizmus.

4. Genų inžinerijos taikymo sritys

Šiuo metu žmogaus genetikos srityje daromi moksliniai atradimai iš tikrųjų turi revoliucinę reikšmę, nes kalbame apie galimybę sukurti „žmogaus genomo žemėlapį“ arba „patologinę žmogaus genomo anatomiją“. Šis genetinis žemėlapis leis nustatyti ilgosios DNR spiralės genų, atsakingų už tam tikras paveldimas ligas, vietą. Pasak genetikos mokslininkų, šios neribotos galimybės sudarė pagrindą idėjai klinikinėje praktikoje taikyti vadinamąją genų terapiją, kuri yra pacientų gydymo kryptis, apimanti pažeistų genų pakeitimą naudojant aukštąsias biomedicinos technologijas ir genų inžineriją. Įsiveržti į žmogaus genų sistemų sudėtį ir užtikrinti jų gyvybinę veiklą galima tiek somatinių (visų kūno ląstelių su tam tikrais struktūriniais ir funkciniais skirtumais) kūno ląstelių lygmeniu, tiek reprodukcinių, reprodukcinių (gemalų) ir gemalų lygiu. (embrioninės) ląstelės.

Genų inžinerija kaip terapijos rūšis – tam tikros genetiškai nulemtos ligos gydymas – siejama su atitinkamos nedefektinės DNR molekulės tiekimu, siekiant ją pakeisti genu – chromosomos dalimi, kurioje yra defektas, arba integracijai į žmogaus genetinę medžiagą susiliejant su vadinamąja somatinės ląstelėsžmogaus kūnas su genetiniu defektu. Genų inžinerijos uždavinys, susijęs su asmeniu, yra suteikti atitinkamą tikslinį poveikį konkrečiam genui, kad jis tinkamai funkcionuotų, ir suteikti žmogui, sergančiam paveldima liga, normalia, nepakitusia geno versija. Priešingai nei vaistų terapija, ši terapija, vadinama genų inžinerija, gali suteikti pacientui ilgalaikį, ilgalaikį, labai veiksmingą gydymą, kuris atneša daug palengvėjimo ir naudos.

Tačiau viskas šiuolaikiniai metodai DNR įvedimas į gyvus organizmus nesugeba nukreipti ir pristatyti jos į konkrečią ląstelių populiaciją, kurioje yra pakitęs ir todėl netinkamai veikiantis genas. Kitaip tariant, vadinamasis nukreiptas perkėlimas, genų pernešimas organizme („in vivo“ modelyje) šiuo metu yra neįmanomas.

Kitas metodologinis požiūris, pagrįstas tam tikros ląstelių populiacijos, turinčios paveiktą geną, išskyrimu iš paciento kūno ir genetinės medžiagos manipuliavimu pakeičiant pažeistus genus ląstelėse naudojant genų inžineriją („in vitro“ modelyje) ir grąžinant juos į tą. vieta organizme, kur jie buvo paimti iš paciento, šiuo metu įmanoma medicinos genetiniuose centruose. Šis genų terapijos metodas taikant genų inžineriją jau buvo naudojamas eksperimentiniam bandymui išgydyti du pacientus, sergančius reta genetine liga, vadinama beta talasemija, kurią, kaip ir pjautuvinių ląstelių anemiją, taip pat sukelia netinkamai suformuota ir todėl netinkamai funkcionuojanti liga. baltymai raudonuosiuose kraujo kūneliuose. Manipuliacijos esmė buvo ta, kad iš šių pacientų kaulų čiulpų buvo išskirtos vadinamosios kamieninės ląstelės, į kurių chromosomas buvo įvestas DNR skyrius, atsakingas už normalaus hemoglobulino baltymo gamybą – genas. Beveik visiškai sunaikinus pacientų kaulų čiulpuose likusias blogai funkcionuojančias kamienines ląsteles, pacientams buvo suleistos genetiškai modifikuotos kamieninės ląstelės. Deja, šie du bandymai buvo kliniškai nesėkmingi, nes pacientai mirė. Šis pirmasis genų inžinerijos atvejis ligoninės aplinkoje nebuvo patvirtintas arba patvirtintas atitinkamų peržiūros komitetų, o jo dalyviai buvo griežtai pasmerkti už šiurkščius žmogaus genetikos tyrimų taisyklių pažeidimus.

Reprodukcinių (reprodukcinių) ląstelių genų inžinerija gali sukelti visiškai kitokias pasekmes, nes DNR įvedimas į šias ląsteles skiriasi nuo somatinių (kūno, nereprodukcinių) ląstelių genetinio defekto ištaisymo. Yra žinoma, kad kitų genų įvedimas į lytinių ląstelių chromosomas lemia jų perdavimą kitoms kartoms. Iš principo galima įsivaizduoti, kad tam tikro žmogaus, kuris yra paveiktas vienokiomis ar kitokiomis genetiškai nulemtomis ligomis, kiekvienos besidauginančios ląstelės genetinės medžiagos pridedamos tam tikros DNR dalys, kurios pakeis defektines dalis.

Iš tiesų, tai buvo pasiekta su pelėmis. Taigi iš patelės kiaušidės buvo gautas kiaušinėlis, kuris vėliau buvo apvaisintas mėgintuvėlyje (in vitro), o po to į apvaisinto kiaušinėlio chromosomą buvo įvesta svetima DNR dalis. Pats apvaisintas kiaušinėlis su pakitusiu genomu buvo implantuotas (įvestas) į pelės patelės motinos gimdą. Viename eksperimente svetimos DNR šaltinis buvo triušio genetinė medžiaga, o kitame – žmogaus genetinė medžiaga.

Siekiant nustatyti vaisiaus intrauterinio vystymosi laikotarpiu tikimybę susilaukti vaiko su tam tikrais genetiniais sutrikimais, tokiais kaip Dauno sindromas ar Tay-Sachs liga, naudojama tyrimo technika, vadinama amniocenteze – prenatalinė analizė, kurios metu paimamas mėginys. biologinio skysčio, kuriame yra lytinių ląstelių, paimtų iš amniono maišelio antrojo nėštumo trimestro pradžioje. Be to, jūsų tolesnė plėtra gavo įvairių vaisiaus ląstelių išskyrimo iš motinos placentos kraujo mėginio techniką. Tokiu būdu gautomis gimdos ląstelėmis šiuo metu galima nustatyti tik ribotą skaičių genetiškai nulemtų ligų, kuriose yra ryškūs, šiurkštūs DNR struktūros sutrikimai ir biocheminiais tyrimais nustatyti pakitimai. Genų inžinerija naudojant rekombinantinę DNR prenatalinių tyrimų metu atveria galimybę teisingai diagnozuoti įvairias ir daugybę paveldimų ligų.

Šiuo atveju kuriami būdai sukurti vadinamuosius genų „zondus“, kurių pagalba galima nustatyti, ar chromosomoje yra normalus, nepakitęs genas, ar nenormalus, defektinis genas. Be to, genų inžinerija, susijusi su rekombinantinės DNR, kuri yra viena iš jos formavimosi stadijų, naudojimu, ateityje leis atlikti vadinamąjį žmogaus genų „planavimą“, kad tam tikras genas kuri neša iškraipytą, patologinę informaciją ir todėl domina genetikus, galėtų būti laiku ir pakankamai greitai identifikuota pagal analogiją naudojant kitą „pažymėtą“ geną. Šis sudėtingas medicininis ir biologinis metodas turėtų padėti nustatyti bet kurio geno vietą gimdos ląstelėse, o ne tik tas, kuriose, naudojant amniocentezės metodą, gali būti aptikti įvairūs sutrikimai.

Šiuo atžvilgiu pastaraisiais metais atsirado naujų biomedicinos mokslų sferų, tokių kaip, pavyzdžiui, aukštosios DNR technologijos, embriono terapija ir ląstelių terapija (citoterapija), tai yra genetiškai nulemtos ligos intrauterinė diagnostika ir gydymas. ugdymo stadijoje ir embriono (embriono) raidoje, ir vaisiaus brendimo stadijoje. Invazija ir manipuliavimas embrionine medžiaga turi tiesioginės įtakos genetinių pokyčių paveldėjimui, nes jie gali būti perduodami iš kartos į kartą. Be to, pati genetinė diagnozė pradeda vystytis į genetinį prognozavimą, tai yra į būsimo žmogaus likimo nustatymą, įtvirtinant pagrindinius revoliucinius pačios medicinos pokyčius, kurie dėl sudėtingų medicininių-genetinių eksperimentų ir metodų įgijo galimybę. gerokai prieš pasirodant „klinikiniam ligos paveikslui“, kartais net iki žmogaus gimimo, siekiant nustatyti, kokie paveldimi negalavimai jam gresia. Taigi genetikų ir genų inžinerijos srities specialistų pastangomis biomedicinos mokslų gelmėse gimė vadinamoji „prognozuojanti medicina“, tai yra medicina, kuri „prognozuoja ateitį“.

Tuo pačiu metu įvairios genų inžinerijos technologijos ir metodai leidžia nuspėti prenataliniu vaiko raidos periodu, iki jo gimimo, ne tik tam tikros paveldimos ligos buvimą, bet ir išsamiai aprašyti medicininę bei genetinę ligą. augančio embriono ir vaisiaus savybės.

Sukaupus naujų duomenų apie žmogaus genomo genetinį kartografavimą ir jo DNR aprašymą (sekvenavimą), taip pat dėl to, kad kuriami modernūs DNR polimorfizmų tyrimo metodai leidžia pateikti genetinę informaciją apie tam tikras struktūrines ir funkcines ( įskaitant patologinius) žmogaus organizmo ypatumus, kurie, matyt, išryškės ateityje, bet dabar dar nepastebimi, medicininės genetinės diagnostikos pagalba tampa įmanoma gauti visą genetinę informaciją apie vaiką ne tik ikiklinikiniu būdu, tai yra iki tam tikros paveldimos ligos pasireiškimo ir prenataliniu laikotarpiu, tai yra iki jo gimimo, bet ir preceptyviai, tai yra, dar prieš jos pastojimą.

Artimiausiu metu dėl sėkmės ir pažangos medicininės genetinės diagnostikos srityje, remiantis DNR diagnostikos duomenimis, bus galima gana užtikrintai spręsti, pavyzdžiui, koks yra žmogaus ūgis, protiniai gebėjimai, polinkis tam tikriems. ligos (ypač vėžys) bus arba psichikos), pasmerktos bet kokių paveldimų ligų pasireiškimui ir vystymuisi.

Šiuolaikinės medicinos ir biologinės technologijos leidžia aptikti įvairius genų sutrikimus, kurie gali pasireikšti ir sukelti tam tikrus negalavimus ne tik kliniškai ryškios ligos stadijoje, bet ir tada, kai dar nėra patologijos požymių ir pati liga nepasireikš. taip greitai pasireiškia. Pavyzdžiui, Alzheimerio liga ir Hantingtono chorėja, kuria serga vyresni nei 40 ar net 70 metų žmonės. Tačiau net ir šiais atvejais galima aptikti genus, galinčius sukelti panašias žmonių ligas, dar prieš paciento pastojimą. Taip pat žinoma, kad cukrinis diabetas gali būti priskirtas prie šių ligų. Polinkis sirgti šia liga ir pati genetiškai nulemta patologija yra paveldima ir gali pasireikšti nesilaikant tam tikro gyvenimo būdo suaugus ar senatvėje. Galima pagrįstai teigti, kad jei abu tėvai ar vienas iš jų serga cukriniu diabetu, tada tikimybė paveldėti diabeto geną ar tokių genų derinį perduodama vaikams.

