Topik: Aktivitas katalitik enzim dalam sel hidup

Target: mengenali fungsi katalitik protein dalam sel hidup, mengembangkan pengetahuan tentang peran enzim dalam sel, memantapkan kemampuan bekerja dengan mikroskop, melakukan eksperimen dan menjelaskan hasil kerjanya. Peralatan: kentang mentah dan rebus, daun elodea (tanaman lain), larutan hidrogen peroksida 3% segar, tabung reaksi, pinset, pasir, lesung dan alu, buku catatan, pena, pensil, penggaris.

Kemajuan pekerjaan:

Siapkan dua tabung reaksi, masukkan sedikit pasir pada tabung pertama, sepotong kentang mentah pada tabung kedua, dan sepotong kentang rebus pada tabung ketiga. Masukkan sedikit hidrogen peroksida ke dalam setiap tabung reaksi. Amati apa yang terjadi pada setiap tabung reaksi.

Giling sepotong kentang mentah dalam lesung dengan sejumlah kecil pasir.

Pindahkan kentang yang sudah dihancurkan bersama pasir ke dalam tabung reaksi dan masukkan sedikit hidrogen peroksida.

Bandingkan aktivitas jaringan tanaman yang dihancurkan dan seluruhnya.

Buatlah tabel yang menunjukkan aktivitas masing-masing jaringan pada perlakuan yang berbeda. Jelaskan hasil Anda. Jawab pertanyaannya:

Pengamatan

Hidrogen peroksida dan kentang mentah

Oksigen dilepaskan, protein terurai menjadi struktur primer dan berubah menjadi busa

Hidrogen peroksida dan kentang rebus

Tidak ada reaksi

Jawablah pertanyaan: Di tabung reaksi manakah aktivitas enzim katalase muncul? Jelaskan alasannya.

Katalase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi penguraian hidrogen peroksida menjadi air dan molekul oksigen: H2O2 + H2O2 = O2 + 2H2O. Peran biologis K. terdiri dari degradasi hidrogen peroksida yang terbentuk dalam sel sebagai hasil aksi sejumlah flavoprotein oksidase (xanthine oksidase, glukosa oksidase, monoamine oksidase, dll.), dan memberikan perlindungan efektif pada struktur seluler dari kehancuran di bawah pengaruh hidrogen peroksida. Defisiensi K. yang ditentukan secara genetik adalah salah satu penyebab dari apa yang disebut acatalasia, suatu penyakit keturunan yang secara klinis dimanifestasikan oleh ulserasi pada mukosa hidung dan rongga mulut, terkadang diucapkan perubahan atrofi pada septa alveolar dan kehilangan gigi. Aktivitas tersebut diwujudkan dalam 1,3 tabung reaksi, karena mereka berisi makanan mentah yang mengandung protein. Dan pada tabung reaksi yang tersisa terdapat produk yang proteinnya hancur selama proses pemasakan dan tidak terjadi reaksi. Sebab, tubuh lebih baik menyerap makanan yang mengandung protein.

Bagaimana aktivitas enzim memanifestasikan dirinya dalam jaringan hidup dan mati? Jelaskan fenomena yang diamati. Tidak ada aktivitas enzim pada jaringan mati, karena protein di dalamnya hancur saat dimasak. Dan dalam jaringan hidup, ketika berinteraksi dengan hidrogen peroksida, oksigen dilepaskan, dan protein, yang terurai menjadi struktur utamanya, berubah menjadi busa.

Bagaimana penggilingan jaringan mempengaruhi aktivitas enzim dalam jaringan hidup tumbuhan dan hewan? Ketika jaringan hidup digiling, reaksinya berlangsung lebih cepat, karena luas kontak antara protein dan hidrogen peroksida meningkat. Bagaimana Anda mengusulkan untuk mengukur laju penguraian hidrogen peroksida? v=kc(a)c(b) di mana v adalah laju reaksi kimia k adalah konstanta laju c adalah perubahan konsentrasi Apakah menurut Anda semua organisme hidup mengandung enzim katalase, yang menjamin penguraian hidrogen peroksida?

