Genų inžinerijos dalykas. Genų inžinerija

Enciklopedinis „YouTube“.

• 1 / 5

  Genų inžinerija padeda gauti norimas kintamo ar genetiškai modifikuoto organizmo savybes. Skirtingai nuo tradicinės atrankos, kurios metu genotipas keičiasi tik netiesiogiai, genų inžinerija leidžia tiesiogiai įsikišti į genetinį aparatą naudojant molekulinio klonavimo techniką. Genų inžinerijos taikymo pavyzdžiai – naujų genetiškai modifikuotų grūdinių kultūrų veislių auginimas, žmogaus insulino gamyba naudojant genetiškai modifikuotas bakterijas, eritropoetino gamyba ląstelių kultūroje arba naujų veislių eksperimentinės pelės moksliniams tyrimams.

  Mikrobiologinės, biosintetinės pramonės pagrindas yra bakterijų ląstelė. Pramoninei gamybai reikalingos ląstelės parenkamos pagal tam tikras charakteristikas, iš kurių svarbiausia – gebėjimas gaminti, sintetinti, o kartu ir maksimaliai. galimus kiekius, specifinis junginys – aminorūgštis arba antibiotikas, steroidinis hormonas arba organinė rūgštis. Kartais reikia turėti mikroorganizmą, galintį, pavyzdžiui, naftą ar nuotekas panaudoti kaip „maistą“ ir perdirbti į biomasę ar net baltymus, visai tinkamus pašarų priedams. Kartais mums reikia organizmų, kurie gali vystytis aukštesnėje temperatūroje arba esant medžiagoms, kurios neabejotinai yra mirtinos kitų tipų mikroorganizmams.

  Tokių pramoninių padermių gavimo užduotis yra labai svarbi jų modifikavimui ir atrankai – nuo ​​apdorojimo stipriais nuodais; radiacijos poveikis. Šių technikų tikslas yra vienas – pasiekti paveldimo, genetinio ląstelės aparato pokyčių. Jų rezultatas – daugybė mutantinių mikrobų, iš kurių šimtai ir tūkstančiai vėliau bando atrinkti tinkamiausius konkrečiam tikslui. Cheminės ar radiacinės mutagenezės metodų sukūrimas buvo puikus biologijos pasiekimas ir plačiai naudojamas šiuolaikinėje biotechnologijoje.

  Tačiau jų galimybes riboja pačių mikroorganizmų prigimtis. Jie nesugeba susintetinti daugelio vertingų medžiagų, kurios kaupiasi augaluose, pirmiausia vaistiniuose ir eteriniuose augaluose. Jie negali susintetinti gyvūnų ir žmonių gyvybei labai svarbių medžiagų, daugybės fermentų, peptidinių hormonų, imuninių baltymų, interferonų ir daugelio paprastesnių junginių, kurie sintetinami gyvūnų ir žmonių organizme. Žinoma, mikroorganizmų galimybės toli gražu neišsemtos. Iš visų mikroorganizmų gausos tik nereikšminga dalis. Mikroorganizmų atrankos tikslais labai domina, pavyzdžiui, anaerobinės bakterijos, galinčios gyventi be deguonies, fototrofai, naudojantys šviesos energiją, pavyzdžiui, augalai, chemoautotrofai, termofilinės bakterijos, galinčios gyventi aukštoje temperatūroje, kaip neseniai atrasta, apie 110 ° C ir kt.

  Ir vis dėlto apribojimai natūrali medžiaga“ akivaizdu. Jie bandė ir bando apeiti apribojimus naudodamiesi augalų ir gyvūnų ląstelių ir audinių kultūromis. Tai labai svarbus ir perspektyvus kelias, kuris diegiamas ir biotechnologijoje. Per pastaruosius kelis dešimtmečius mokslininkai sukūrė metodus, pagal kuriuos atskiros augalo ar gyvūno audinių ląstelės gali augti ir daugintis atskirai nuo kūno, pavyzdžiui, bakterijų ląstelės. Tai buvo svarbus pasiekimas- gautos ląstelių kultūros naudojamos eksperimentams ir pramoninės gamybos kai kurios medžiagos, kurių negalima gauti naudojant bakterijų kultūras.

  Kita tyrimų kryptis – baltymų kodavimui ir organizmų funkcionavimui nereikalingų genų pašalinimas iš DNR ir tokių DNR pagrindu sukurtų genų kūrimas. dirbtiniai organizmai su „sutrumpintu genų rinkiniu“. Tai leidžia smarkiai padidinti modifikuotų organizmų atsparumą virusams.

  Plėtros istorija ir pasiektas technologijos lygis

  XX amžiaus antroje pusėje buvo padaryti keli svarbūs atradimai ir išradimai genų inžinerija. Daugelį metų trukę bandymai „perskaityti“ genuose „įrašytą“ biologinę informaciją buvo sėkmingai užbaigti. Šį darbą pradėjo anglų mokslininkas Frederickas Sangeris ir amerikiečių mokslininkas Walteris Gilbertas (1980 m. Nobelio chemijos premija). Kaip žinoma, genuose yra informacijos-instrukcijos, skirtos RNR molekulių ir baltymų, įskaitant fermentus, sintezei organizme. Norint priversti ląstelę sintetinti naujas jai neįprastas medžiagas, būtina, kad joje būtų susintetinti atitinkami fermentų rinkiniai. Ir tam reikia arba tikslingai keisti jame esančius genus, arba įvesti naujus, anksčiau nebuvusius genus. Genų pokyčiai gyvose ląstelėse yra mutacijos. Jie atsiranda veikiant, pavyzdžiui, mutagenams – cheminiams nuodams ar radiacijai. Tačiau tokių pokyčių negalima kontroliuoti ar nukreipti. Todėl mokslininkai sutelkė savo pastangas bandydami sukurti metodus, kaip į ląsteles įvesti naujus, labai specifinius žmonėms reikalingus genus.

  Pagrindiniai genų inžinerijos problemos sprendimo etapai yra šie:

  1. Išskirto geno gavimas.
  2. Geno įvedimas į vektorių pernešimui į kūną.
  3. Vektoriaus su genu perkėlimas į modifikuotą organizmą.
  4. Kūno ląstelių transformacija.
  5. Atranka genetiškai modifikuoti organizmai (GMO) ir pašalinant tuos, kurie nebuvo sėkmingai modifikuoti.

  Genų sintezės procesas dabar yra labai gerai išvystytas ir netgi iš esmės automatizuotas. Yra specialūs įrenginiai, aprūpinti kompiuteriais, kurių atmintyje saugomos įvairių nukleotidų sekų sintezės programos. Šiuo aparatu sintetinami iki 100-120 azoto bazių ilgio DNR segmentai (oligonukleotidai). Plačiai paplito metodas, leidžiantis panaudoti polimerazės grandininę reakciją DNR, įskaitant mutantinę DNR, sintezei. Tam naudojamas termostabilus fermentas DNR polimerazė matricos sintezė DNR, kuriai dirbtinai susintetinti gabaliukai naudojami kaip sėkla nukleino rūgštis- oligonukleotidai. Fermentas atvirkštinė transkriptazė leidžia, naudojant tokius pradmenis, sintezuoti DNR ant RNR šablono, išskirto iš ląstelių. Tokiu būdu susintetinta DNR vadinama komplementaria DNR (RNR) arba kDNR. Iš fagų bibliotekos taip pat galima gauti izoliuotą, „chemiškai gryną“ geną. Taip vadinamas bakteriofago preparatas, kurio genome yra įmontuoti atsitiktiniai fragmentai iš genomo arba cDNR, kuriuos fagas atgamina kartu su visa jo DNR.