Tokiu atveju, esant mikroskopiškai mažiems biologinės medžiagos kiekiams, galima atlikti atitinkamus medicininius ir biologinius tyrimus bei nustatyti teisingą diagnozę. Kartais tam pakanka kelių atskirų ląstelių, kurios bus padaugintos kultūroje in vitro ir iš jų bus gautas tiriamo žmogaus „genetinis portretas“, žinoma, ne visiems jo genomo genams (jų yra dešimtys). iš tūkstančių!), bet tiems iš jų , dėl kurių yra pagrįstas pagrindas įtarti, kad yra tam tikrų trūkumų. Vienu metu plėtojant ląstelių ir genų inžinerijos metodus, vėlesniuose genomo pažinimo etapuose atsiras praktinė galimybė savavališkai, o visų pirma terapiniais tikslais, keisti genų seką ir tvarką, jų sudėtis ir struktūra.

Medicina nėra vienintelė genų inžinerijos taikymo sritis. Yra augalų genų inžinerija ir bakteriologinių ląstelių genų inžinerija.

Pastaruoju metu atsirado naujų galimybių gauti „valgomas“ vakcinas, kurių pagrindą sudaro transgeniniai augalai.

Pasaulyje padaryta didelė pažanga transgeninių augalų srityje. Jie daugiausia susiję su tuo, kad organizmo gavimo iš ląstelės, ląstelių grupės ar nesubrendusio embriono augaluose problema dabar nėra labai sudėtinga. Šiuolaikiniame moksle plačiai naudojamos ląstelių technologijos, audinių kultūra ir regenerantų kūrimas.

Panagrinėkime SB RAS Sibiro augalų fiziologijos ir biochemijos instituto pasiekimus augalininkystės srityje.

Taigi pastaraisiais metais nemažai transgeninių augalų buvo gauta perkeliant į jų genomą genus ugt, acp, acb, accc ir kitus, išskirtus iš įvairių augalinių objektų.

Įvedus šiuos genus, atsirado transgeniniai kviečių, bulvių, pomidorų, agurkų, sojų pupelių, žirnių, rapsų, braškių, drebulių ir kai kurių kitų augalai.

Genų įvedimas buvo atliktas arba „taikiniais“ audiniais iš „genų pistoleto“ (kurio dizainas buvo sukurtas mūsų institute), arba genetiniu vektoriumi, pagrįstu agrobakterine plazmide su įmontuotais tiksliniais genais ir atitinkamais promotoriais. .

Dėl to susidarė nemažai naujų transgeninių formų. Štai keletas iš jų.

Transgeniniai kviečiai (2 veislės), kurių augimas ir dygimas žymiai intensyvesnis, tikėtina, yra atsparesni sausrai ir kitiems nepalankiems aplinkos veiksniams. Tiriamas jo produktyvumas ir įgytų savybių paveldėjimas.

Transgeninės bulvės, kurios buvo stebimos trejus metus. Nuolat duoda 50-90 procentų didesnį derlių nei kontrolinis, įgavo beveik visišką atsparumą auksininiams herbicidams, be to, jo gumbai žymiai mažiau „juoduoja“ pjūviuose dėl sumažėjusio polifenoloksidazės aktyvumo.

Transgeninis pomidoras (kelios veislės), pasižymintis didesniu krūmiškumu ir derlingumu. Šiltnamyje jo derlius siekia iki 46 kg iš kvadratinio metro (daugiau nei du kartus didesnis nei kontrolinis).

Transgeniniai agurkai (kelios veislės) užaugina daugiau derlingų žiedų, taigi ir vaisių, kurių derlius iki 21 kg kvadratinio metro, palyginti su 13,7 kontrolinėje.

Yra ir kitų augalų transgeninių formų, kurių daugelis taip pat turi daug naudingų ekonominių savybių.

Genų inžinerija yra šiandienos ir rytojaus mokslas. Jau dabar pasaulyje dešimtys milijonų hektarų užsėjami transgeniniais augalais, kuriami nauji. vaistai, nauji naudingų medžiagų gamintojai. Laikui bėgant genų inžinerija taps vis galingesne įrankiu naujiems medicinos, veterinarijos, farmakologijos, maisto pramonės ir žemės ūkio pasiekimams.

5. Moksliniai faktai apie genų inžinerijos pavojų

Reikėtų pažymėti, kad kartu su pažanga, kurią atneša genų inžinerijos plėtra, yra ir keletas faktų apie genų inžinerijos pavojus, kurių pagrindiniai pateikiami žemiau.

1. Genų inžinerija iš esmės skiriasi nuo naujų veislių ir veislių kūrimo. Dirbtinis svetimų genų pridėjimas labai sutrikdo tiksliai reguliuojamą normalios ląstelės genetinę kontrolę. Manipuliacija genais iš esmės skiriasi nuo motinos ir tėvo chromosomų derinio, atsirandančio natūraliai kryžminant.

2. Šiuo metu genų inžinerija yra techniškai netobula, nes ji negali kontroliuoti naujo geno įterpimo proceso. Todėl neįmanoma numatyti įterpimo vietos ir pridėto geno poveikio. Net jei geno vietą galima nustatyti jį įterpus į genomą, turima DNR informacija yra labai neišsami, kad būtų galima numatyti rezultatus.

3. Dėl dirbtinio svetimo geno pridėjimo netikėta pavojingų medžiagų. Blogiausiu atveju tai gali būti toksinės medžiagos, alergenai ar kitos sveikatai kenksmingos medžiagos. Informacija apie tokias galimybes vis dar labai neišsami.

4. Visiškai patikimų nekenksmingumo tyrimo metodų nėra. Nepaisant kruopščiai atliktų saugumo tyrimų, daugiau nei 10 % rimtų naujų vaistų šalutinių poveikių aptikti nepavyksta. Rizikos laipsnis, kad pavojingų savybių naujas genetiškai modifikuotas maistas liks nepastebėtas, tikriausiai daug labiau nei narkotikų atveju.

5. Dabartiniai reikalavimai nekenksmingumui nustatyti yra itin nepakankami. Jie aiškiai skirti supaprastinti patvirtinimo procesą. Jie leidžia naudoti itin nejautrus nekenksmingumo tyrimo metodus. Todėl yra didelė rizika, kad pavojingi maisto produktai gali praeiti nepastebėti.

6. Iki šiol naudojant genų inžineriją sukurti maisto produktai neturi jokios reikšmingos vertės žmonijai. Šie produktai daugiausia tenkina tik komercinius interesus.

7. Žinių apie į aplinką patekusių genetiškai modifikuotų organizmų poveikį visiškai nepakanka. Dar neįrodyta, kad genų inžinerijos būdu modifikuoti organizmai neturės žalingas poveikis apie aplinką. Aplinkosaugininkai pasiūlė įvairias galimas aplinkos komplikacijas. Pavyzdžiui, yra daug galimybių nekontroliuojamai plisti potencialiai žalingiems genams, kuriuos naudoja genų inžinerija, įskaitant genų perkėlimą per bakterijas ir virusus. Aplinkos sukeltų komplikacijų greičiausiai bus neįmanoma ištaisyti, nes išleistų genų negalima atsiimti.

8. Naujas ir pavojingų virusų. Eksperimentiškai įrodyta, kad viruso genai, įterpti į genomą, gali jungtis su infekcinių virusų genais (vadinamoji rekombinacija). Šie nauji virusai gali būti agresyvesni nei pirminiai. Virusai taip pat gali tapti mažiau specifiniai rūšims. Pavyzdžiui, augalų virusai gali tapti kenksmingi naudingiems vabzdžiams, gyvūnams ir žmonėms.

9. Žinios apie paveldimą substanciją DNR yra labai neišsamios. Yra žinoma tik trijų procentų DNR funkcija. Rizikinga manipuliuoti sudėtingos sistemos, žinios apie kurias yra neišsamios. Didelė patirtis biologijos, ekologijos ir medicinos srityse rodo, kad tai gali sukelti rimtų nenuspėjamų problemų ir sutrikimų.

10. Genų inžinerija nepadės išspręsti pasaulinio bado problemos. Teiginys, kad genų inžinerija gali svariai prisidėti sprendžiant pasaulio bado problemą, yra moksliškai nepagrįstas mitas.

Išvada

Genų inžinerija yra biotechnologijos metodas, susijęs su genotipų restruktūrizavimo tyrimais. Genotipas yra ne tik mechaninė genų suma, bet ir sudėtinga sistema, susidariusi organizmų evoliucijos metu. Genų inžinerija leidžia perkelti genetinę informaciją iš vieno organizmo į kitą atliekant in vitro operacijas. Genų perkėlimas leidžia įveikti tarprūšinius barjerus ir perkelti individualias vieno organizmo paveldimas savybes kitam.

Genotipų pertvarkymas, atliekant genų inžinerijos užduotis, reiškia kokybinius genų pokyčius, nesusijusius su mikroskopu matomais chromosomų struktūros pokyčiais. Genų pokyčiai pirmiausia yra susiję su transformacija cheminė struktūra DNR. Informacija apie baltymo struktūrą, parašyta kaip nukleotidų seka, yra įgyvendinama kaip aminorūgščių seka susintetinto baltymo molekulėje. Nukleotidų sekos pasikeitimas chromosomų DNR, kai kurių nukleotidų praradimas ir kitų nukleotidų įtraukimas keičia DNR susidariusių RNR molekulių sudėtį, o tai savo ruožtu lemia naują aminorūgščių seką sintezės metu. Dėl to ląstelėje pradeda sintetinti naujas baltymas, dėl kurio organizme atsiranda naujų savybių. Genų inžinerijos metodų esmė yra ta, kad atskiri genai ar genų grupės yra įterpiami į organizmo genotipą arba pašalinami iš jo. Į genotipą įterpus anksčiau nebuvusį geną, ląstelė gali būti priversta sintetinti baltymus, kurių anksčiau nebuvo sintezuota.

Nuorodos

2. Lee A., Tinland B. t-DNR integracija į augalo genomą: prototipas ir tikrovė // Augalų fiziologija. 2000. - 47 tomas. - Nr.3.

3. Lutova L. A., Provorov N. A., Tikhodeev O. N. ir kt. Augalų vystymosi genetika. - Sankt Peterburgas: Nauka, 2000. - 539 p.

4. Lyadskaya M. Genų inžinerija gali padaryti viską – net užauginti vakciną sode // Farmacijos biuletenis. - 2000. - Nr.7.

5. Romanovas G. A. Augalų genų inžinerija ir biosaugos problemos sprendimo būdai // Augalų fiziologija, 2000. - 47 tomas. - Nr. 3.

6. Saljajevas R. Genų inžinerijos mitai ir realijos // Mokslas Sibire. - 2002. - Nr.7.

7. Favorova O. O. Gydymas genais – fikcija ar realybė? // Farmacijos biuletenis. - 2002. - Nr.5.

Kuzmina N.A. Biotechnologijos pagrindai: vadovėlis. - Omskas: OGPU, 2001. - 256 p.

Lutova L. A., Provorov N. A., Tikhodeev O. N. ir kt., Augalų vystymosi genetika. - Sankt Peterburgas: Nauka, 2000. - 539 p.