Benarkan jawaban Anda. Karena ini adalah enzim dari kelas oksidoreduktase, ia mengkatalisis penguraian hidrogen peroksida, yang beracun bagi sel hidup, menjadi air dan oksigen. Terkandung dalam lisosom. Kita dapat menyimpulkan bahwa itu terkandung di semua sel organisme hidup. Jelaskan pengamatan Anda. Nyatakan kesimpulan Anda.

Kesimpulan: protein hanya terdapat pada makanan hidup, dan pada makanan yang dimasak proteinnya dimusnahkan, sehingga tidak terjadi reaksi. Jika Anda menggiling produk, reaksinya akan berlangsung lebih cepat.

Penentuan aktivitas katalase

(menurut A.N. Bach dan A.I. Oparin)

Oksidoreduktase adalah kelas enzim yang mengkatalisis reaksi redoks. Oksidasi monomer yang terbentuk selama katabolisme polimer merupakan proses multi-tahap yang kompleks.

Oksidasi zat dalam sel terjadi terutama melalui penghilangan hidrogen (dehidrogenasi) atau penghilangan elektron atau dengan penambahan oksigen pada molekul senyawa yang teroksidasi.

Akseptor hidrogen pada dehidrogenase adalah NAD +, NADP, FAD dan FMN, pada beberapa flavin - oksigen (disebut oksidase), pada yang mengandung heme (peroksidase dan katalase) - H 2 O 2 (hidrogen peroksida).

Akseptor dan pembawa elektron adalah sitokrom yang mengandung heme (hemoprotein).

Katalase (EC 1.11.1.6) termasuk dalam hemoprotein, mengkatalisis proses penghancuran hidrogen peroksida, yang bersifat racun bagi sel, menjadi air dan oksigen: 2 H 2 O 2 = 2 H 2 O + O 2.

Bagi sel hidup, hidrogen peroksida merupakan racun yang kuat, oleh karena itu semua enzim yang membentuk dan menetralkan H 2 O 2 terletak di peroksisom - organel yang tertutup membran. Konsumen utama H 2 O 2 adalah peroksidase (EC 1.11.1.7.), yang mengoksidasi fenol, amina, beberapa senyawa heterosiklik dan substrat lainnya melalui dehidrogenasi, transfer substrat yang dihilangkan menjadi H 2 O 2, reduksi menjadi 2 H 2 O. Molekul hidrogen peroksida, yang tidak diklaim oleh peroksidase, dinetralkan oleh katalase.

Metode untuk menentukan aktivitas katalase didasarkan pada penentuan jumlah hidrogen peroksida yang terurai selama inkubasi dengan enzim. Jumlah H 2 O 2 dalam campuran reaksi ditentukan dengan titrasi dalam media asam dengan larutan dengan konsentrasi kalium permanganat 0,02 mol/l:

5 H 2 O 2 + 2KMnO 4 + 3H 2 SO 4 = 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + 5O 2 +8H 2 O

Berdasarkan persamaan reaksi di atas, dapat dihitung bahwa 1 ml larutan dengan konsentrasi kalium permanganat 0,02 mol/l setara dengan 1,7 mg (50 µmol) hidrogen peroksida.

KEMAJUAN KERJA. 2-3 g kentang mentah (atau bahan tanaman segar lainnya) digiling seluruhnya dalam lesung dengan pasir kuarsa atau kaca. Untuk mengurangi reaksi asam tambahkan CaCO 3 pada ujung pisau bedah sampai keluarnya gelembung CO 2 berhenti. Selama proses penggilingan, tambahkan 40-50 ml air dalam porsi kecil ke dalam mortar. Massa tanah dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu takar 100 ml, diberi air sampai tanda batas dan dicampur. Campuran didiamkan selama 10-15 menit dan setelah diaduk, disaring.