  Genų įvedimo į bakterijas technika buvo sukurta po to, kai Frederickas Griffithas atrado bakterijų transformacijos reiškinį. Šis reiškinys pagrįstas primityviu seksualiniu procesu, kurį bakterijose lydi nedidelių nechromosominės DNR fragmentų, plazmidžių mainai. Plazmidžių technologijos sudarė pagrindą dirbtinių genų įvedimui į bakterijų ląsteles.

  Dideli sunkumai buvo susiję su paruošto geno įvedimu į paveldimą augalų ir gyvūnų ląstelių aparatą. Tačiau gamtoje pasitaiko atvejų, kai svetima DNR (viruso ar bakteriofago) patenka į ląstelės genetinį aparatą ir, pasitelkdama savo metabolinius mechanizmus, ima sintetinti „savo“ baltymą. Mokslininkai ištyrė svetimos DNR įvedimo ypatybes ir naudojo jį kaip įvedimo principą genetinė medžiagaį narvą. Šis procesas vadinamas transfekcija.

  Jei vienaląsčiai organizmai ar daugialąsčių ląstelių kultūros yra modifikuojami, tai šiame etape prasideda klonavimas, tai yra tų organizmų ir jų palikuonių (klonų), kurie buvo modifikuoti, atranka. Kada nustatyta užduotis gauti daugialąsčiai organizmai, tuomet ląstelės su pakitusiu genotipu naudojamos vegetatyviniam augalų dauginimui arba įvedamos į surogatinės motinos blastocistas, kai kalbama apie gyvūnus. Dėl to jaunikliai gimsta su pakitusiu arba nepakitusiu genotipu, tarp kurių atrenkami ir kryžminami vieni su kitais tik tie, kuriems būdingi laukiami pokyčiai.

  Taikymas moksliniuose tyrimuose

  Nors ir nedideliu mastu, genų inžinerija jau naudojama tam, kad kai kurių nevaisingumo rūšių turinčioms moterims būtų suteikta galimybė pastoti. Šiuo tikslu naudojami sveikos moters kiaušiniai. Dėl to vaikas paveldi genotipą iš vieno tėvo ir dviejų motinų.

  Tačiau galimybė atlikti reikšmingesnius žmogaus genomo pokyčius susiduria su daugybe rimtų iššūkių. etinės problemos. 2016 m. Jungtinėse Amerikos Valstijose mokslininkų grupė gavo patvirtinimą klinikiniams vėžio gydymo metodo tyrimams, naudojant paties paciento imunines ląsteles, genetiškai modifikuotas naudojant CRISPR / Cas9 technologiją.

  Ląstelių inžinerija

  Ląstelių inžinerija remiasi augalų ir gyvūnų ląstelių bei audinių, galinčių gaminti žmogui reikalingas medžiagas už kūno ribų, auginimu. Šis metodas naudojamas vertingų augalų formų kloniniam (nelytiniam) dauginimui; gauti hibridines ląsteles, kuriose derinamos, pavyzdžiui, kraujo limfocitų ir naviko ląstelių savybės, todėl galima greitai gauti antikūnų.

  Genų inžinerija Rusijoje

  Pažymima, kad įvedus valstybinę GMO registraciją, veikla kai kurių visuomenines organizacijas ir pavieniai deputatai Valstybės Dūma bando užkirsti kelią naujoviškų biotechnologijų diegimui į Rusijos žemės ūkį. Daugiau nei 350 Rusijos mokslininkų pasirašė atvirą Mokslo darbuotojų draugijos laišką, kuriuo remia genų inžinerijos plėtrą m. Rusijos Federacija. IN atviras laiškas Pastebima, kad GMO draudimas Rusijoje ne tik pakenks sveikai konkurencijai žemės ūkio rinkoje, bet sukels didelį atsilikimą maisto gamybos technologijų srityje, padidins priklausomybę nuo maisto importo, pakenks Rusijos prestižui. būsena, kurioje politika yra novatoriška plėtra [fakto reikšmė? ] .

  Taip pat žr

  Pastabos

  1. Aleksandras Pančinas Mušti Dievą // Populiarioji mechanika. - 2017. - Nr. 3. - P. 32-35. - URL: http://www.popmech.ru/magazine/2017/173-issue/
  2. In vivo genomo redagavimas naudojant didelio efektyvumo TALEN sistemą(anglų kalba) . Gamta. Žiūrėta 2017 m. sausio 10 d.
  3. Elementai – mokslo naujienos: beždžionės, išgydytos nuo daltonizmo, naudojant genų terapiją (neapibrėžta) (2009 m. rugsėjo 18 d.). Žiūrėta 2017 m. sausio 10 d.

  Šiuolaikiniame pasaulyje sunku rasti žmogų, kuris nieko nebūtų girdėjęs apie genų inžinerijos sėkmes.
  
  Šiandien tai yra vienas perspektyviausių būdų plėtoti biotechnologijas, tobulinti žemės ūkio gamybą, mediciną ir daugybę kitų pramonės šakų.

  Kas yra genų inžinerija?

  Kaip žinoma, bet kurios gyvos būtybės paveldimos savybės yra užregistruotos kiekvienoje kūno ląstelėje genų rinkinio pavidalu - sudėtingų baltymų molekulių elementais. Įvedę svetimą geną į gyvos būtybės genomą, galite pakeisti susidariusio organizmo savybes ir dešinėje pusėje: kad pasėlis būtų atsparesnis šalčiui ir ligoms, suteiktų augalui naujų savybių ir kt.

  Dėl tokio pakeitimo gauti organizmai vadinami genetiškai modifikuotais arba transgeniniais ir mokslinė disciplina, užsiima modifikacijų tyrimais ir transgeninių technologijų plėtra – genetinė arba genų inžinerija.

  Genų inžinerijos objektai

  Dažniausi genų inžinerijos tyrimų objektai yra mikroorganizmai, augalų ląstelės ir žemesni gyvūnai, tačiau tiriamos ir žinduolių ląstelės, netgi žmogaus organizmo ląstelės. Paprastai tiesioginis tyrimo objektas yra DNR molekulė, išgryninta iš kitų ląstelių medžiagų. Fermentų pagalba DNR suskaidoma į atskiras sekcijas, todėl svarbu sugebėti atpažinti ir išskirti norimą atkarpą, pernešti ją fermentų pagalba ir integruoti į kitos DNR struktūrą.

  Šiuolaikinės technikos jau leidžia gana laisvai manipuliuoti genomo segmentais, daugintis reikalingas plotas paveldimą grandinę ir įterpkite ją vietoje kito nukleotido recipiento DNR. Sukaupta gana daug patirties ir surinkta nemažai informacijos apie sandaros dėsnius paveldimi mechanizmai. Paprastai žemės ūkio augalai transformuojasi, o tai jau leido žymiai padidinti pagrindinių maistinių kultūrų produktyvumą.

  Kodėl reikalinga genų inžinerija?

  Iki dvidešimtojo amžiaus vidurio tradiciniai metodai mokslininkams nebetinka, nes ši kryptis turi nemažai rimtų apribojimų:

  • neįmanoma kirsti nesusijusių gyvų būtybių rūšių;
  • genetinių požymių rekombinacijos procesas lieka nekontroliuojamas, ir reikalingos savybės atsiranda palikuoniuose dėl atsitiktinių derinių, o labai didelė dalis palikuonių laikomi nesėkmingais ir atmetami atrankos metu;
  • Kryžminant neįmanoma tiksliai nurodyti norimų savybių;
  • Veisimosi procesas trunka metus ir net dešimtmečius.