Lyadskaya M. Genų inžinerija gali padaryti viską – net užauginti vakciną sode // Farmacijos biuletenis. - 2000. - Nr.7.

Kuzmina N.A. Biotechnologijos pagrindai: vadovėlis. - Omskas: OGPU, 2001. - 256 p.

Favorova O. O. Gydymas genais – fikcija ar realybė? // Farmacijos biuletenis. - 2002. - Nr.5.

Salyaev R. Genų inžinerijos mitai ir realijos // Mokslas Sibire. - 2002. - Nr.7.

Kuzmina N.A. Biotechnologijos pagrindai: vadovėlis. - Omskas: OGPU, 2001. - 256 p.

Savo gerą darbą pateikti žinių bazei lengva. Naudokite žemiau esančią formą

Studentai, magistrantai, jaunieji mokslininkai, kurie naudojasi žinių baze savo studijose ir darbe, bus jums labai dėkingi.

Paskelbta http://www.allbest.ru/

genų inžinerija, biochemijos metodų rinkinys ir molekulinė genetika, kurio pagalba sujungiama kryptinė genetinė informacija bet kokie organizmai.

Genų inžinerija leidžia įveikti natūralias tarprūšines kliūtis, trukdančias keistis genetine informacija tarp taksonomiškai nutolusių organizmų rūšių, sukurti ląsteles ir organizmus, turinčius gamtoje neegzistuojančių genų derinius su nurodytomis paveldimomis savybėmis. Pagrindinis genų inžinerijos įtakos objektas yra genetinės informacijos nešėja – dezoksiribonukleino rūgštis (DNR), kurios molekulė dažniausiai susideda iš dviejų grandinių. Griežtas purino ir pirimidino bazių poravimo specifiškumas lemia komplementarumo savybę – abipusį nukleotidų atitikimą dviejose grandinėse. Sukurti naujas genų kombinacijas pasirodė įmanomas dėl esminio DNR molekulių struktūros panašumo visų tipų organizmuose, o iš tikrųjų genetinio kodo universalumas užtikrina svetimų genų raišką (jų funkcinių savybių pasireiškimą). aktyvumas) bet kokio tipo ląstelėje. Tai taip pat palengvino žinių kaupimas nukleorūgščių chemijos srityje, genų organizavimo ir veikimo molekulinių ypatybių identifikavimas (įskaitant jų ekspresijos reguliavimo mechanizmų sukūrimą ir galimybę pajungti genus „subordinuoti“) svetimi“ reguliavimo elementai), DNR sekos nustatymo metodų kūrimas ir polimerazės grandininės reakcijos atradimas, leidžiantis greitai susintetinti bet kurį DNR fragmentą. Svarbios prielaidos genų inžinerijai atsirasti buvo: plazmidžių, galinčių autonomiškai replikuotis ir persikelti iš vienos bakterijos ląstelės į kitą, atradimas ir transdukcijos reiškinys – tam tikrų genų perkėlimas bakteriofagais, o tai leido suformuluoti idėją apie vektoriai: molekulės - genų nešėjai. Didžiulį vaidmenį kuriant genų inžinerijos metodiką suvaidino fermentai, dalyvaujantys nukleino rūgščių transformacijoje: restrikcijos fermentai (atpažįsta DNR molekulėse griežtai apibrėžtas sekas – vietas ir šiose vietose „perkerta“ dvigubą grandinę), DNR ligazės (kovalentiškai jungiasi). atskiri DNR fragmentai), atvirkštinė transkriptazė (sintezuoja papildomą DNR kopiją arba cDNR RNR šablone) ir kt. Tik esant jų prieinamumui, dirbtinių struktūrų kūrimas tapo techniškai įmanoma užduotimi. Fermentai naudojami atskiriems DNR fragmentams (genams) gauti ir sukurti molekulinius hibridus – rekombinantinę DNR (recDNR) plazmidžių ir virusų DNR pagrindu. Pastarieji į ląstelę šeimininką pristato norimą geną, užtikrindami ten jo dauginimąsi (klonavimą) ir galutinio geno produkto susidarymą (jo ekspresiją).

Kūrybos principairekombinantinių DNR molekulių analizė

Terminas „genų inžinerija“ plačiai paplito po to, kai 1972 m. P. Bergas ir jo kolegos pirmą kartą gavo rekombinantinę DNR, kuri buvo hibridas, kuriame buvo Escherichia coli bakterijos DNR fragmentai, jos virusas (bakteriofagas a) ir pamiškės viruso SV40 DNR. buvo sujungti. 1973 m. S. Cohenas ir bendradarbiai panaudojo pSC101 plazmidę ir restrikcijos fermentą (EcoRI), kuris atidaro ją vienoje vietoje, todėl jos galuose susidaro trumpos viena kitą papildančios vienagrandė „uodegėlės“ (dažniausiai 4–6 nukleotidai). dvigrandė DNR molekulė. Jie buvo vadinami „lipniais“, nes galėjo poruotis (tarsi sulipti) vienas su kitu. Tokią DNR sumaišius su svetimos DNR fragmentais, apdorotais tuo pačiu restrikcijos fermentu ir turinčiais tuos pačius lipnius galus, buvo gautos naujos hibridinės plazmidės, kurių kiekvienoje buvo bent vienas svetimos DNR fragmentas, įterptas į plazmidės EcoRI vietą. Tapo akivaizdu, kad į tokias plazmides galima įterpti įvairių svetimų DNR fragmentų, gautų tiek iš mikroorganizmų, tiek iš aukštesniųjų eukariotų.

Pagrindinė šiuolaikinė recDNA gavimo strategija yra tokia:

1) į plazmidės ar viruso, galinčio daugintis nepriklausomai nuo chromosomos, DNR įterpiami DNR fragmentai, priklausantys kitam organizmui, turinčiam tam tikrus tyrėją dominančius genus arba dirbtinai gautas nukleotidų sekas;

2) Gautos hibridinės molekulės įvedamos į jautrias prokariotines ar eukariotas ląsteles, kur jos yra replikuojamos (dauginamos, amplifikuojamos) kartu su jose įtaisytais DNR fragmentais;

3) Ląstelių klonai atrenkami kolonijų pavidalu ant specialių maistinės terpės(arba virusai valymo zonų pavidalu - plokštelės ant nuolatinio bakterijų ląstelių ar gyvūnų audinių kultūrų augimo sluoksnio), kuriose yra reikiamų tipų recDNR molekulių ir atliekami išsamūs struktūriniai ir funkciniai tyrimai.

Siekiant palengvinti ląstelių, kuriose yra recDNR, atranką, naudojami vektoriai, turintys vieną ar daugiau žymenų. Pavyzdžiui, plazmidėse atsparumo antibiotikams genai gali būti tokie žymenys (ląstelės, kuriose yra recDNR, atrenkamos pagal jų gebėjimą augti esant tam tikram antibiotikui). RecDNA, turinti norimus genus, atrenkama ir įvedama į recipiento ląsteles. Nuo šio momento prasideda molekulinis klonavimas - gaunamos DNR upių kopijos, taigi ir tikslinių genų kopijos. Tik jei įmanoma atskirti visas transfekuotas arba užkrėstas ląsteles, kiekvienas klonas bus atstovaujamas atskira ląstelių kolonija ir jame bus tam tikras DNR kiekis. Įjungta paskutinis etapas identifikuojami klonai, turintys norimą geną. Vienas iš jų grindžiamas tuo, kad įterpimas į DNR srautą lemia tam tikrą unikalią ląstelės, kurioje ji yra, savybę (pavyzdžiui, įterpto geno ekspresijos produktą). Molekulinio klonavimo eksperimentuose laikomasi 2 pagrindinių principų: nė viena iš ląstelių, kuriose klonuojamos DNR upės, neturėtų gauti daugiau nei vienos plazmidės molekulės ar viruso dalelės; pastarieji turi gebėti replikuotis.

Įvairios plazmidės ir virusinės DNR yra naudojamos kaip vektorinės molekulės genų inžinerijoje. Populiariausi klonavimo vektoriai turi keletą genetinių žymenų ir turi vieną skirtingų restrikcijos fermentų veikimo vietą. Tokius reikalavimus, pavyzdžiui, geriausiai atitinka plazmidė pBR322, kuri buvo sukonstruota iš iš pradžių natūraliai pasitaikančios plazmidės, naudojant metodus, naudojamus dirbant su recDNR; jame yra atsparumo ampicilinui ir tetraciklinui genai, taip pat viena atpažinimo vieta 19 skirtingų restrikcijos fermentų. Ypatingas klonavimo vektorių atvejis yra ekspresijos vektoriai, kurie kartu su amplifikacija užtikrina teisingą ir efektyvią svetimų genų ekspresiją recipiento ląstelėse. Kai kuriais atvejais molekuliniai vektoriai gali užtikrinti svetimos DNR integraciją į ląstelės ar viruso genomą (jie vadinami integraciniais vektoriais).

Vienas iš svarbiausių genų inžinerijos uždavinių – bakterijų ar mielių padermių, gyvūnų ar augalų audinių ląstelių linijų, taip pat transgeninių augalų ir gyvūnų kūrimas, kurie užtikrintų efektyvią juose klonuotų genų ekspresiją. Aukštas baltymų gamybos lygis pasiekiamas, jei genai klonuojami daugiakopiuose vektoriuose, nes tokiu atveju tikslinis genas ląstelėje bus dideliais kiekiais. Svarbu, kad DNR koduojanti seka būtų kontroliuojama promotoriaus, kurį efektyviai atpažįsta ląstelės RNR polimerazė, ir kad gauta mRNR būtų gana stabili ir efektyviai verčiama. Be to, svetimkūnio baltymas, susintetintas recipiento ląstelėse, neturėtų būti sparčiai skaidomas tarpląstelinių proteazių. Kuriant transgeninius gyvūnus ir augalus, dažnai pasiekiama specifinė įvestų tikslinių genų ekspresija.

Kadangi genetinis kodas yra universalus, genų ekspresijos galimybę lemia tik tai, kad jo sudėtyje yra transkripcijos ir transliacijos inicijavimo ir pabaigos signalų, kuriuos teisingai atpažįsta ląstelė-šeimininkė. Kadangi dauguma aukštesniųjų eukariotų genų turi nenutrūkstamą egzon-introno struktūrą, dėl tokių genų transkripcijos susidaro šabloninis RNR pirmtakas, iš kurio vėlesnio splaisingo metu suskaidomos nekoduojančios sekos – intronai ir subrendusi mRNR. susidaro. Tokie genai negali būti išreikšti bakterijų ląstelėse, kuriose nėra susijungimo sistemos. Siekiant įveikti šią kliūtį, ant subrendusių mRNR molekulių, naudojant atvirkštinę transkriptazę, sintetinama DNR kopija (cDNR), prie kurios naudojant DNR polimerazę pridedama antroji grandinė. Tokie DNR fragmentai, atitinkantys koduojančią genų seką (nebeatskiriami intronais), gali būti įterpti į tinkamą molekulinį vektorių.