Ambil dua buah labu berbentuk kerucut dengan kapasitas 150-200 ml dan tambahkan 20 ml hasil filtrat ke dalamnya. Isi satu labu direbus selama 1 menit dan didinginkan sampai suhu kamar (kontrol). Labu percobaan lain mengandung enzim aktif. Tambahkan 20 ml air dan 3 ml larutan ke dalam isi labu uji dan labu kontrol. fraksi massa H 2 O 2 1%. Isinya tercampur rata dan dibiarkan pada suhu kamar selama 30 menit. Pada akhir inkubasi, ditambahkan 5 ml larutan dengan fraksi massa asam sulfat 10% ke dalam kedua labu, dicampur dan kelebihan H 2 O 2 pada setiap labu dititrasi dengan larutan dengan konsentrasi kalium permanganat 0,02 mol/l sampai terbentuk warna merah muda yang tidak hilang dalam waktu 1 menit.

Aktivitas katalase dinyatakan dalam mol hidrogen peroksida yang dipecah oleh enzim per 1 g bahan uji (atau per 1 mg ekstraknya) per 1 menit. Perhitungannya dilakukan sesuai rumus:

Di mana X– aktivitas katalase, E/g;

(a-b)– selisih volume larutan dengan konsentrasi kalium permanganat 0,02 mol/l, yang digunakan untuk titrasi kontrol (A) dan berpengalaman (B) sampel, ml;

T– titer larutan kalium permanganat yang digunakan untuk titrasi;

50 – faktor konversi per µmol H 2 O 2;

100 – total volume ekstrak yang disiapkan;

m – massa bahan yang diambil untuk dianalisis, g;

20 – volume filtrat yang diambil untuk analisis, ml;

30 – waktu inkubasi, min.

Prinsip penentuan, prosedur analisis, dan hasil analisis dicatat.

Aktivitas katalase juga dapat ditentukan oleh volume oksigen yang dilepaskan setelah penambahan H 2 O 2 pada benda uji.

Prinsip ini digunakan untuk menentukan aktivitas katalase dalam susu, yang dinyatakan dengan bilangan katalase, yaitu volume oksigen (ml) yang dilepaskan dalam 2 jam pada suhu 25°C dari 5 mg larutan dengan fraksi massa H 2 O. 2 1% ditambahkan ke 15 ml susu. Susu yang diperoleh dari hewan sehat melepaskan 0,7-2,5 ml oksigen, mis. Jumlah katalase susu alami tidak lebih dari 2,5. Susu yang diperoleh dari hewan yang sakit (mastitis, dll) dan kolostrum mengalami peningkatan jumlah katalase hingga mencapai 15.

REAGEN. air suling; kalsium karbonat (bubuk); larutan dengan konsentrasi kalium permanganat 0,02 mol/l; larutan dengan fraksi massa: hidrogen peroksida 1% (10 ml larutan dengan fraksi massa H 2 O 2 30% diencerkan dengan air hingga 300 ml), asam sulfat 10%.

PERTANYAAN UJI.

1. Jalur utama oksidasi substrat di dalam sel.

2. Karakteristik struktur dan kerja dehidrogenase yang bergantung pada NAD + - dan NADP.

3. Karakteristik struktur dan kerja dehidrogenase yang bergantung pada rumpon.

4. Enzim apa yang disebut oksidase? Kofaktor mereka.

5. Ciri-ciri struktur dan kerja peroksidase dan katalase.

6. Ciri-ciri struktur dan kerja sitokrom.

7. Kimia, pembentukan dan cara menetralkan hidrogen peroksida dalam sel.

8. Metode penentuan aktivitas katalase.

Enzim adalah katalis protein untuk reaksi biokimia, paling yang tanpa adanya enzim akan berjalan sangat lambat. Berbeda dengan katalis kimia setiap enzim hanya mampu mengkatalisis sejumlah kecil reaksi, seringkali hanya satu reaksi.