  
  
  Natūralus paveldimų savybių išsaugojimo mechanizmas yra itin stabilus, ir net norimų savybių palikuonių atsiradimas negarantuoja šių savybių išsaugojimo vėlesnėse kartose.

  Genų inžinerija leidžia mums įveikti visus minėtus sunkumus. Transgeninių technologijų pagalba galima sukurti nurodytų savybių organizmus pakeičiant atskiras genomo dalis kitomis, paimtomis iš kitoms rūšims priklausančių gyvų būtybių. Tuo pačiu metu žymiai sutrumpėja laikas, reikalingas naujiems organizmams sukurti. Nereikia prisegti būtini ženklai, todėl jas galima paveldėti, nes visada galima genetiškai modifikuoti kitas partijas, todėl procesas tiesiogine prasme įsibėgėja.

  Transgeninio organizmo sukūrimo etapai

  1. Izoliuoto geno išskyrimas su reikalingos savybės. Šiandien tam yra gana patikimų technologijų, yra net specialiai paruoštos genų bibliotekos.
  2. Geno įterpimas į vektorių perkėlimui. Tam sukuriamas specialus konstruktas – transgenas, turintis vieną ar daugiau DNR segmentų ir reguliavimo elementų, kuris įterpiamas į vektoriaus genomą ir klonuojamas naudojant ligazes bei restrikcijos fermentus. Paprastai kaip vektorius naudojama žiedinė bakterinė DNR – plazmidės.
  3. Vektoriaus įtraukimas į recipiento kūną. Šis procesas yra nukopijuotas iš panašaus natūralaus virusinės ar bakterinės DNR įterpimo į šeimininko ląsteles proceso ir veikia taip pat.
  4. Molekulinis klonavimas. Šiuo atveju modifikuota ląstelė sėkmingai dalijasi, gamindama daug naujų dukterinių ląstelių, kuriose yra modifikuotas genomas ir sintezuojamos tam tikrų savybių baltymų molekulės.
  5. GMO pasirinkimas. Paskutinis etapas niekuo nesiskiria nuo įprasto veisimo darbo.

  Ar genų inžinerija yra saugi?

  Klausimas, kiek saugios yra transgeninės technologijos, periodiškai keliamas tiek mokslo bendruomenėje, tiek nuo mokslo nutolusiose žiniasklaidos priemonėse. Vis dar nėra aiškaus atsakymo į tai.

  Pirma, genų inžinerija tebėra gana nauja biotechnologijų sritis, o statistika, leidžianti daryti objektyvias išvadas apie šią problemą, dar nėra sukaupta.

  Antra, didžiulės tarptautinių maisto korporacijų investicijos į genų inžineriją gali būti papildoma rimtų tyrimų stokos priežastis.
  
  
  Tačiau daugelio šalių teisės aktai įvedė reglamentus, įpareigojančius gamintojus nurodyti GMO produktų buvimą ant maisto grupės produktų pakuočių. Bet kuriuo atveju genų inžinerija jau įrodė aukštą savo technologijų efektyvumą ir jos tolesnė plėtražada žmonėms dar daugiau sėkmės ir laimėjimų.

  Įvadas

  Savo darbe gvildenu genų inžinerijos temą. Genų inžinerijos atvertos galimybės žmonijai tiek šioje srityje fundamentinis mokslas, ir daugelyje kitų sričių, yra labai dideli ir dažnai net revoliucingi.

  Taigi tai leidžia pramoninei masinei gamybai reikalingų baltymų, tai daug lengviau technologiniai procesai rūgimo produktams gauti – fermentams ir amino rūgštims, ateityje jis gali būti naudojamas augalų ir gyvūnų gerinimui, taip pat paveldimoms žmonių ligoms gydyti.

  Taigi genų inžinerija yra viena iš pagrindinių krypčių mokslo ir technologijų pažanga, aktyviai prisideda prie daugelio problemų, tokių kaip maisto, žemės ūkio, energetikos ir aplinkosaugos, sprendimo spartinimo.

  Bet ypač puikias galimybes Genų inžinerija atveria mediciną ir farmaciją, nes genų inžinerijos naudojimas gali sukelti radikalių medicinos transformacijų.

  1. Esmė genų inžinerija.

  1.1. Genų inžinerijos istorija.

  Genų inžinerija atsirado daugelio tyrinėtojų darbo dėka skirtingos pramonės šakos biochemija ir molekulinė genetika.

  Daugelį metų baltymai buvo laikomi pagrindine makromolekulių klase. Buvo net prielaida, kad genai yra baltyminio pobūdžio.

  Tik 1944 m. Avery, McLeod ir McCarthy parodė, kad DNR yra paveldimos informacijos nešėja.

  Nuo to laiko prasidėjo intensyvūs nukleorūgščių tyrimai. Po dešimtmečio, 1953 m., J. Watsonas ir F. Crickas sukūrė dvigrandės DNR modelį. Šie metai laikomi molekulinės biologijos gimimo metais.

  50-60-ųjų sandūroje genetinio kodo savybės buvo išaiškintos, o 60-ųjų pabaigoje jo universalumas buvo patvirtintas eksperimentiškai.

  Intensyviai vystėsi molekulinė genetika, kurios objektai buvo Escherichia coli (E. Coli), jos virusai ir plazmidės.

  Sukurti metodai, skirti išskirti labai išgrynintus nepažeistų DNR molekulių, plazmidžių ir virusų preparatus.

  Virusų ir plazmidžių DNR buvo įvesta į ląsteles biologiškai aktyvi forma, užtikrinant jo replikaciją ir atitinkamų genų ekspresiją.

  Aštuntajame dešimtmetyje buvo atrasta nemažai fermentų, kurie katalizuoja DNR konversijos reakcijas. Ypatingas vaidmuo kuriant genų inžinerijos metodus priklauso restrikcijos fermentai ir DNR ligazės.

  Genų inžinerijos raidos istoriją galima suskirstyti į tris etapus:

  Pirmasis etapas yra susijęs su pagrindinės galimybės gauti rekombinantines DNR molekules in vitro įrodymu. Šie darbai susiję su hibridų tarp skirtingų plazmidžių gamyba. Galimybė sukurti rekombinantines molekules naudojant originalias DNR molekules iš įvairių tipų ir bakterijų padermes, jų gyvybingumą, stabilumą ir funkcionavimą.

  Antrasis etapas yra susijęs su rekombinantinių DNR molekulių gavimo darbų pradžia chromosomų genai prokariotai ir įvairios plazmidės, jų stabilumo ir gyvybingumo įrodymai.

  Trečiasis etapas – eukariotinių genų, daugiausia gyvūnų, įtraukimo į vektorinės DNR molekules (DNR, naudojamos genams perduoti ir gali būti integruota į recipiento ląstelės genetinį aparatą) pradžia.

  Formaliai genų inžinerijos gimimo data turėtų būti laikoma 1972 m., kai Stanfordo universitete P. Bergas ir S. Cohenas su bendradarbiais sukūrė pirmąją rekombinantinę DNR, kurioje buvo SV40 viruso, bakteriofago ir E. coli DNR fragmentai.

  1.2. Genų inžinerijos samprata

  Viena didžiausių molekulinės genetikos ir molekulinės biologijos šakų praktinis pritaikymas, yra genų inžinerija.

  Genų inžinerija – tai metodų, leidžiančių perkelti genus iš vieno organizmo į kitą, visuma arba tai yra naujų biologinių objektų tikslinės statybos technologija.

  Gimusi 70-ųjų pradžioje, šiandien ji sulaukė didžiulės sėkmės. Genų inžinerijos metodai paverčia bakterijų, mielių ir žinduolių ląsteles į „fabrikus“, skirtus didelio masto bet kokių baltymų gamybai.