Žinant tikslinio polipeptido aminorūgščių seką, galima susintetinti jį koduojančią nukleotidų seką, gaunant geno ekvivalentą ir įterpti į atitinkamą ekspresijos vektorių. Kurdami lygiavertį geną, dažniausiai atsižvelgiama į genetinio kodo išsigimimą (20 aminorūgščių koduoja 61 kodonas) ir kiekvienos aminorūgšties kodonų atsiradimo dažnumą ląstelėse, į kurias planuojama įvesti šį geną. , nes kodonų sudėtis skirtinguose organizmuose gali labai skirtis. Teisingai parinkti kodonai gali žymiai padidinti tikslinio baltymo gamybą recipiento ląstelėje.

Genetinės inžinerijos svarba

Genų inžinerija labai išplėtė eksperimentines ribas molekulinė biologija, nes tapo įmanoma įvesti svetimą DNR į įvairių tipų ląsteles ir ištirti jos funkcijas. Tai leido nustatyti bendrus biologinius genetinės informacijos organizavimo ir raiškos modelius įvairiuose organizmuose. Toks požiūris atvėrė perspektyvas kurti iš esmės naujus mikrobiologinius biologiškai aktyvių medžiagų gamintojus, taip pat gyvūnus ir augalus, turinčius funkciškai aktyvius svetimus genus. Daugelis anksčiau buvo neprieinami biologiškai aktyvių baltymųžmonių, įskaitant interferonus, interleukinus, peptidinius hormonus, kraujo faktorius, dideliais kiekiais pradėjo gamintis bakterijų, mielių ar žinduolių ląstelėse ir yra plačiai naudojami medicinoje. Be to, tapo įmanoma dirbtinai sukurti genus, koduojančius chimerinius polipeptidus, turinčius dviejų ar daugiau natūralių baltymų savybių. Visa tai davė galingą impulsą biotechnologijų vystymuisi.

Pagrindiniai genų inžinerijos objektai – bakterijos Escherichia coli (Escherichia coli) ir Bacillus subtilis (bacillus subtilis), kepimo mielės Saccharomices cereuisiae, įvairios žinduolių ląstelių linijos. Genų inžinerijos įtakos objektų spektras nuolat plečiasi. Intensyviai plėtojamos transgeninių augalų ir gyvūnų kūrimo tyrimų sritys. Kuriant naudojami genų inžinerijos metodai naujausios kartos vakcinos nuo įvairių infekcijų sukėlėjų (pirmoji iš jų buvo sukurta mielių, gaminančių žmogaus B viruso paviršiaus baltymą, pagrindu). Daug dėmesio skiriama žinduolių virusų pagrindu sukurtų klonavimo vektorių kūrimui ir jų panaudojimui kuriant gyvas polivalentines vakcinas veterinarijos ir medicinos reikmėms, taip pat molekulinius vektorius vėžio navikų ir paveldimų ligų genų terapijai. Sukurtas būdas tiesiogiai įvesti recDNR į gyvūnų ir žmonių organizmą, nukreipiant įvairių infekcijų sukėlėjų antigenų gamybą jų ląstelėse (DNR vakcinacija). Naujausia genų inžinerijos kryptis – valgomųjų vakcinų, pagamintų iš transgeninių augalų, tokių kaip pomidorai, morkos, bulvės, kukurūzai, salotos ir kt., kūrimas, gaminančių imunogeninius infekcinių ligų sukėlėjų baltymus. genų inžinerijos rekombinantinė molekulė

Su dirigavimu susiję rūpesčiaigenų inžinerijos eksperimentai

Netrukus po pirmųjų sėkmingų DNR upių gavimo eksperimentų, P. Bergo vadovaujama mokslininkų grupė pasiūlė apriboti daugelio genų inžinerijos eksperimentų atlikimą. Šie rūpesčiai buvo pagrįsti tuo, kad organizmų, turinčių svetimą genetinę informaciją, savybes sunku numatyti. Jie gali įgyti nepageidaujamų savybių, sutrikdyti ekologinę pusiausvyrą, sukelti neįprastų žmonių, gyvūnų ir augalų ligų atsiradimą ir plitimą. Be to, buvo pastebėta, kad žmogaus įsikišimas į gyvų organizmų genetinį aparatą yra amoralus ir gali sukelti nepageidaujamų socialinių ir etinių pasekmių. 1975 metais šios problemos buvo aptartos tarptautinėje konferencijoje Asilomare (JAV). Jo dalyviai priėjo prie išvados, kad būtina ir toliau taikyti genų inžinerijos metodus, tačiau laikantis tam tikrų taisyklių ir rekomendacijų. Vėliau šios taisyklės, nustatytos daugelyje šalių, buvo gerokai sušvelnintos ir sumažintos iki mikrobiologiniuose tyrimuose įprastų metodų, specialių apsauginių priemonių, užkertančių kelią biologinių veiksnių plitimui aplinkoje, kūrimo, saugių vektorių ir recipientų ląstelių, nesidauginti natūraliomis sąlygomis.

Dažnai genų inžinerija suprantama tik kaip darbas su DNR, o terminai „molekulinis klonavimas“, „DNR klonavimas“ ir „genų klonavimas“ vartojami kaip genų inžinerijos sinonimai. Tačiau visos šios sąvokos atspindi tik atskirų genų inžinerijos operacijų turinį ir todėl nėra lygiavertės terminui „genų inžinerija“. Rusijoje terminas „genų inžinerija“ yra plačiai naudojamas kaip genų inžinerijos sinonimas. Tačiau semantinis šių terminų turinys yra kitoks: genų inžinerija siekiama sukurti organizmus su nauja genetine programa, o terminas „genų inžinerija“ paaiškina, kaip tai daroma – manipuliuojant genais.

Paskelbta Allbest.ru

Panašūs dokumentai

Genų inžinerija kaip molekulinės genetikos šaka, susijusi su tikslinga naujų genetinės medžiagos derinių kūrimu. Jo atsiradimo ir raidos istorija, genų sintezės etapai. Ar genetinė modifikacija yra saugi? Jo taikymo pavyzdžiai.

santrauka, pridėta 2009-11-23

Genų inžinerijos samprata ir pagrindiniai metodai. DNR išskyrimo metodas naudojant DNR plazmidžių pavyzdį. Ribojimo-modifikavimo sistemos veikimo principai. Klonuotų genų perkėlimas ir aptikimas ląstelėse. Rekombinantinių DNR molekulių konstravimas ir įvedimas į ląsteles.

santrauka, pridėta 2010-01-23

Tyrimas apie genų inžinerijos esmę ir paskirtį – biotechnologijos metodą, kuris nagrinėja genotipų restruktūrizavimo tyrimus. Rekombinantinių, tai yra, turinčių svetimą geną, plazmidžių – žiedinių dvigrandžių DNR molekulių – gamybos būdas.

pristatymas, pridėtas 2012-02-19

Genų inžinerijos esmė ir uždaviniai, jos raidos istorija. Genetiškai modifikuotų organizmų kūrimo tikslai. Cheminė tarša kaip GMO pasekmė. Žmogaus insulino gavimas kaip svarbiausias pasiekimas genetiškai modifikuotų organizmų srityje.

santrauka, pridėta 2013-04-18

Genų inžinerijos, kaip biotechnologijos priemonės, skirtos gyvų organizmų paveldimumui kontroliuoti, panaudojimas. Pagrindinių genų inžinerijos metodų ir pasiekimų medicinoje ir žemės ūkyje ypatumai, susiję pavojai ir perspektyvos.

ataskaita, pridėta 2011-10-05

Genų inžinerija kaip biotechnologijos metodas, susijęs su genotipų restruktūrizavimo tyrimais. Rekombinantinių plazmidžių gavimo proceso etapai. Naujo tipo ląstelių konstravimas, pagrįstas jų auginimu, hibridizacija ir rekonstrukcija.

pristatymas, pridėtas 2011-11-20

Genų inžinerija: kilmės istorija, bendrosios charakteristikos, privalumai ir trūkumai. Susipažinimas naudojant naujausius metodus genų inžinerija, jų panaudojimas medicinoje. Genų inžinerijos plėtra gyvulininkystės ir paukštininkystės srityje. Eksperimentai su žiurkėmis.

kursinis darbas, pridėtas 2012-11-07

Genų inžinerija – tai biotechnologinis įrankis, skirtas gauti rekombinantinę RNR ir DNR, manipuliuoti genais ir baltymų produktais bei įterpti juos į kitus organizmus. Dabartinė mokslo padėtis apie paveldimumą ir chromosomų ligas.

santrauka, pridėta 2009-06-23

Biotechnologijų atsiradimas. Pagrindinės biotechnologijų kryptys. Bioenergija kaip biotechnologijos šaka. Praktiniai pasiekimai biotechnologijos. Genų inžinerijos istorija. Genų inžinerijos tikslai, metodai ir fermentai. Genų inžinerijos pasiekimai.

santrauka, pridėta 2008-07-23

DNR klonavimo pagrindai ir metodai. Bakterijų genų inžinerijos etapai. Augalų genų inžinerijos plėtra. Augalų genetinė transformacija ir tobulinimas naudojant agrobakterijas, genų šaltinius. Genetiškai modifikuotų augalų sauga.

Įvadas

Savo darbe gvildenu genų inžinerijos temą. Galimybės, kurias žmonijai atveria genų inžinerija tiek fundamentinio mokslo srityje, tiek daugelyje kitų sričių yra labai didelės ir dažnai net revoliucinės.

Taigi tai leidžia pramoninei masinei gamybai reikalingų baltymų, žymiai palengvina fermentacijos produktų – fermentų ir aminorūgščių gavimo technologinius procesus, ateityje jis gali būti naudojamas augalų ir gyvūnų gerinimui, taip pat paveldimoms žmonių ligoms gydyti.

Taigi genų inžinerija yra viena iš pagrindinių krypčių mokslo ir technologijų pažanga, aktyviai prisideda prie daugelio problemų, tokių kaip maisto, žemės ūkio, energetikos ir aplinkosaugos, sprendimo spartinimo.

Tačiau genų inžinerija atveria ypač dideles galimybes medicinai ir farmacijai, nes genų inžinerijos panaudojimas gali sukelti radikalių medicinos transformacijų.

1. Genų inžinerijos esmė.

1.1. Genų inžinerijos istorija.

Genų inžinerija atsirado dėl daugelio mokslininkų darbo įvairiose biochemijos ir molekulinės genetikos srityse.

Daugelį metų baltymai buvo laikomi pagrindine makromolekulių klase. Buvo net prielaida, kad genai yra baltyminio pobūdžio.

Tik 1944 m. Avery, McLeod ir McCarthy parodė, kad DNR yra paveldimos informacijos nešėja.

Nuo to laiko prasidėjo intensyvūs nukleorūgščių tyrimai. Po dešimtmečio, 1953 m., J. Watsonas ir F. Crickas sukūrė dvigrandės DNR modelį. Šie metai laikomi molekulinės biologijos gimimo metais.

50-60-ųjų sandūroje genetinio kodo savybės buvo išaiškintos, o 60-ųjų pabaigoje jo universalumas buvo patvirtintas eksperimentiškai.

Intensyviai vystėsi molekulinė genetika, kurios objektai buvo Escherichia coli (E. Coli), jos virusai ir plazmidės.

Sukurti metodai, skirti išskirti labai išgrynintus nepažeistų DNR molekulių, plazmidžių ir virusų preparatus.

Virusų ir plazmidžių DNR buvo įvesta į ląsteles biologiškai aktyvia forma, užtikrinant jos replikaciją ir atitinkamų genų ekspresiją.