Jadi, enzim adalah katalis khusus reaksi. Hampir semua bio reaksi kimia dikatalisis oleh enzim.

Banyak enzim yang memilikinya tindakan katalitik pada substrat hanya dengan adanya senyawa organik bermolekul rendah termostabil tertentu - koenzim.

Dalam kasus seperti itu, holoenzim (secara katalitik kompleks aktif) terdiri dari apoenzim (bagian protein) dan koenzim terkait (Lampiran H). Koenzim dapat dihubungkan ke apoenzim melalui ikatan kovalen dan non-kovalen. Istilah "gugus prostetik" mengacu pada koenzim yang terikat secara kovalen. Reaksi yang memerlukan adanya koenzim antara lain: redoks, transfer gugus, isomerisasi, dan reaksi kondensasi (menurut sistem IUB termasuk kelas 1, 2, 5, 6). Reaksi pembelahan terjadi tanpa adanya koenzim (menurut sistem IUB, ini adalah kelas 3 dan 4).

^ 4.1 Pekerjaan laboratorium “Penentuan aktivitas amilase
malt menurut metode Wolgemut"

Metode Wolgemut didasarkan pada penentuan jumlah minimum enzim yang mampu menghidrolisis sempurna 1 ml larutan pati 0,1% dalam kondisi tertentu. Aktivitas amilase malt dinyatakan dengan jumlah mililiter larutan pati 0,1% yang dapat dihidrolisis oleh 1 ml ekstrak malt pada suhu 38°C selama 30 menit. Aktivitas amilase normal adalah antara 160 dan 320 unit aktivitas.

Metode Wohlgemuth banyak digunakan dalam praktik klinis untuk menentukan aktivitas amilase darah dan urin, dan dalam pembuatan bir untuk menentukan aktivitas amilase malt. Peningkatan tajam aktivitas amilase dalam darah dan urin (10-30 kali lipat) diamati pada pankreatitis akut dan tumor pankreas.

^ Bahan dan reagen: ekstrak dari gandum malt, diencerkan 10 kali; larutan pati 0,1%; Larutan yodium 0,1% dalam larutan kalium iodida 0,2%.

Peralatan: berdiri dengan tabung reaksi, pipet, penetes, termostat.

^ Kemajuan pekerjaan. 1 ml air suling dituangkan ke dalam sepuluh tabung reaksi. Tambahkan 1 ml ekstrak yang diencerkan 10 kali ke dalam tabung reaksi pertama, aduk, 1 ml campuran dipindahkan ke tabung reaksi kedua. Isi tabung reaksi ini dicampur kembali dan 1 ml dipindahkan ke tabung reaksi ketiga dan seterusnya sampai tabung reaksi kesepuluh. 1 ml diambil dari tabung reaksi terakhir dan dituang. Jadi, pada setiap tabung reaksi berikutnya kandungan enzimnya dua kali lebih sedikit dibandingkan tabung reaksi sebelumnya. Pengenceran ekstrak dalam sepuluh tabung reaksi adalah: 1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160; 1:320; 1:640; 1:1280; 1:2560; 1:5120; 1:10240.

Selanjutnya tambahkan 1 ml air dan 2 ml larutan kanji ke semua tabung reaksi, campur dan masukkan ke dalam termostat pada suhu 38°C selama 30 menit. Setelah inkubasi, dinginkan tabung reaksi dengan air keran untuk menghentikan kerja enzim, tambahkan dua tetes larutan yodium, kocok rata dan amati perubahan warnanya. Ketika bereaksi dengan yodium, cairan berubah menjadi kuning, merah muda dan ungu.

Setelah diperhatikan pada pengenceran berapa terjadi hidrolisis sempurna pati dengan kandungan enzim minimal (tabung reaksi yang isinya berwarna kekuningan), aktivitas amilase ekstrak dihitung dari banyaknya ekstrak murni (A) dalam tabung reaksi tersebut.
(Satu ml ekstrak memecah X ml larutan pati 0,1%).