  Tai leidžia išsamiai išanalizuoti baltymų struktūrą ir funkcijas bei naudoti juos kaip vaistai.

  Šiuo metu Escherichia coli (E. coli) tapo tokių svarbių hormonų, kaip insulinas ir somatotropinas, tiekėja.

  Anksčiau insulinas buvo gaunamas iš gyvūnų kasos ląstelių, todėl jo kaina buvo labai didelė. Norint gauti 100 g kristalinio insulino, reikia 800-1000 kg kasos, o viena karvės liauka sveria 200-250 gramų. Dėl to insulinas buvo brangus ir sunkiai gaunamas. platus asortimentas diabetikams.

  Insulinas susideda iš dviejų polipeptidinių grandinių A ir B, kurių ilgis yra 20 ir 30 aminorūgščių. Kai juos sujungia disulfidiniai ryšiai, susidaro natūralus dvigubos grandinės insulinas.

  Įrodyta, kad jame nėra E. coli baltymų, endotoksinų ir kitų priemaišų, nesukelia šalutinio poveikio, kaip gyvulinis insulinas, ir nesiskiria nuo jo biologiniu aktyvumu.

  Somatotropinas yra žmogaus augimo hormonas, kurį išskiria hipofizė. Šio hormono trūkumas sukelia hipofizės nykštukumą. Jei somatotropinas skiriamas 10 mg 1 kg svorio tris kartus per savaitę, tai per metus vaikas, kenčiantis nuo jo trūkumo, gali augti 6 cm.

  Anksčiau jis buvo gautas iš lavoninės medžiagos, iš vieno lavono: 4–6 mg somatotropino galutiniame farmaciniame preparate. Taigi turimi hormono kiekiai buvo riboti, be to, šiuo metodu gautas hormonas buvo nevienalytis ir galėjo turėti lėtai augančių virusų.

  1980 m. Genentec kompanija sukūrė somatotropino gamybos naudojant bakterijas technologiją, kuri neturėjo šių trūkumų. 1982 metais Pasteur institute Prancūzijoje žmogaus augimo hormonas buvo gautas E. coli ir gyvūnų ląstelių kultūroje, o 1984 metais SSRS pradėta pramoninė insulino gamyba.

  1.3. Genų inžinerijos tikslai ir uždaviniai

  Taikomosios genų inžinerijos tikslas – suprojektuoti tokias rekombinantines DNR molekules, kurios, patekusios į genetinį aparatą, suteiktų organizmui žmogui naudingų savybių.

  Rekombinantinės DNR technologija paremta labai specifinių DNR zondų gamyba, kurių pagalba jie tiria genų raišką audiniuose, genų lokalizaciją chromosomose ir identifikuoja genus, kurie turi susijusias funkcijas(pavyzdžiui, žmonėms ir vištoms). DNR zondai taip pat naudojami diagnostikoje įvairios ligos.

  Rekombinantinės DNR technologija suteikė galimybę taikyti netradicinį baltymų ir genų metodą, vadinamą atvirkštine genetika. Taikant šį metodą, baltymas išskiriamas iš ląstelės, šio baltymo genas klonuojamas ir modifikuojamas, sukuriant mutantinį geną, koduojantį pakitusią baltymo formą. Gautas genas įvedamas į ląstelę. Tokiu būdu galima koreguoti sugedusius genus ir gydyti paveldimas ligas.

  Jei hibridinė DNR įvedama į apvaisintą kiaušialąstę, galima gauti transgeninių organizmų, kurie perduoda mutantinį geną savo palikuonims.

  Gyvūnų genetinė transformacija leidžia nustatyti atskirų genų ir jų baltymų produktų vaidmenį tiek reguliuojant kitų genų veiklą, tiek įvairiuose patologiniuose procesuose.

  Naudojama rekombinantinė DNR technologija sekančius metodus:

  ·specifinis DNR skilimas restrikcijos nukleazėmis, pagreitinant atskirų genų išskyrimą ir manipuliavimą;

  ·greitas visų nukleotidų sekos nustatymas išgrynintame DNR fragmente, leidžiantis nustatyti geno ir jo koduojamos aminorūgščių sekos ribas;

  ·rekombinantinės DNR konstravimas;

  ·nukleorūgščių hibridizacija, leidžianti tiksliau ir jautriau identifikuoti specifines RNR ar DNR sekas;

  DNR klonavimas: amplifikacija in vitro naudojant polimerazės grandininę reakciją arba DNR fragmento įvedimą į bakterijos ląstelę, kuri po tokios transformacijos atkuria šį fragmentą milijonais kopijų;

  ·Rekombinantinės DNR įvedimas į ląsteles ar organizmus.

  
  

  2.

  2.1. Genų, kuriuose yra, išskyrimas reikalinga informacija.

  Genus galima gauti keliais būdais: išskyrimu iš DNR, chemine-fermentine sinteze ir fermentine sinteze.

  Genų išskyrimas iš DNR vykdomas naudojant restrikcijos fermentus, kurie katalizuoja DNR skilimą srityse, kuriose yra tam tikros nukleotidų sekos (4–7 nukleotidų poros). Skaldymas gali būti atliekamas atpažįstamos nukleotidų porų srities viduryje; šiuo atveju abi DNR grandinės yra „nukirptos“ tame pačiame lygyje. Gauti DNR fragmentai turi vadinamuosius „bukus“ galus. DNR skilimas galimas su poslinkiu, kai viena iš grandinių išsikiša keliais nukleotidais. Šiuo atveju susidarę „lipnūs“ galai dėl savo papildomumo sąveikauja. Nukleotidų seka su lipniais galais gali būti prijungta prie vektoriaus (iš anksto apdoroto tuo pačiu restrikcijos fermentu) ir paversta žiedine seka, kai vienas kitą papildantys galai yra sujungti su ligazėmis. Metodas turi didelių trūkumų, nes gana sunku pasirinkti fermentų veikimą, kad būtų galima griežtai atskirti norimą geną. Kartu su genu užfiksuojami „papildomi“ nukleotidai arba, atvirkščiai, fermentai nupjauna dalį geno, paversdami jį funkciškai sugedusiu.

  Jei žinoma, naudojama cheminė-fermentinė sintezė pirminė struktūra baltymas arba peptidas, kurio sintezę koduoja genas. Būtina visiškai žinoti geno nukleotidų seką. Šis metodas leidžia tiksliai atkurti norimą nukleotidų seką, taip pat į genus įvesti restrikcijos fermentų atpažinimo vietas, reguliavimo sekas ir kt cheminė sintezė viengrandžių DNR fragmentų (oligonukleotidų) dėl laipsniško esterinių ryšių tarp nukleotidų susidarymo, dažniausiai 8–16 vienetų. Šiuo metu yra „genų mašinos“, kurios, valdomos mikroprocesoriaus, labai greitai sintezuoja specifines trumpas vienos grandinės DNR sekas.

  Norima bazių seka įvedama į klaviatūrą. Mikroprocesorius atidaro vožtuvus, per kuriuos, naudojant siurblį, į sintezės kolonėlę paeiliui tiekiami nukleotidai, taip pat reikalingi reagentai ir tirpikliai. Kolonėlė užpildyta silicio granulėmis, ant kurių surenkamos DNR molekulės. Šis prietaisas gali susintetinti iki 40 nukleotidų ilgio grandines 1 nukleotido greičiu per 30 minučių. Gauti oligonukleotidai tarpusavyje sujungiami naudojant DNR ligazę, kad susidarytų dvigrandė nukleotidas. Naudojant šis metodas buvo gauti insulino A ir B grandinių genai, proinsulinas, somatostatinas ir kt.