Aštuntajame dešimtmetyje buvo atrasta nemažai fermentų, kurie katalizuoja DNR konversijos reakcijas. Ypatingas vaidmuo kuriant genų inžinerijos metodus tenka restrikcijos fermentams ir DNR ligazėms.

Genų inžinerijos raidos istoriją galima suskirstyti į tris etapus:

Pirmasis etapas yra susijęs su pagrindinės galimybės gauti rekombinantines DNR molekules in vitro įrodymu. Šie darbai susiję su hibridų tarp skirtingų plazmidžių gamyba. Įrodyta galimybė sukurti rekombinantines molekules naudojant pradines DNR molekules iš įvairių bakterijų rūšių ir padermių, jų gyvybingumas, stabilumas ir funkcionavimas.

Antrasis etapas siejamas su rekombinantinių DNR molekulių tarp prokariotų chromosomų genų ir įvairių plazmidžių gavimo darbų pradžia, įrodančiais jų stabilumą ir gyvybingumą.

Trečiasis etapas – eukariotinių genų, daugiausia gyvūnų, įtraukimo į vektorinės DNR molekules (DNR, naudojamos genams perduoti ir gali būti integruota į recipiento ląstelės genetinį aparatą) pradžia.

Formaliai genų inžinerijos gimimo data turėtų būti laikoma 1972 m., kai Stanfordo universitete P. Bergas ir S. Cohenas su bendradarbiais sukūrė pirmąją rekombinantinę DNR, kurioje buvo SV40 viruso, bakteriofago ir E. coli DNR fragmentai.

1.2. Genų inžinerijos samprata

Viena didžiausią praktinį pritaikymą radusi molekulinės genetikos ir molekulinės biologijos šakų yra genų inžinerija.

Genų inžinerija – tai metodų, leidžiančių perkelti genus iš vieno organizmo į kitą, visuma arba tai yra naujų biologinių objektų tikslinės statybos technologija.

Gimusi 70-ųjų pradžioje, šiandien ji sulaukė didžiulės sėkmės. Genų inžinerijos metodai paverčia bakterijų, mielių ir žinduolių ląsteles į „fabrikus“, skirtus didelio masto bet kokių baltymų gamybai.

Tai leidžia detaliai išanalizuoti baltymų struktūrą ir funkcijas bei naudoti juos kaip vaistus.

Šiuo metu Escherichia coli (E. coli) tapo tokių svarbių hormonų, kaip insulinas ir somatotropinas, tiekėja.

Anksčiau insulinas buvo gaunamas iš gyvūnų kasos ląstelių, todėl jo kaina buvo labai didelė. Norint gauti 100 g kristalinio insulino, reikia 800-1000 kg kasos, o viena karvės liauka sveria 200-250 gramų. Dėl to insulinas buvo brangus ir sunkiai prieinamas daugeliui diabetu sergančių žmonių.

Insulinas susideda iš dviejų polipeptidinių grandinių A ir B, kurių ilgis yra 20 ir 30 aminorūgščių. Kai juos sujungia disulfidiniai ryšiai, susidaro natūralus dvigubos grandinės insulinas.

Įrodyta, kad jame nėra E. coli baltymų, endotoksinų ir kitų priemaišų, nesukelia šalutinio poveikio, kaip gyvulinis insulinas, ir nesiskiria nuo jo biologiniu aktyvumu.

Somatotropinas yra žmogaus augimo hormonas, kurį išskiria hipofizė. Šio hormono trūkumas sukelia hipofizės nykštukumą. Jei somatotropinas skiriamas 10 mg 1 kg svorio tris kartus per savaitę, tai per metus vaikas, kenčiantis nuo jo trūkumo, gali augti 6 cm.

Anksčiau jis buvo gautas iš lavoninės medžiagos, iš vieno lavono: 4–6 mg somatotropino galutiniame farmaciniame preparate. Taigi turimi hormono kiekiai buvo riboti, be to, šiuo metodu gautas hormonas buvo nevienalytis ir galėjo turėti lėtai augančių virusų.

1980 m. Genentec kompanija sukūrė somatotropino gamybos naudojant bakterijas technologiją, kuri neturėjo šių trūkumų. 1982 metais Pasteur institute Prancūzijoje žmogaus augimo hormonas buvo gautas E. coli ir gyvūnų ląstelių kultūroje, o 1984 metais SSRS pradėta pramoninė insulino gamyba.

1.3. Genų inžinerijos tikslai ir uždaviniai

Taikomosios genų inžinerijos tikslas – suprojektuoti tokias rekombinantines DNR molekules, kurios, patekusios į genetinį aparatą, suteiktų organizmui žmogui naudingų savybių.

Rekombinantinės DNR technologija suteikė galimybę taikyti netradicinį baltymų ir genų metodą, vadinamą atvirkštine genetika. Taikant šį metodą, baltymas išskiriamas iš ląstelės, šio baltymo genas klonuojamas ir modifikuojamas, sukuriant mutantinį geną, koduojantį pakitusią baltymo formą. Gautas genas įvedamas į ląstelę. Tokiu būdu galima koreguoti sugedusius genus ir gydyti paveldimas ligas.

Jei hibridinė DNR įvedama į apvaisintą kiaušialąstę, galima gauti transgeninių organizmų, kurie perduoda mutantinį geną savo palikuonims.

Gyvūnų genetinė transformacija leidžia nustatyti atskirų genų ir jų baltymų produktų vaidmenį tiek reguliuojant kitų genų veiklą, tiek įvairiuose patologiniuose procesuose.

Rekombinantinėje DNR technologijoje naudojami šie metodai:

·specifinis DNR skilimas restrikcijos nukleazėmis, pagreitinant atskirų genų išskyrimą ir manipuliavimą;

·greitas visų nukleotidų sekos nustatymas išgrynintame DNR fragmente, leidžiantis nustatyti geno ir jo koduojamos aminorūgščių sekos ribas;

·rekombinantinės DNR konstravimas;

·nukleorūgščių hibridizacija, leidžianti tiksliau ir jautriau identifikuoti specifines RNR ar DNR sekas;

·Rekombinantinės DNR įvedimas į ląsteles ar organizmus.

2.1. Genų, turinčių reikiamą informaciją, išskyrimas.

Genus galima gauti keliais būdais: išskyrimu iš DNR, chemine-fermentine sinteze ir fermentine sinteze.

Genų išskyrimas iš DNR vykdomas naudojant restrikcijos fermentus, kurie katalizuoja DNR skilimą srityse, kuriose yra tam tikros nukleotidų sekos (4–7 nukleotidų poros). Skaldymas gali būti atliekamas atpažįstamos nukleotidų porų srities viduryje; šiuo atveju abi DNR grandinės yra „nukirptos“ tame pačiame lygyje. Gauti DNR fragmentai turi vadinamuosius „bukus“ galus. DNR skilimas galimas su poslinkiu, kai viena iš grandinių išsikiša keliais nukleotidais. Šiuo atveju susidarę „lipnūs“ galai dėl savo papildomumo sąveikauja. Nukleotidų seka su lipniais galais gali būti prijungta prie vektoriaus (iš anksto apdoroto tuo pačiu restrikcijos fermentu) ir paversta žiedine seka, kai vienas kitą papildantys galai yra sujungti su ligazėmis. Metodas turi didelių trūkumų, nes gana sunku pasirinkti fermentų veikimą, kad būtų galima griežtai atskirti norimą geną. Kartu su genu užfiksuojami „papildomi“ nukleotidai arba, atvirkščiai, fermentai nupjauna dalį geno, paversdami jį funkciškai sugedusiu.

Jei žinoma, naudojama cheminė-fermentinė sintezė pirminė struktūra baltymas arba peptidas, kurio sintezę koduoja genas. Būtina visiškai žinoti geno nukleotidų seką. Šis metodas leidžia tiksliai atkurti norimą nukleotidų seką, taip pat į genus įvesti restrikcijos fermentų atpažinimo vietas, reguliacines sekas ir kt. - palaipsniui formuojasi esteriniai ryšiai tarp nukleotidų, paprastai 8–16-merų. Šiuo metu yra „genų mašinos“, kurios, valdomos mikroprocesoriaus, labai greitai sintezuoja specifines trumpas vienos grandinės DNR sekas.

Norima bazių seka įvedama į klaviatūrą. Mikroprocesorius atidaro vožtuvus, per kuriuos, naudojant siurblį, į sintezės kolonėlę paeiliui tiekiami nukleotidai, taip pat reikalingi reagentai ir tirpikliai. Kolonėlė užpildyta silicio granulėmis, ant kurių surenkamos DNR molekulės. Šis prietaisas gali susintetinti iki 40 nukleotidų ilgio grandines 1 nukleotido greičiu per 30 minučių. Gauti oligonukleotidai tarpusavyje sujungiami naudojant DNR ligazę, kad susidarytų dvigrandė nukleotidas. Naudojant šis metodas buvo gauti insulino A ir B grandinių genai, proinsulinas, somatostatinas ir kt.

Fermentinė genų sintezė, pagrįsta izoliuota pasiuntinio RNR (mRNR), šiuo metu yra labiausiai paplitęs metodas. Pirmiausia iš ląstelių išskiriamos pasiuntinio RNR, tarp kurių yra mRNR, užkoduota geno, kurį reikia išskirti. Tada patvirtintomis sąlygomis, naudojant atvirkštinę transkriptazę (revertazę), ant iš ląstelės išskirtos mRNR, kaip ant matricos, sintetinama DNR grandinė, komplementari su mRNR (cDNR). Gauta komplementari DNR (cDNR) yra antrosios DNR grandinės sintezės šablonas, naudojant DNR polimerazę arba atvirkštinę. Pradmuo šiuo atveju yra oligonukleotidas, papildantis mRNR 3’ galą; iš deoksinukleozidų trifosfatų, esant magnio jonams, susidaro nauja DNR grandinė.

Metodas su didelė sėkmė panaudotas žmogaus augimo hormono (somatotropino) genui gauti 1979 m. Vienaip ar kitaip gautas genas turi informacijos apie baltymo struktūrą, bet negali jos įgyvendinti pats. Todėl geno veikimui kontroliuoti reikalingi papildomi mechanizmai. Genetinės informacijos perkėlimas į ląstelę recipientą atliekamas kaip vektoriaus dalis. Vektorius, kaip taisyklė, yra apskrita DNR molekulė, galinti savarankiškai replikuotis. Genas kartu su vektoriumi sudaro rekombinantinę DNR.

2.2. Vektorių (virusų, plazmidžių), galinčių savarankiškai replikuotis ląstelėje recipientas, parinkimas.

Terminas „vektorius“ reiškia nukleorūgšties molekulę, kuri, patekusi į ląstelę, gali savarankiškai egzistuoti dėl joje esančių replikacijos ir transkripcijos signalų.

Vektorinės molekulės turi turėti šias savybes:

1) gebėjimas savarankiškai replikuotis ląstelėje recipientas, tai yra būti nepriklausomu replikonu;

Atsižvelgiant į eksperimento tikslus, vektoriai gali būti skirstomi į dvi grupes: 1) naudojami klonuoti ir amplifikuoti norimą geną; 2) specializuoti, naudojami įmontuotų svetimų genų ekspresijai. Antroji vektorių grupė jungia vektorius, skirtus klonuotų genų baltymų produktų sintezei užtikrinti. Ekspresijos vektoriuose yra DNR sekos, kurios būtinos klonuotų genų kopijų transkripcijai ir jų mRNR transliacijai ląstelių kamienuose.