Misalnya, kuning muncul pada tabung reaksi keempat, dimana ekstrak diencerkan 160 kali. Jumlah ekstrak ini mampu menghidrolisis 2 ml larutan pati 0,1%, dan 1 ml ekstrak murni dalam kondisi yang sama menghidrolisis 320 ml: X = 2 × 160/1. Oleh karena itu, aktivitas amilase adalah 320.

^ 4.2 Pekerjaan laboratorium “Penentuan aktivitas katalase

menurut Bach"

Metode ini didasarkan pada penentuan jumlah hidrogen peroksida yang tersisa setelah aksi katalase dengan mentitrasi larutan KMnO 4 ke dalamnya. Reaksi berlangsung sesuai dengan persamaan

1 ml larutan kalium permanganat 0,1 mol/l setara dengan 85 mg hidrogen peroksida.

^ Bahan dan reagen: persiapan katalase (1 g kecambah barley malt digiling dalam mortar porselen dengan 6 ml buffer fosfat dan disaring); larutan 10% H 2 SO 4; larutan hidrogen peroksida 0,1% dalam buffer fosfat, pH=7,0 (35,0 ml 0,2 mol/l NaH 2 PO 4 dalam 13,6 ml 0,2 mol/l NaH 2 PO 4); 0,1 mol/l larutan KMnO 4.

Peralatan: Labu 100 ml, pipet, buret, termostat.

^ Kemajuan pekerjaan. Masukkan 2 ml sediaan katalase ke dalam dua labu, tambahkan 1 ml larutan H2SO4 10% ke salah satunya (sampel), kemudian tuangkan 2 ml larutan hidrogen peroksida ke dalam masing-masing labu, masukkan ke dalam termostat selama 40 menit pada suhu 38°C . Setelah waktu inkubasi berlalu, 1 ml larutan H 2 SO 4 10% ditambahkan ke dalam labu kedua (kontrol) dan kedua larutan dititrasi dengan larutan KMnO 4 0,1 mol/L sampai muncul warna merah muda persisten karena kelebihan kalium. permanganat.

Aktivitas katalase ditentukan oleh jumlah hidrogen peroksida yang terurai (ml) dan dihitung dengan rumus:

,

Di mana
– perbedaan hasil titrasi sampel kontrol dan uji dengan larutan KMnO 4 0,001 N, ml;

Q – jumlah hidrogen peroksida (85 mg), sesuai
1 ml larutan 0,1 mol/l KMnO 4.

^ 4.3 Pekerjaan laboratorium “Metode jatuhkan
(menurut Klimovsky dan Rodzevich)"

Aktivitas amilolitik, terutama karena adanya α-amilase dalam sediaan, mencirikan kemampuan enzim untuk mengkatalisis hidrolisis pati menjadi produk yang tidak diwarnai dengan yodium. Jika α-amilase dan glukoamilase terdapat dalam sediaan, metode ini menentukan efek total semua enzim amilolitik.

Dalam metode ini, satuan aktivitas amilolitik diambil sebagai jumlah enzim yang mengkatalisis pemecahan 1 g pati larut menjadi produk yang tidak diwarnai dengan yodium dalam 1 jam pada suhu 30 ºC dalam kondisi yang ditentukan secara ketat. Aktivitas amilolitik AS dinyatakan dengan jumlah unit yang ditunjukkan per 1 g obat, kultur atau 1 cm 3 larutan. Nilai AC menunjukkan berapa gram pati yang dapat dihidrolisis menjadi senyawa tidak diwarnai yodium oleh 1 g obat, kultur atau 1 cm3 larutan dalam 1 jam pada kondisi penentuan. Penyelesaian reaksi dipantau secara visual menggunakan uji yodium.