  Fermentinė genų sintezė, pagrįsta izoliuota pasiuntinio RNR (mRNR), šiuo metu yra labiausiai paplitęs metodas. Pirmiausia iš ląstelių išskiriamos pasiuntinio RNR, tarp kurių yra mRNR, užkoduota geno, kurį reikia išskirti. Tada patvirtintomis sąlygomis, naudojant atvirkštinę transkriptazę (revertazę), ant iš ląstelės išskirtos mRNR, kaip ant matricos, sintetinama DNR grandinė, komplementari su mRNR (cDNR). Gauta komplementari DNR (cDNR) yra antrosios DNR grandinės sintezės šablonas, naudojant DNR polimerazę arba atvirkštinę. Pradmuo šiuo atveju yra oligonukleotidas, papildantis mRNR 3’ galą; iš deoksinukleozidų trifosfatų, esant magnio jonams, susidaro nauja DNR grandinė.

  Metodas su didelė sėkmė panaudotas žmogaus augimo hormono (somatotropino) genui gauti 1979 m. Vienaip ar kitaip gautas genas turi informacijos apie baltymo struktūrą, bet negali jos įgyvendinti pats. Todėl geno veikimui kontroliuoti reikalingi papildomi mechanizmai. Genetinės informacijos perkėlimas į ląstelę recipientą atliekamas kaip vektoriaus dalis. Vektorius, kaip taisyklė, yra apskrita DNR molekulė, galinti savarankiškai replikuotis. Genas kartu su vektoriumi sudaro rekombinantinę DNR.

  2.2. Vektorių (virusų, plazmidžių), galinčių savarankiškai replikuotis ląstelėje recipientas, parinkimas.

  Terminas „vektorius“ reiškia nukleorūgšties molekulę, kuri, patekusi į ląstelę, gali savarankiškas egzistavimas dėl joje esančių replikacijos ir transkripcijos signalų.

  Vektorinės molekulės turi turėti šias savybes:

  1) gebėjimas savarankiškai replikuotis ląstelėje recipientas, tai yra būti nepriklausomu replikonu;

  Atsižvelgiant į eksperimento tikslus, vektoriai gali būti skirstomi į dvi grupes: 1) naudojami klonuoti ir amplifikuoti norimą geną; 2) specializuoti, naudojami įmontuotų svetimų genų ekspresijai. Antroji vektorių grupė jungia vektorius, skirtus klonuotų genų baltymų produktų sintezei užtikrinti. Ekspresijos vektoriuose yra DNR sekos, kurios būtinos klonuotų genų kopijų transkripcijai ir jų mRNR transliacijai ląstelių kamienuose.

  Plazmidės ir bakteriofagai naudojami kaip prokariotiniai vektoriai; Gyvūnų ir augalų virusai, vektoriai, kurių pagrindą sudaro 2 μm mielės ir mitochondrijos, ir daugybė dirbtinai sukonstruotų vektorių, galinčių daugintis tiek bakterinėse, tiek eukariotinėse ląstelėse (shuttle vektoriai), naudojami kaip eukariotų vektoriai.

  Plazmidės yra ekstrachromosominiai genetiniai pro- ir eukariotų elementai, kurie autonomiškai dauginasi ląstelėse. Dauguma plazmidinių vektorių yra gauti iš natūralių plazmidžių ColE1, pMB1 ir p15A.

  Bakterijų plazmidės skirstomos į dvi klases. Kai kurios plazmidės (pavyzdžiui, gerai ištirtas faktorius F, lemiantis lytį E. coli) pačios gali judėti iš ląstelės į ląstelę, o kitos tokio gebėjimo neturi. Dėl daugelio priežasčių, visų pirma siekiant užkirsti kelią nekontroliuojamam potencialiai pavojingos genetinės medžiagos plitimui, didžioji dauguma bakterinių plazmidžių vektorių yra pagrįsti antrosios klasės plazmidėmis. Daugelyje natūralių plazmidžių jau yra genų, lemiančių ląstelių atsparumą antibiotikams (šių genų produktai yra fermentai, modifikuojantys arba skaidantys antibiotines medžiagas). Be to, konstruojant vektorius į šias plazmides įvedami papildomi genai, lemiantys atsparumą kitiems antibiotikams.

  Fig. 1 paveiksle parodytas vienas iš labiausiai paplitusių E.coli plazmidės vektorių – pBR322. Jis sukonstruotas remiantis nuodugniai ištirta E.coli plazmide – kolicinogeniniu faktoriumi ColE1 – ir apima šios plazmidės replikacijos pradžią. ColE1 plazmidės (atitinkamai ir pBR322) ypatumas yra tas, kad esant baltymų sintezės inhibitoriui antibiotikui chloramfenikoliui (kuris netiesiogiai slopina šeimininko chromosomos replikaciją), jo skaičius E. coli padidėja nuo 20-50 iki 1000 molekulių. ląstelėje, todėl galima gauti didelius klonuoto geno kiekius. Konstruojant pBR322 vektorių iš pradinių plazmidžių, buvo pašalinta keletas „papildomų“ restrikcijos fermentų vietų.

  Šiuo metu, kartu su daugeliu patogių E. coli vektorių sistemų, plazmidiniai vektoriai buvo sukurti daugeliui kitų gramneigiamų bakterijų (įskaitant tokias pramoniniu požiūriu svarbias, kaip Pseudomonas, Rhizobium ir Azotobacter), gramteigiamų bakterijų (Bacillus), žemesnių bakterijų. grybai (mielės) ir augalai .

  Plazmidiniai vektoriai yra patogūs klonuoti santykinai mažus genomų fragmentus (iki 10 tūkst. bazinių porų) dideli dydžiai. Jei jums reikia įsigyti aukštesniųjų augalų ir gyvūnų genų biblioteką (arba biblioteką), bendras ilgis kurių genomas pasiekia milžiniškus dydžius, įprastiniai plazmidiniai vektoriai šiems tikslams netinka. Aukštesniųjų eukariotų genų bibliotekų kūrimo problema buvo išspręsta naudojant bakteriofago l darinius kaip klonavimo vektorius.

  Tarp fagų vektorių patogiausios sistemos buvo sukurtos remiantis bakteriofagų l ir M13 E. coli genomais. Šių fagų DNR yra išplėstų sričių, kurias galima ištrinti arba pakeisti svetima DNR, nepažeidžiant jų gebėjimo daugintis E. coli ląstelėse. Konstruojant vektorių šeimą, pagrįstą l fago DNR, daugelis restrikcijos vietų pirmiausia buvo pašalintos iš jos (padalijus trumpas DNR dalis) iš regiono, kuris nėra būtinas DNR replikacijai, ir tokios vietos buvo paliktos regione, skirtame DNR replikacijai. svetimos DNR įterpimas. Žymėjimo genai dažnai įterpiami į tą patį regioną, siekiant atskirti rekombinantinę DNR nuo pradinio vektoriaus. Tokie vektoriai plačiai naudojami „genų bibliotekoms“ generuoti. Pakeisto fago DNR fragmento ir atitinkamai įterptos svetimos DNR srities dydžiai ribojami iki 15-17 tūkstančių nukleotidų liekanų, nes rekombinantinis fago genomas yra 10% didesnis arba 75% mažesnis už laukinio l fago genomą. , nebegalima supakuoti į fago daleles.

  1 pav. Išsamus plazmidės pBR322 restrikcijos žemėlapis.