Plazmidės ir bakteriofagai naudojami kaip prokariotiniai vektoriai; Gyvūnų ir augalų virusai, vektoriai, kurių pagrindą sudaro 2 μm mielės ir mitochondrijos, ir daugybė dirbtinai sukonstruotų vektorių, galinčių daugintis tiek bakterinėse, tiek eukariotinėse ląstelėse (shuttle vektoriai), naudojami kaip eukariotų vektoriai.

Plazmidės yra ekstrachromosominiai genetiniai pro- ir eukariotų elementai, kurie autonomiškai dauginasi ląstelėse. Dauguma plazmidinių vektorių yra gauti iš natūralių plazmidžių ColE1, pMB1 ir p15A.

Bakterijų plazmidės skirstomos į dvi klases. Kai kurios plazmidės (pavyzdžiui, gerai ištirtas faktorius F, lemiantis lytį E. coli) pačios gali judėti iš ląstelės į ląstelę, o kitos tokio gebėjimo neturi. Dėl daugelio priežasčių, visų pirma siekiant užkirsti kelią nekontroliuojamam potencialiai pavojingos genetinės medžiagos plitimui, didžioji dauguma bakterinių plazmidžių vektorių yra pagrįsti antrosios klasės plazmidėmis. Daugelyje natūralių plazmidžių jau yra genų, lemiančių ląstelių atsparumą antibiotikams (šių genų produktai yra fermentai, modifikuojantys arba skaidantys antibiotines medžiagas). Be to, konstruojant vektorius į šias plazmides įvedami papildomi genai, lemiantys atsparumą kitiems antibiotikams.

Fig. 1 paveiksle parodytas vienas iš labiausiai paplitusių E.coli plazmidės vektorių – pBR322. Jis sukonstruotas remiantis nuodugniai ištirta E.coli plazmide – kolicinogeniniu faktoriumi ColE1 – ir apima šios plazmidės replikacijos pradžią. ColE1 plazmidės (atitinkamai ir pBR322) ypatumas yra tas, kad esant baltymų sintezės inhibitoriui antibiotikui chloramfenikoliui (kuris netiesiogiai slopina šeimininko chromosomos replikaciją), jo skaičius E. coli padidėja nuo 20-50 iki 1000 molekulių. ląstelėje, todėl galima gauti didelius klonuoto geno kiekius. Konstruojant pBR322 vektorių iš pradinių plazmidžių, buvo pašalinta keletas „papildomų“ restrikcijos fermentų vietų.

Šiuo metu, kartu su daugeliu patogių E. coli vektorių sistemų, plazmidiniai vektoriai buvo sukurti daugeliui kitų gramneigiamų bakterijų (įskaitant tokias pramoniniu požiūriu svarbias, kaip Pseudomonas, Rhizobium ir Azotobacter), gramteigiamų bakterijų (Bacillus), žemesnių bakterijų. grybai (mielės) ir augalai .

Plazmidiniai vektoriai yra patogūs klonuoti santykinai mažus (iki 10 tūkst. bazinių porų) mažų genomų fragmentus. Jei jums reikia įsigyti aukštesniųjų augalų ir gyvūnų genų biblioteką (arba biblioteką), bendras ilgis kurių genomas pasiekia milžiniškus dydžius, įprastiniai plazmidiniai vektoriai šiems tikslams netinka. Aukštesniųjų eukariotų genų bibliotekų kūrimo problema buvo išspręsta naudojant bakteriofago l darinius kaip klonavimo vektorius.

Tarp fagų vektorių patogiausios sistemos buvo sukurtos remiantis bakteriofagų l ir M13 E. coli genomais. Šių fagų DNR yra išplėstų sričių, kurias galima ištrinti arba pakeisti svetima DNR, nepažeidžiant jų gebėjimo daugintis E. coli ląstelėse. Konstruojant vektorių šeimą, pagrįstą l fago DNR, daugelis restrikcijos vietų pirmiausia buvo pašalintos iš jos (padalijus trumpas DNR dalis) iš regiono, kuris nėra būtinas DNR replikacijai, ir tokios vietos buvo paliktos regione, skirtame DNR replikacijai. svetimos DNR įterpimas. Žymėjimo genai dažnai įterpiami į tą patį regioną, siekiant atskirti rekombinantinę DNR nuo pradinio vektoriaus. Tokie vektoriai plačiai naudojami „genų bibliotekoms“ generuoti. Pakeisto fago DNR fragmento ir atitinkamai įterptos svetimos DNR srities dydžiai ribojami iki 15-17 tūkstančių nukleotidų liekanų, nes rekombinantinis fago genomas yra 10% didesnis arba 75% mažesnis už laukinio l fago genomą. , nebegalima supakuoti į fago daleles.

1 pav. Išsamus plazmidės pBR322 restrikcijos žemėlapis.

Tokie apribojimai teoriškai neegzistuoja vektoriams, sukurtiems gijinio bakteriofago M13 pagrindu. Aprašyti atvejai, kai į šio fago genomą buvo įterpta apie 40 tūkstančių nukleotidų likučių ilgio svetima DNR. Tačiau žinoma, kad fagas M13 tampa nestabilus, kai svetimos DNR ilgis viršija 5 tūkstančius nukleotidų liekanų. Tiesą sakant, vektoriai, gauti iš M13 fago DNR, daugiausia naudojami genų sekos nustatymui ir mutagenezei, o į juos įterptų fragmentų dydžiai yra daug mažesni.

Šie vektoriai yra sukonstruoti iš replikacinės (dvigrandės) fago M13 DNR formos, į kurią įkomponuotos „polilinkerio“ sritys (tokio dizaino pavyzdys parodytas 5 pav.). DNR yra įtraukta į fago dalelę kaip vienos grandinės molekulė. Taigi šis vektorius leidžia gauti klonuotą geną arba jo fragmentą tiek dvigrande, tiek viengrande forma. Viengrandės rekombinantinės DNR formos šiuo metu plačiai naudojamos nustatant DNR nukleotidų seką Sangerio metodu ir oligodeoksinukleotidais nukreiptai genų mutagenezei.

Svetimų genų perkėlimas į gyvūnų ląsteles atliekamas naudojant vektorius, gautus iš daugelio gerai ištirtų gyvūnų virusų – SV40, kai kurių adenovirusų, galvijų papilomos viruso, raupų viruso ir kt. Šių vektorių konstravimas atliekamas pagal standartinę schemą: pašalinamos „papildomos“ restrikcijos fermentų vietos, įvedami žymenų genai į DNR sritis, kurios nėra būtinos jos replikacijai (pavyzdžiui, timidinkinazės (tk) genas). nuo HSV (herpes viruso)), reguliuojančių sričių įvedimas, genų ekspresijos lygio didinimas.

Vadinamieji „šaudykliniai vektoriai“, galintys daugintis tiek gyvūnų, tiek bakterijų ląstelėse, pasirodė esą patogūs. Jie gaminami sujungiant didelius gyvūnų ir bakterijų vektorių segmentus (pavyzdžiui, SV40 ir pBR322), kad sritys, atsakingos už DNR replikaciją, liktų nepakitusios. Tai leidžia atlikti pagrindines vektoriaus sukūrimo bakterijų ląstelėje operacijas (tai techniškai daug paprastesnė), o vėliau panaudoti gautą rekombinantinę DNR klonuoti genus gyvūno ląstelėje.

2 pav. M13 mp8 vektoriaus apribojimų žemėlapis.

2.3. Rekombinantinės DNR paruošimas.

Rekombinantinės DNR konstravimo esmė – DNR fragmentų, tarp kurių yra mus dominanti DNR sritis, integravimas į vadinamąsias vektorines DNR molekules (arba tiesiog vektorius) – plazmidinę arba virusinę DNR, kurios gali būti perkeltos į pro. - arba eukariotinės ląstelės ir ten autonomiškai dauginasi. Kitame etape atrenkamos ląstelės, turinčios rekombinantinę DNR (naudojant žymenų charakteristikas, kurias turi pats vektorius), o tada atskiri klonai su mus dominančiu DNR segmentu (naudojant konkrečiam genui būdingas charakteristikas arba zondus). arba DNR segmentas).

Sprendžiant daugybę mokslinių ir biotechnologinių problemų, rekombinantinės DNR konstravimas taip pat reikalauja sukurti sistemas, užtikrinančias maksimalią klonuoto geno ekspresiją.

Yra trys pagrindiniai būdai, kaip integruoti svetimą DNR į vektorių molekules. Pirmuoju atveju 3 colių DNR fragmentų galai, tarp kurių yra mus dominanti DNR sritis (genas arba jo segmentas, reguliavimo sritis), pratęsiami homopolinukleotidų seka (pavyzdžiui, poli(T)). naudojant galinį nukleotidilo transferazės fermentą. 3" galai yra linijinės formos vektoriaus DNR išplečiama tokiu pat būdu su jai komplementaria homopolinukleotidų seka (ty poli (A)). Tai leidžia sujungti dvi DNR molekules papildomai suporuojant dirbtinai pagamintus „lipnius“ galus.

Antruoju atveju „lipnūs“ galai sukuriami vienai iš restrikcijos endonukleazių (restrikcijos fermentų) skaidant DNR molekules (tiek vektorių, tiek turinčias mus dominantį fragmentą). Restrikcijos fermentai pasižymi itin dideliu specifiškumu. Jie „atpažįsta“ kelių nukleotidų likučių DNR seką ir suardo jose griežtai apibrėžtas tarpnukleotidines jungtis. Todėl net didelėje DNR restrikcijos fermentai įveda ribotą skaičių pertraukų.

Trečiasis būdas – pirmųjų dviejų derinys, kai restrikcijos fermento suformuoti lipnūs DNR galai pratęsiami sintetinėmis sekomis (3 pav.).

DNR fragmentų galus galima paversti „lipniais“, pratęsiant juos dvigrandžiais oligonukleotidais („linkeriais“), kuriuose yra restrikcijos atpažinimo vieta.

3 pav. Rekombinantinės DNR konstravimo schema naudojant PstI restrikcijos fermentus ir poli(G)-poli(C)-linkerį.

zojus. Apdorojant tokį fragmentą su šiuo restrikcijos fermentu, jis tinkamas integruoti į vektorinę DNR molekulę, suskaidytą tuo pačiu restrikcijos fermentu. Dažnai polinukleotidų fragmentai naudojami kaip „linkeriai“, kuriuose yra specifinės vietos keliems restrikcijos fermentams vienu metu (jie vadinami „polilinkeriais“).

Į vektorių įterpus svetimą DNR, jų kovalentinis kryžminis susiejimas atliekamas DNR ligaze. Jei tarpo dydis rekombinuotoje molekulėje viršija vieną fosfodiesterio jungtį, jis atstatomas in vitro naudojant DNR polimerazę arba in vivo naudojant ląstelių atstatymo sistemas.