  Tokie apribojimai teoriškai neegzistuoja vektoriams, sukurtiems gijinio bakteriofago M13 pagrindu. Aprašyti atvejai, kai į šio fago genomą buvo įterpta apie 40 tūkstančių nukleotidų likučių ilgio svetima DNR. Tačiau žinoma, kad fagas M13 tampa nestabilus, kai svetimos DNR ilgis viršija 5 tūkstančius nukleotidų liekanų. Tiesą sakant, vektoriai, gauti iš M13 fago DNR, daugiausia naudojami genų sekos nustatymui ir mutagenezei, o į juos įterptų fragmentų dydžiai yra daug mažesni.

  Šie vektoriai yra sukonstruoti iš replikacinės (dvigrandės) fago M13 DNR formos, į kurią įkomponuotos „polilinkerio“ sritys (tokio dizaino pavyzdys parodytas 5 pav.). DNR yra įtraukta į fago dalelę kaip vienos grandinės molekulė. Taigi šis vektorius leidžia gauti klonuotą geną arba jo fragmentą tiek dvigrande, tiek viengrande forma. Viengrandės rekombinantinės DNR formos šiuo metu plačiai naudojamos nustatant DNR nukleotidų seką Sangerio metodu ir oligodeoksinukleotidais nukreiptai genų mutagenezei.

  Svetimų genų perkėlimas į gyvūnų ląsteles atliekamas naudojant vektorius, gautus iš daugelio gerai ištirtų gyvūnų virusų – SV40, kai kurių adenovirusų, galvijų papilomos viruso, raupų viruso ir kt. Šių vektorių konstravimas atliekamas pagal standartinę schemą: pašalinamos „papildomos“ restrikcijos fermentų vietos, įvedami žymenų genai į DNR sritis, kurios nėra būtinos jos replikacijai (pavyzdžiui, timidinkinazės (tk) genas). nuo HSV (herpes viruso)), reguliuojančių sričių įvedimas, genų ekspresijos lygio didinimas.

  Vadinamieji „šaudykliniai vektoriai“, galintys daugintis tiek gyvūnų, tiek bakterijų ląstelėse, pasirodė esą patogūs. Jie gaminami sujungiant didelius gyvūnų ir bakterijų vektorių segmentus (pavyzdžiui, SV40 ir pBR322), kad sritys, atsakingos už DNR replikaciją, liktų nepakitusios. Tai leidžia atlikti pagrindines vektoriaus sukūrimo bakterijų ląstelėje operacijas (tai techniškai daug paprastesnė), o vėliau panaudoti gautą rekombinantinę DNR klonuoti genus gyvūno ląstelėje.

  2 pav. M13 mp8 vektoriaus apribojimų žemėlapis.

  2.3. Rekombinantinės DNR paruošimas.

  Rekombinantinės DNR konstravimo esmė – DNR fragmentų, tarp kurių yra mus dominanti DNR sritis, integravimas į vadinamąsias vektorines DNR molekules (arba tiesiog vektorius) – plazmidinę arba virusinę DNR, kurios gali būti perkeltos į pro. - arba eukariotinės ląstelės ir ten autonomiškai dauginasi. Kitame etape atrenkamos ląstelės, turinčios rekombinantinę DNR (naudojant žymenų charakteristikas, kurias turi pats vektorius), o tada atskiri klonai su mus dominančiu DNR segmentu (naudojant konkrečiam genui būdingas charakteristikas arba zondus). arba DNR segmentas).

  Sprendžiant daugybę mokslinių ir biotechnologinių problemų, rekombinantinės DNR konstravimas taip pat reikalauja sukurti sistemas, užtikrinančias maksimalią klonuoto geno ekspresiją.

  Yra trys pagrindiniai būdai, kaip integruoti svetimą DNR į vektorių molekules. Pirmuoju atveju 3 colių DNR fragmentų galai, tarp kurių yra mus dominanti DNR sritis (genas arba jo segmentas, reguliavimo sritis), pratęsiami homopolinukleotidų seka (pavyzdžiui, poli(T)). naudojant galinį nukleotidilo transferazės fermentą. 3" galai yra linijinės formos vektoriaus DNR išplečiama tokiu pat būdu su jai komplementaria homopolinukleotidų seka (ty poli (A)). Tai leidžia sujungti dvi DNR molekules papildomai suporuojant dirbtinai pagamintus „lipnius“ galus.

  Antruoju atveju „lipnūs“ galai sukuriami vienai iš restrikcijos endonukleazių (restrikcijos fermentų) skaidant DNR molekules (tiek vektorių, tiek turinčias mus dominantį fragmentą). Restrikcijos fermentai pasižymi itin dideliu specifiškumu. Jie „atpažįsta“ kelių nukleotidų likučių DNR seką ir suardo jose griežtai apibrėžtas tarpnukleotidines jungtis. Todėl net didelėje DNR restrikcijos fermentai įveda ribotą skaičių pertraukų.

  Trečiasis būdas – pirmųjų dviejų derinys, kai restrikcijos fermento suformuoti lipnūs DNR galai pratęsiami sintetinėmis sekomis (3 pav.).

  DNR fragmentų galus galima paversti „lipniais“, pratęsiant juos dvigrandžiais oligonukleotidais („linkeriais“), kuriuose yra restrikcijos atpažinimo vieta.

  3 pav. Rekombinantinės DNR konstravimo schema naudojant PstI restrikcijos fermentus ir poli(G)-poli(C)-linkerį.

  zojus. Apdorojant tokį fragmentą su šiuo restrikcijos fermentu, jis tinkamas integruoti į vektorinę DNR molekulę, suskaidytą tuo pačiu restrikcijos fermentu. Dažnai polinukleotidų fragmentai naudojami kaip „linkeriai“, kuriuose yra specifinės vietos keliems restrikcijos fermentams vienu metu (jie vadinami „polilinkeriais“).

  Į vektorių įterpus svetimą DNR, jų kovalentinis kryžminis susiejimas atliekamas DNR ligaze. Jei tarpo dydis rekombinuotoje molekulėje viršija vieną fosfodiesterio jungtį, jis atstatomas in vitro naudojant DNR polimerazę arba in vivo naudojant ląstelių atstatymo sistemas.

  2.4. Rekombinantinės DNR įvedimas į recipiento ląstelę

  Rekombinantinės DNR perkėlimas atliekamas transformuojant arba konjuguojant. Transformacija yra pokyčių procesas genetinės savybės ląstelės dėl svetimos DNR prasiskverbimo į ją. Pirmą kartą pneumokokuose jį atrado F. Giffithas, kuris parodė, kad kai kurios nevirulentinių bakterijų padermių ląstelės, kai jos užkrečia peles kartu su virulentiškomis padermėmis, įgyja patogeninių savybių. Vėliau transformacija buvo įrodyta ir ištirta įvairiose bakterijų rūšyse. Nustatyta, kad tik kelios vadinamosios „kompetentingos“ ląstelės (galinčios įtraukti svetimą DNR ir susintetinti specialų transformuojantį baltymą) yra pajėgios transformuotis. Ląstelių kompetenciją taip pat lemia veiksniai išorinę aplinką. Tai galima palengvinti ląsteles apdorojant polietilenglikoliu arba kalcio chloridu. Po prasiskverbimo į ląstelę viena iš rekombinantinių DNR grandinių suyra, o kita dėl rekombinacijos su homologine recipiento DNR sritimi gali būti įtraukta į chromosomą arba ekstrachromosominį vienetą. Transformacija yra labiausiai universaliu būdu genetinės informacijos perdavimas ir yra labai svarbus genetinėms technologijoms.