2.4. Rekombinantinės DNR įvedimas į recipiento ląstelę

Rekombinantinės DNR perkėlimas atliekamas transformuojant arba konjuguojant. Transformacija yra pokyčių procesas genetinės savybės ląstelės dėl svetimos DNR prasiskverbimo į ją. Pirmą kartą pneumokokuose jį atrado F. Giffithas, kuris parodė, kad kai kurios nevirulentinių bakterijų padermių ląstelės, kai jos užkrečia peles kartu su virulentiškomis padermėmis, įgyja patogeninių savybių. Vėliau transformacija buvo įrodyta ir ištirta įvairiose bakterijų rūšyse. Nustatyta, kad tik kelios vadinamosios „kompetentingos“ ląstelės (galinčios įtraukti svetimą DNR ir susintetinti specialų transformuojantį baltymą) yra pajėgios transformuotis. Ląstelės kompetenciją lemia ir aplinkos veiksniai. Tai galima palengvinti ląsteles apdorojant polietilenglikoliu arba kalcio chloridu. Po prasiskverbimo į ląstelę viena iš rekombinantinių DNR grandinių suyra, o kita dėl rekombinacijos su homologine recipiento DNR sritimi gali būti įtraukta į chromosomą arba ekstrachromosominį vienetą. Transformacija yra labiausiai universaliu būdu genetinės informacijos perdavimas ir yra labai svarbus genetinėms technologijoms.

Konjugacija yra vienas iš keitimosi genetine medžiaga būdų, kurio metu genetinė informacija perduodama vienakrypčiu būdu iš donoro recipientui. Šį perkėlimą kontroliuoja specialios konjugacinės plazmidės (vaisingumo faktorius). Informacija iš donoro ląstelės į recipiento ląstelę perduodama per specialius lytinių organų gaurelius (pili). Taip pat galima perduoti informaciją naudojant nekonjugacines plazmides, dalyvaujant pagalbinėms plazmidėms. Viso viruso ar fago genų rinkinio perkėlimas, dėl kurio ląstelėje išsivysto fago dalelės, vadinamas transfekcija. Šis metodas, taikomas bakterijų ląstelėms, apima sferoplastų gavimą, inkubacinės terpės išgryninimą iš nukleazių ir išgrynintos fago DNR pridėjimą (protamino sulfato buvimas padidina transfekcijos efektyvumą). Technika taikoma gyvūnams ir augalų ląstelės dalyvaujant specialiems šaudykliniams virusiniams pernešėjams.

Taikant žmonėms, genų inžinerija galėtų būti naudojama paveldimų ligų gydymui. Tačiau techniškai yra didelis skirtumas tarp paties paciento gydymo ir jo palikuonių genomo keitimo.

Suaugusio žmogaus genomo keitimo užduotis yra šiek tiek sudėtingesnė nei naujų genetiškai modifikuotų gyvūnų veislių veisimas, nes tokiu atveju reikia pakeisti daugelio jau susiformavusio organizmo ląstelių genomą, o ne tik vieną embrioninį kiaušinį. Norėdami tai padaryti, kaip vektorių siūloma naudoti virusines daleles. Virusinės dalelės gali prasiskverbti į didelę suaugusio žmogaus ląstelių dalį, įterpdamos į jas savo paveldimą informaciją; galimas kontroliuojamas viruso dalelių dauginimasis organizme. Tuo pačiu metu, siekdami sumažinti šalutinį poveikį, mokslininkai stengiasi išvengti genetiškai modifikuotos DNR patekimo į lytinių organų ląsteles, taip išvengiant poveikio būsimiems paciento palikuonims. Taip pat verta atkreipti dėmesį į reikšmingą šios technologijos kritiką žiniasklaidoje: genetiškai modifikuotų virusų vystymąsi daugelis suvokia kaip grėsmę visai žmonijai.

Genų terapijos pagalba ateityje įmanoma pakeisti žmogaus genomą. Šiuo metu veiksmingi žmogaus genomo modifikavimo metodai yra kuriami ir bandomi su primatais. Ilgą laiką beždžionių genų inžinerija susidūrė su rimtais sunkumais, tačiau 2009 metais eksperimentus vainikavo sėkmė: žurnale „Nature“ pasirodė publikacija apie sėkmingą genetiškai modifikuotų virusinių vektorių panaudojimą suaugusiam beždžionių patinui išgydyti nuo daltonizmo. Tais pačiais metais pirmasis genetiškai modifikuotas primatas (išaugintas iš modifikuoto kiaušinio) susilaukė palikuonių – paprastosios marmozetės.

Nors ir nedideliu mastu, genų inžinerija jau naudojama tam, kad kai kurių nevaisingumo rūšių turinčioms moterims būtų suteikta galimybė pastoti naudojant sveikos moters kiaušinėlius. Dėl to vaikas paveldi genotipą iš vieno tėvo ir dviejų motinų.

Tačiau galimybė atlikti reikšmingesnius žmogaus genomo pokyčius susiduria su daug rimtų etinių problemų.

Išvada

Intensyviai plėtojant genų inžinerijos metodus, atsirado daugelio ribosomų, transportavimo ir 5S RNR, histonų, pelių, triušių, žmogaus globino, kolageno, ovalbumino, žmogaus insulino ir kitų peptidinių hormonų, žmogaus interferono ir kt. klonai. buvo gautas.

Tai leido sukurti bakterijų padermes, kurios gamina daug biologiškai aktyvių medžiagų, naudojamų medicinoje, žemės ūkyje ir mikrobiologinėje pramonėje.

Remiantis genų inžinerija, atsirado farmacijos pramonės šaka, vadinama „DNR pramone“. Tai viena iš šiuolaikinių biotechnologijos šakų.

Už medicininiam naudojimuižmogaus insulinas (humulinas), gautas naudojant recDNR, patvirtintas. Be to, remiantis daugybe jų tyrimo metu gautų atskirų genų mutantų, buvo sukurtos labai veiksmingos bandymų sistemos, leidžiančios nustatyti aplinkos veiksnių genetinį aktyvumą, įskaitant kancerogeninių junginių identifikavimą.

NAUDOTOS NUORODOS:

1) Bekish O.-Ya.L. Medicinos biologija. – Mn.: Urajai, 2000. – 114-119 p.

2) Mutovinas G.R. Klinikinės genetikos pagrindai. – M.: absolventų mokykla, 1997. – p. 83-84.

3) Kiškis R.S. Pagrindai medicininė genetika. – Mn.: Aukštoji mokykla, 1998. – p. 60-65.

4) biotechnolog.ru

Planas:

Įvadas.

1.Genų inžinerijos esmė.

1.1. Genų inžinerijos istorija

1.2. Genų inžinerijos samprata

1.3. Genų inžinerijos tikslai ir uždaviniai

2. Organizmų kūrimo su genetiškai modifikuota programa etapai.

2.1. Genų (natūralių arba sintetinių), turinčių reikiamą informaciją, išskyrimas.

2.2. Vektorių (virusų, plazmidžių), galinčių savarankiškai replikuotis ląstelėje recipientas, parinkimas.

2.3. Rekombinantinės DNR paruošimas.

2.4. Rekombinantinės DNR įvedimas į recipiento ląstelę.

3.Genų inžinerijos technologijų taikymas medicinoje.

Kurių pagalba vykdomas kryptingas bet kokių organizmų genetinės informacijos derinimas. Genų inžinerija (GE) leidžia įveikti natūralias tarprūšines kliūtis, trukdančias keistis genetine informacija tarp taksonomiškai nutolusių organizmų rūšių ir sukurti ląsteles bei organizmus su gamtoje neegzistuojančių genų deriniais, turinčiais nurodytomis paveldimomis savybėmis.

Pagrindinis genų inžinerijos įtakos objektas yra genetinės informacijos nešėja – dezoksiribonukleino rūgštis (DNR), kurios molekulė dažniausiai susideda iš dviejų grandinių. Griežtas purino ir pirimidino bazių poravimo specifiškumas lemia komplementarumo savybę – abipusį nukleotidų atitikimą dviejose grandinėse. Naujų genų derinių kūrimas pasirodė įmanomas dėl esminio DNR molekulių struktūros panašumo visų tipų organizmuose ir tikrojo genetikos universalumo. Kodas leidžia išreikšti svetimus genus (jų funkcinio aktyvumo pasireiškimą) bet kokio tipo ląstelėje. Tai taip pat palengvino žinių kaupimas chemijos srityje, genų organizavimo ir veikimo molekulinių ypatybių nustatymas (įskaitant jų ekspresijos reguliavimo mechanizmų sukūrimą ir galimybę pajungti genus „svetimo“ veikimui). reguliavimo elementai), DNR sekos nustatymo metodų kūrimas, polimerazės grandininės reakcijos atradimas, kuris leido greitai susintetinti bet kurį DNR fragmentą.

Svarbios prielaidos atsirasti G.I. buvo: plazmidžių, galinčių autonomiškai replikuotis ir pereiti iš vienos bakterinės ląstelės į kitą, atradimas ir transdukcijos reiškinys – tam tikrų genų perkėlimas bakteriofagais, o tai leido suformuluoti vektorių – genų nešėjų molekulių – idėją.

Didelę reikšmę kuriant G.I. vaidina fermentai, dalyvaujantys nukleino rūgščių transformavime: restrikcijos fermentai (atpažįsta griežtai apibrėžtas sekas (vietoves) DNR molekulėse ir šiose vietose „perkerta“ dvigubą grandinę), DNR ligazės (kovalentiškai suriša atskirus DNR fragmentus), atvirkštinė transkriptazė (sintetina). RNR ant šablono yra papildoma DNR kopija arba cDNR) ir tt Tik esant jiems yra kuriamas menas. struktūra tapo techniškai įmanoma užduotimi. Fermentai naudojami atskiriems DNR fragmentams (genams) gauti ir sukurti molekulinius hibridus – rekombinantinę DNR (recDNR) plazmidžių ir virusų DNR pagrindu. Pastarieji į ląstelę šeimininką pristato norimą geną, užtikrindami ten jo dauginimąsi (klonavimą) ir galutinio geno produkto susidarymą (jo ekspresiją).

Rekombinantinių DNR molekulių kūrimo principai

Sąvoka „G. Ir." paplito po P. Bergo ir kt., 1972 m. Pirmą kartą buvo gauta rekombinantinė DNR, kuri buvo hibridas, kuriame buvo sujungti Escherichia coli bakterijos DNR fragmentai, jos virusas (bakteriofagas λ) ir pamiškės viruso SV40 DNR. 1973 metais S. Cohen ir kt. Mes naudojome plazmidę pSC101 ir restrikcijos fermentą ( Eco RI), kuris sulaužo jį vienoje vietoje taip, kad dvigrandės DNR molekulės galuose susidaro trumpos viena kitą papildančios vienagrandės „uodegos“ (dažniausiai 4-6 nukleotidai). Jie vadinami „lipniais“, nes gali poruotis (tarsi sulipti) vienas su kitu. Tokią DNR sumaišius su svetimos DNR fragmentais, apdorotais tuo pačiu restrikcijos fermentu ir turinčiais tuos pačius lipnius galus, buvo gautos naujos hibridinės plazmidės, kurių kiekvienoje buvo bent vienas svetimos DNR fragmentas, įterptas Eco Plazmidės RI vieta. Tapo akivaizdu, kad į tokias plazmides galima įterpti įvairių svetimų DNR fragmentų, gautų tiek iš mikroorganizmų, tiek iš aukštesniųjų eukariotų.