  Konjugacija yra vienas iš keitimosi genetine medžiaga būdų, kurio metu genetinė informacija perduodama vienakrypčiu būdu iš donoro recipientui. Šį perkėlimą kontroliuoja specialios konjugacinės plazmidės (vaisingumo faktorius). Informacija iš donoro ląstelės į recipiento ląstelę perduodama per specialius lytinių organų gaurelius (pili). Taip pat galima perduoti informaciją naudojant nekonjugacines plazmides, dalyvaujant pagalbinėms plazmidėms. Viso viruso ar fago genų rinkinio perkėlimas, dėl kurio ląstelėje išsivysto fago dalelės, vadinamas transfekcija. Šis metodas, taikomas bakterijų ląstelėms, apima sferoplastų gavimą, inkubacinės terpės išgryninimą iš nukleazių ir išgrynintos fago DNR pridėjimą (protamino sulfato buvimas padidina transfekcijos efektyvumą). Metodas taikomas gyvūnų ir augalų ląstelėms naudojant specialius šaudyklinius virusinius vektorius.

  3.

  Taikant žmonėms, genų inžinerija galėtų būti naudojama paveldimų ligų gydymui. Tačiau techniškai yra didelis skirtumas tarp paties paciento gydymo ir jo palikuonių genomo keitimo.

  Užduotis pakeisti suaugusio žmogaus genomą yra šiek tiek sudėtingesnė nei veisti naujas genetiškai modifikuotas gyvūnų veisles, nes m. šiuo atveju reikia pakeisti daugelio jau susiformavusio organizmo ląstelių genomą, o ne tik vieną embriono kiaušinėlį. Norėdami tai padaryti, kaip vektorių siūloma naudoti virusines daleles. Virusinės dalelės gali prasiskverbti į didelę suaugusio žmogaus ląstelių dalį, įterpdamos į jas savo paveldimą informaciją; galimas kontroliuojamas viruso dalelių dauginimasis organizme. Tuo pačiu metu, siekdami sumažinti šalutinį poveikį, mokslininkai stengiasi išvengti genetiškai modifikuotos DNR patekimo į lytinių organų ląsteles, taip išvengiant poveikio būsimiems paciento palikuonims. Taip pat verta atkreipti dėmesį į reikšmingą šios technologijos kritiką žiniasklaidoje: genetiškai modifikuotų virusų vystymąsi daugelis suvokia kaip grėsmę visai žmonijai.

  Genų terapijos pagalba ateityje įmanoma pakeisti žmogaus genomą. Šiuo metu veiksmingi žmogaus genomo modifikavimo metodai yra kuriami ir bandomi su primatais. Ilgą laiką beždžionių genų inžinerija susidūrė su rimtais sunkumais, tačiau 2009 metais eksperimentus vainikavo sėkmė: žurnale Nature pasirodė publikacija sėkminga paraiška genetiškai modifikuoti virusiniai vektoriai, skirti suaugusiam beždžionės patinui išgydyti nuo daltonizmo. Tais pačiais metais pirmasis genetiškai modifikuotas primatas (išaugintas iš modifikuoto kiaušinio) susilaukė palikuonių – paprastosios marmozetės.

  Nors ir nedideliu mastu, genų inžinerija jau naudojama tam, kad kai kurių nevaisingumo rūšių turinčioms moterims būtų suteikta galimybė pastoti naudojant sveikos moters kiaušinėlius. Dėl to vaikas paveldi genotipą iš vieno tėvo ir dviejų motinų.

  Tačiau galimybė atlikti reikšmingesnius žmogaus genomo pokyčius susiduria su daug rimtų etinių problemų.

  Išvada

  Intensyviai plėtojant genų inžinerijos metodus, atsirado daugelio ribosomų, transportavimo ir 5S RNR, histonų, pelių, triušių, žmogaus globino, kolageno, ovalbumino, žmogaus insulino ir kitų peptidinių hormonų, žmogaus interferono ir kt. klonai. buvo gautas.

  Tai leido sukurti bakterijų padermes, kurios daug gamina biologiškai veikliosios medžiagos, naudojamas medicinoje, žemės ūkis ir mikrobiologinė pramonė.

  Remiantis genų inžinerija, atsirado farmacijos pramonės šaka, vadinama „DNR pramone“. Tai viena iš šiuolaikinių biotechnologijos šakų.

  Už medicininiam naudojimuižmogaus insulinas (humulinas), gautas naudojant recDNR, patvirtintas. Be to, remiantis daugybe jų tyrimo metu gautų atskirų genų mutantų, buvo sukurtos labai veiksmingos bandymų sistemos, leidžiančios nustatyti aplinkos veiksnių genetinį aktyvumą, įskaitant kancerogeninių junginių identifikavimą.

  
  

  NAUDOTOS NUORODOS:

  1) Bekish O.-Ya.L. Medicinos biologija. – Mn.: Urajai, 2000. – 114-119 p.

  2) Mutovinas G.R. Klinikinės genetikos pagrindai. – M.: absolventų mokykla, 1997. – p. 83-84.

  3) Kiškis R.S. Medicininės genetikos pagrindai. – Mn.: Aukštoji mokykla, 1998. – p. 60-65.

  4) biotechnolog.ru

  Planas:

  Įvadas.

  1.Genų inžinerijos esmė.

  1.1. Genų inžinerijos istorija

  1.2. Genų inžinerijos samprata

  1.3. Genų inžinerijos tikslai ir uždaviniai

  2. Organizmų kūrimo su genetiškai modifikuota programa etapai.

  2.1. Genų (natūralių arba sintetinių), turinčių reikiamą informaciją, išskyrimas.

  2.2. Vektorių (virusų, plazmidžių), galinčių savarankiškai replikuotis ląstelėje recipientas, parinkimas.

  2.3. Rekombinantinės DNR paruošimas.

  2.4. Rekombinantinės DNR įvedimas į recipiento ląstelę.

  3.Genų inžinerijos technologijų taikymas medicinoje.

  Genų inžinerija – tai metodų, technikų ir technologijų visuma, skirta genams išskirti iš ląstelių ar organizmo, gauti rekombinantinę RNR ir DNR, atlikti įvairias manipuliacijas genais, taip pat įterpti juos į kitus organizmus. Ši disciplina padeda įgyti norimas modifikuoto organizmo savybes.

  Mokslas in plačiąja prasme Genų inžinerija nėra, bet laikoma biotechnologine priemone. Jame naudojami moksliniai tyrimai, tokie kaip genetika ir molekulinė mikrobiologija.

  Sukurti genų inžinerijos metodai, susiję su paveldimumo valdymu, buvo vieni iš labiausiai šviesūs įvykiai mokslo raidoje.

  Mokslininkai, molekuliniai biologai ir biochemikai išmoko keisti, modifikuoti genus ir kurti visiškai naujus, derindami skirtingų organizmų genus. Jie taip pat išmoko sintetinti medžiagą pagal pateiktus modelius. Mokslininkai į organizmus pradėjo diegti dirbtinę medžiagą, priversdami juos dirbti. Visu šiuo darbu paremta genų inžinerija.

  Tačiau yra tam tikrų apribojimų " biologinė medžiaga». Ši problema mokslininkai bando ją išspręsti padedami ir Ekspertai pažymi, kad šis kelias yra gana perspektyvus. Per pastaruosius kelis dešimtmečius mokslininkai sukūrė metodus, kuriais tam tikros augalo ar augalų ląstelės gali būti priverstos vystytis ir daugintis nepriklausomai, atskirai nuo organizmo.

  Genų inžinerijos pasiekimai turi puiki vertė. naudojamas eksperimentuose, taip pat pramoninės gamybos tam tikros medžiagos, kurių negalima gauti naudojant bakterijų kultūras. Tačiau ir šioje srityje yra sunkumų. Pavyzdžiui, problema yra gyvūnų ląstelių gebėjimo dalytis trūkumas begalinis skaičius kaip tik

  Eksperimentų metu buvo padaryti esminiai atradimai. Taigi pirmą kartą buvo išvestas „chemiškai grynas“ izoliuotas genas. Vėliau mokslininkai atrado ligazę ir restrikcijos fermentus. Pastarųjų pagalba atsirado galimybė geną supjaustyti į gabalus – nukleotidus. O ligazių pagalba, atvirkščiai, galima sujungti, „sulipdyti“ šiuos gabalus, bet naujame derinyje, sukuriant, konstruojant kitokį geną.

  Mokslininkai taip pat padarė didelę pažangą biologinės informacijos „skaitymo“ procese. Daug metų amerikiečių ir anglų mokslininkai W. Gilbertas ir F. Sangeris iššifravo genuose esančius duomenis.

  Ekspertai pastebi, kad genų inžinerija neturėjo jokios įtakos per visą savo gyvavimo laikotarpį. neigiamas poveikis ant pačių tyrinėtojų, nepadarė žalos žmogui ir nepadarė žalos gamtai. Mokslininkai pažymi, kad pasiekti rezultatai tiek tiriant organizmų gyvybines funkcijas užtikrinančių mechanizmų funkcionavimą, tiek taikomojoje pramonėje jie labai įspūdingi. Tuo pačiu metu perspektyvos atrodo tikrai fantastiškos.

  Nepaisant didelės genetikos ir genų inžinerijos reikšmės žemės ūkyje ir medicinoje, pagrindiniai jos rezultatai dar nepasiekti.

  Mokslininkai susiduria su daugybe iššūkių. Būtina nustatyti ne tik kiekvieno geno funkcijas ir paskirtį, bet ir sąlygas, kuriomis jis aktyvuojamas, kokiais gyvenimo laikotarpiais, veikiant kokiems veiksniams, kokiose kūno dalyse jis įsijungia ir provokuoja. atitinkamo baltymo sintezė. Be to, svarbu išsiaiškinti šio baltymo vaidmenį organizmo gyvenime, kokias reakcijas jis sukelia, ar neperžengia ląstelių ribų ir kokią informaciją neša. Baltymų lankstymo problema yra gana sudėtinga. Šias ir daugelį kitų problemų sprendžia mokslininkai pagal genų inžineriją.

  Genų inžinerija ir šiuolaikinės biotechnologijos atsirado dėl mikrobiologijos, genetikos ir biochemijos raidos. Molekulinės biologijos, molekulinės genetikos, ląstelių biologijos pažanga, taip pat naujai atrasti eksperimentiniai metodai ir nauja įranga suteikė neįtikėtinus genų inžinerijos ir biotechnologijų vystymosi tempus.

  Genų inžinerijos tikslas

  Genų inžinerijos tikslas – pakeisti genų struktūrą, jų vietą chromosomoje ir reguliuoti jų veiklą pagal žmogaus poreikius. Norėdami pasiekti šį tikslą, naudokite įvairių metodų, leidžianti pramoniniu mastu gaminti baltymus, kurti naujas geriausiai reikalavimus atitinkančias augalų veisles ir gyvūnų veisles, diagnozuoti ir gydyti įvairias infekcines ir paveldimas žmonių ligas.

  Genų inžinerijos tyrimų objektai yra virusai, bakterijos, grybai, gyvūnai (taip pat ir žmogaus organizmas) ir augalų ląstelės. Išvalius šių gyvų būtybių DNR molekulę nuo kitų ląstelių medžiagų, tarp jų išnyksta materialūs skirtumai. Išgryninta DNR molekulė gali būti suskaidyta naudojant fermentus į specifinius segmentus, kurie vėliau gali būti sujungti naudojant kryžminius fermentus, jei reikia. Šiuolaikiniai metodai Genų inžinerija leidžia atkurti bet kurią DNR dalį arba pakeisti bet kurį nukleotidą DNR grandinėje kitu. Žinoma, šios sėkmės buvo pasiektos nuosekliai tiriant paveldimumo dėsnius.

  Genų inžinerija (genų inžinerija) atsirado atradus fermentus, kurie konkrečiai padalija materialinį paveldimumo pagrindą - DNR molekulę į segmentus ir sujungia šiuos segmentus galais vienas su kitu, taip pat elektroforezės metodą, kuris leidžia tai padaryti. labai tiksliai padalyti DNR segmentus išilgai. Metodų ir įrangos, skirtos specifinei nukleotidų, sudarančių DNR molekulę, sekai nustatyti, taip pat bet kurio pageidaujamo DNR segmento automatinei sintezei, sukūrimas užtikrino spartų genų inžinerijos vystymąsi.

  Mokslininkų norą kontroliuoti paveldimumą paskatino įrodymai, rodantys, kad visų augalų ir gyvūnų paveldimumo pagrindas yra DNR molekulė, kad bakterijos ir fagai taip pat paklūsta paveldimumo dėsniams, kad mutacijos procesas būdingas visoms gyvoms būtybėms. ir gali būti reguliuojamas eksperimentiniais metodais.

  Louisas Pasteris

  Didysis prancūzų mokslininkas Louis Pasteur, sukūręs klonų gavimo metodą, pirmasis parodė, kad bakterijos yra įvairios, turi paveldimumą ir jų savybės yra glaudžiai susijusios su pastarosiomis (1, 2 pav.).

  Twort ir D'Herrel

  1915 m. Twort ir D'Herrel įrodė, kad fagai (fagai yra virusai, besidauginantys bakterijose), spontaniškai besidauginantys bakterijų viduje, gali jas sunaikinti. Mikrobiologai dėjo viltis į fagų panaudojimą prieš pavojingas infekcines ligas sukeliančius mikrobus. Tačiau bakterijos yra atsparios fagams dėl spontaniškų mutacijų. Šių mutacijų paveldėjimas apsaugo bakterijas nuo fagų sunaikinimo.

  Daugindamiesi ląstelės viduje, virusai ir fagai gali ją sunaikinti arba, patekę į ląstelės genomą, pakeisti jos paveldimumą. Norint pakeisti organizmo paveldimumą, plačiai naudojami transformacijos ir transdukcijos procesai.

  Joshua ir Esther Lederberg

  1952 m. Joshua ir Esther Lederbergai, taikydami bakterijų kolonijų kopijavimo (replikacijos) metodą, įrodė spontaniškų bakterijų mutacijų egzistavimą (3 pav.). Jie sukūrė metodą mutantinėms ląstelėms izoliuoti naudojant replikaciją. Išorinės aplinkos įtakoje mutacijų dažnis didėja. Specialūs metodai leisti pamatyti plika akimi naujų padermių klonai, susidarę dėl mutacijų.

  Replikacijos metodas bakterijų kolonijos atliekama taip. Sterilizuotas aksominis audinys ištempiamas ant medinio prietaiso paviršiaus ir užtepamas ant Petri lėkštelės, skirtos replikoms persodinti, paviršiuje augančiai bakterijų kolonijai. Tada kolonijos perkeliamos į švarią Petri lėkštelę su dirbtine maistine terpe. Medžiaga iš svetainės

  Genų inžinerijos etapai

  Genų inžinerija atliekama keliais etapais.

  • Pagal jo funkciją identifikuojamas dominantis genas, tada jis išskiriamas, klonuojamas ir tiriama jo struktūra.
  • Išskirtas genas sujungiamas (rekombinuojamas) su kokio nors fago, transpozono ar plazmidės, turinčios galimybę rekombinuotis su chromosoma, DNR ir tokiu būdu sukuriamas vektorinis konstruktas.
  • Vektoriaus konstrukcija įterpiama į ląstelę (transformacija) ir gaunama transgeninė ląstelė.
  • Subrendusius organizmus galima gauti iš transgeninės ląstelės dirbtinėmis sąlygomis.