Pagrindinė šiuolaikinė recDNA gavimo strategija yra tokia:

Į plazmidės ar viruso, galinčio daugintis nepriklausomai nuo chromosomos, DNR įterpiami kitam organizmui priklausantys DNR fragmentai, turintys tam tikrų savybių. tyrėją dominančius genus arba dirbtinai gautas nukleotidų sekas;
gautos hibridinės molekulės įvedamos į jautrias prokariotines ar eukariotas ląsteles, kur jos replikuojamos (dauginamos, amplifikuojamos) kartu su jose įmontuotais DNR fragmentais;
ląstelių klonai atrenkami kolonijų pavidalu ant specialios maistinės terpės (arba virusai - valymo zonų pavidalu - plokštelės ant nuolatinio bakterijų ląstelių ar gyvūnų audinių kultūrų augimo sluoksnio), turinčios reikiamų tipų recDNR molekules ir paveikiamos. atlikti išsamius struktūrinius ir funkcinius tyrimus.

Siekiant palengvinti ląstelių, kuriose yra recDNR, atranką, naudojami vektoriai, turintys vieną ar daugiau žymenų. Pavyzdžiui, plazmidėse atsparumo antibiotikams genai gali būti tokie žymenys (ląstelės, kuriose yra recDNR, atrenkamos pagal jų gebėjimą augti esant tam tikram antibiotikui). RecDNA, turinti norimus genus, atrenkama ir įvedama į recipiento ląsteles. Nuo šio momento prasideda molekulinis klonavimas - gaunamos recDNR kopijos, taigi ir tikslinių genų kopijos jos sudėtyje. Tik jei įmanoma atskirti visas transfekuotas arba užkrėstas ląsteles, kiekvienas klonas bus atstovaujamas atskira ląstelių kolonija ir jame bus specifinė ląstelė. recDNA. Paskutiniame etape atliekamas klonų, turinčių norimą geną, identifikavimas (paieška). Jis pagrįstas tuo, kad įterpimas į recDNR lemia tam tikrą unikalią ląstelės, kurioje ji yra, savybę (pavyzdžiui, įterpto geno ekspresijos produktą). Molekulinio klonavimo eksperimentuose laikomasi 2 pagrindinių principų:

nė viena ląstelė, kurioje vyksta recDNR klonavimas, neturėtų gauti daugiau nei vienos plazmidės molekulės ar viruso dalelės;
pastarieji turi gebėti replikuotis.

Kaip vektorinės molekulės G.I. naudojamas platus plazmidės ir viruso DNR spektras. Populiariausi klonavimo vektoriai turi keletą genetinių genų. žymenys ir turintys tą pačią veikimo vietą skirtingiems restrikcijos fermentams. Pavyzdžiui, šį reikalavimą geriausiai tenkina plazmidė pBR322, kuri buvo sukurta iš natūraliai atsiradusios plazmidės, naudojant metodus, naudojamus dirbant su recDNR; jame yra atsparumo ampicilinui ir tetraciklinui genų ir viena atpažinimo vieta 19 skirtingų restrikcijos fermentų. Ypatingas klonavimo vektorių atvejis yra ekspresijos vektoriai, kurie kartu su amplifikacija užtikrina teisingą ir efektyvią svetimų genų ekspresiją recipiento ląstelėse. Kai kuriais atvejais molekuliniai vektoriai gali užtikrinti svetimos DNR integraciją į ląstelės ar viruso genomą (jie vadinami integraciniais vektoriais).

Viena iš svarbiausių G.I. - bakterijų ar mielių padermių, gyvūnų ar augalų audinių ląstelių linijų, taip pat transgeninių augalų ir gyvūnų (žr. Transgeniniai organizmai) kūrimas, kuris užtikrintų efektyvią juose klonuotų genų ekspresiją. Aukštas baltymų gamybos lygis pasiekiamas, kai genai klonuojami daugiakopiuose vektoriuose, nes šiuo atveju tikslinio geno ląstelėje bus dideli kiekiai. Svarbu, kad DNR koduojanti seka būtų kontroliuojama promotoriaus, kurį efektyviai atpažįsta ląstelės RNR polimerazė, ir kad gauta mRNR būtų gana stabili ir efektyviai verčiama. Be to, svetimkūnio baltymas, susintetintas recipiento ląstelėse, neturėtų būti sparčiai skaidomas tarpląstelinių proteazių. Kuriant transgeninius gyvūnus ir augalus, dažnai pasiekiama specifinė įvestų tikslinių genų ekspresija.

Nuo genetinės kodas yra universalus, tai lemia tik tai, kad jo sudėtyje yra transkripcijos ir transliacijos inicijavimo ir pabaigos signalų, kuriuos teisingai atpažįsta ląstelė-šeimininkė. Nes Dauguma aukštesniųjų eukariotų genų turi nenutrūkstamą egzonų-intronų struktūrą dėl tokių genų transkripcijos susidaro pirmtakas pasiuntinio RNR (pre-mRNR), iš kurios vėlesnio sujungimo metu susidaro nekoduojančios sekos – intronai; atsiskiria ir susidaro subrendusi mRNR. Tokie genai negali būti išreikšti bakterijų ląstelėse, kuriose nėra susijungimo sistemos. Siekiant įveikti šią kliūtį, ant subrendusių mRNR molekulių, naudojant atvirkštinę transkriptazę, sintetinama DNR kopija (cDNR), prie kurios naudojant DNR polimerazę pridedama antroji grandinė. Tokie DNR fragmentai, atitinkantys geną koduojančią seką (nebeatskiriami intronais), gali būti įterpti į tinkamą molekulinį vektorių.

Žinant tikslinio polipeptido aminorūgščių seką, galima susintetinti jį koduojančią nukleotidų seką, gaunant vadinamąją. ekvivalentinį geną ir įterpkite jį į atitinkamą ekspresijos vektorių. Kuriant lygiavertį geną dažniausiai atsižvelgiama į genetinės degeneracijos savybę. kodas (20 aminorūgščių koduoja 61 kodonas) ir kiekvienos aminorūgšties kodonų atsiradimo dažnis tose ląstelėse, į kurias planuojama įvesti šį geną, nes Įvairių organizmų kodonų sudėtis gali labai skirtis. Teisingai parinkti kodonai gali žymiai padidinti tikslinio baltymo gamybą recipiento ląstelėje.

Genetinės inžinerijos svarba

G.I. žymiai išplėtė eksperimentines ribas, nes leido patekti į dekomp. ląstelių tipų svetimą DNR ir ištirti jos funkcijas. Tai leido nustatyti bendruosius biologinius genetikos organizavimo ir raiškos modeliai. informacija įvairi organizmai. Šis požiūris atvėrė perspektyvas sukurti iš esmės naujus mikrobiologinius biologiškai aktyvių medžiagų gamintojai. taip pat gyvūnai ir augalai, nešantys funkciškai aktyvius svetimus genus. Mn. anksčiau neprieinami biologiškai aktyvūs žmogaus baltymai, įsk. interferonai, interleukinai, peptidiniai hormonai, kraujo faktoriai pradėjo gamintis dideliais kiekiais bakterijų, mielių ar žinduolių ląstelėse ir buvo plačiai naudojami medicinoje. Be to, tapo įmanoma dirbtinai sukurti genus, koduojančius chimerinius polipeptidus, turinčius dviejų ar daugiau natūralių baltymų savybių. Visa tai davė galingą impulsą biotechnologijų vystymuisi.

Pagrindiniai objektai G.I. yra bakterijos Escherichia coli (Escherichia coli) ir Bacila subtilis (bacilų šienas), kepimo mielės Sacharomices cerevisiae, dekomp. žinduolių ląstelių linijos. Genų inžinerijos įtakos objektų spektras nuolat plečiasi. Intensyviai plėtojamos transgeninių augalų ir gyvūnų kūrimo tyrimų sritys. Naudojant G.I Kuriamos naujausios kartos vakcinos nuo įvairių infekcijų sukėlėjų (pirmoji iš jų buvo sukurta mielių, gaminančių žmogaus hepatito B viruso paviršiaus baltymą, pagrindu). Daug dėmesio skiriama žinduolių virusų pagrindu sukurtų klonavimo vektorių kūrimui ir jų panaudojimui kuriant gyvas polivalentines vakcinas veterinarijos ir medicinos reikmėms, taip pat molekulinius vektorius vėžio navikų ir paveldimų ligų genų terapijai. Sukurtas metodas tiesioginiam recDNR įvedimui į žmonių ir gyvūnų organizmą, nukreipiant įvairių antigenų gamybą jų ląstelėse. infekcinių agentų (DNR vakcinacija). Naujausia G.I. yra valgomųjų vakcinų, pagrįstų transgeniniais augalais, tokiais kaip pomidorai, morkos, bulvės, kukurūzai, salotos ir kt., kūrimas, gaminančių imunogeninius infekcinių agentų baltymus.

Susirūpinimas, susijęs su genų inžinerijos eksperimentais

Netrukus po pirmųjų sėkmingų recDNR gavimo eksperimentų, P. Bergo vadovaujama mokslininkų grupė pasiūlė apriboti daugelio genų inžinerijos eksperimentų atlikimą. Šie rūpesčiai buvo pagrįsti tuo, kad organizmų, kuriuose yra svetimos genetikos, savybės. informaciją sunku numatyti. Jie gali įgyti nepageidaujamų savybių ir sutrikdyti aplinką. subalansuoti, sukelti neįprastų žmonių, gyvūnų ir augalų ligų atsiradimą ir plitimą. Be to, buvo pažymėta, kad žmogaus įsikišimas į genetinę gyvų organizmų aparatas yra amoralus ir gali sukelti nepageidaujamų socialinių ir etinių pasekmių. 1975 metais šios problemos buvo aptartos tarptautinėje konferencijoje. konferencijoje Asilomare (JAV). Jo dalyviai priėjo prie išvados, kad būtina ir toliau naudoti G.I. tačiau privaloma laikytis apibrėžimo. taisyklės ir rekomendacijos. Vėliau šios taisyklės, nustatytos daugelyje šalių, buvo gerokai sušvelnintos ir sumažintos iki įprastų mikrobiologijos metodų. tyrimai, kūrimas specialių apsaugos priemonės, neleidžiančios plisti biologiniams veiksniams. sukėlėjų aplinkoje, saugių vektorių ir recipientų ląstelių, kurios nesidaugina natūraliomis sąlygomis, naudojimas.

Dažnai pagal G.i. suprasti tik darbą su recDNA ir kaip G.I. Naudojami terminai „molekulinis klonavimas“, „DNR klonavimas“, „genų klonavimas“. Tačiau visos šios sąvokos atspindi tik atskirų genų inžinerijos operacijų turinį ir todėl nėra lygiavertės terminui G.I. Rusijoje, kaip sinonimą G.I. Terminas „genų inžinerija“ yra plačiai vartojamas. Tačiau šių terminų semantinis turinys skiriasi: G.i. siekiama sukurti organizmus su nauja genetika. programa, o terminas „genų inžinerija“ paaiškina, kaip tai daroma, t.y. per genų manipuliavimą.

Literatūra

Shchelkunovas S.N. Genų klonavimas. Novosibirskas, 1986; Vatsonas J., Tūzas J.,Kurtzas D. Rekombinantinė DNR: trumpas kursas. M., 1986; DNR klonavimas. Methods M., 1988; DNR klonavimo naujiena: Methods M., 1989. Shchelkunovas S.N. Genų inžinerija. 2 leidimas, Novosibirskas, 2004 m.