Sensitivitas metode ini ditentukan jumlah minimum waktu di mana perubahan warna yodium dapat dideteksi secara visual. Diasumsikan bahwa kecepatannya reaksi enzimatik berbanding lurus dengan jumlah enzim yang digunakan dan tetap konstan selama 5 menit sampai 1 jam, yaitu reaksi mengikuti hukum reaksi orde nol. Selain itu, pengaruh nilai pH dan sifat kimia buffer dengan jumlah AC. Dengan buffer asetat (pH=4,7), nilai AC pada sediaan jamur rata-rata 1,5 kali lebih tinggi dibandingkan bila ditentukan dengan buffer fosfat (pH=6,0). Oleh karena itu, ketika menentukan nilai AC kultur jamur, disarankan untuk menggunakan buffer asetat.

Kerugian dari metode ini adalah ketidakjelasannya definisi visual akhir reaksi.

^ Bahan dan reagen: buffer asetat dengan pH=4,7 untuk enzim yang berasal dari jamur; buffer fosfat dengan pH=6,0 untuk enzim yang berasal dari bakteri; larutan kanji 1% (larutan kanji yang digunakan untuk analisis sediaan jamur harus memiliki pH = 4,7, untuk analisis sediaan bakteri - 6,0); larutan yodium. Untuk menyiapkan larutan basa yodium, 4,4 g kalium iodida, 1,4 g logam yodium ditimbang ke dalam gelas tar dengan penutup tanah, dan ditambahkan sekitar 2 cm 3 air suling. Gelas ditutup dengan penutup, isinya dicampur dan setelah yodium larut, larutan dipindahkan ke dalam labu takar 100 cm3 yang dilengkapi penutup tanah. Isi volumenya dengan air suling sampai tanda batas. Isi labu disimpan di tempat yang sejuk dan gelap. Larutan basa yodium dapat digunakan dalam waktu 30 hari sejak tanggal pembuatannya. Larutan yodium yang berfungsi dibuat dari larutan utama. Caranya, 20 cm 3 larutan basa yodium dituangkan ke dalam labu takar berkapasitas 100 cm 3, ditambahkan 4,4 g kalium iodida dan volume total larutan diatur menjadi 100 cm 3. Larutan kerja yodium dapat dikonsumsi dalam waktu enam hari setelah persiapannya.

Peralatan: tabung reaksi lebar, batang kaca, pipet, gelas kimia 50 ml, cawan petri, termostat.

^ Kemajuan pekerjaan. Untuk menentukan nilai AC, penting untuk memperhatikan kondisi reaksi dengan ketat. Untuk melakukan ini, semua larutan - substrat (larutan pati 1%), larutan enzim dan air suling harus dipanaskan terlebih dahulu hingga suhu 30°C.

Substrat sebanyak 25 cm 3 (12,5 ml) ditempatkan dalam tabung reaksi lebar yang dimasukkan batang kaca. 30 cm 3 (15 ml) ekstrak dan 30 cm 3 (15 ml) air dituangkan ke dalam tabung reaksi terpisah, ditempatkan dalam termostat dan disimpan pada suhu 30 ºС selama
10 menit.

Kemudian, dengan menggunakan pipet, tambahkan 1 hingga 25 cm 3 larutan enzim asli dan air secukupnya ke dalam larutan kanji dalam tabung reaksi lebar, tanpa mengeluarkan tabung reaksi dari termostat, sehingga total volume reaksi campurannya adalah 50 cm 3 . Jika ekstrak enzim tidak aktif, maka dapat ditambahkan hanya 25 cm 3 saja, dan tidak ditambahkan air sama sekali.

Isi tabung reaksi dicampur dengan tongkat dan dicatat dengan stopwatch saat ekstrak ditambahkan ke dalam larutan kanji. Setiap 60 detik, setetes sampel diambil dari tabung reaksi tanpa mengeluarkannya dari termostat. Setetes diteteskan di atas piring porselen putih, tetesan ini dikombinasikan dengan setetes larutan kerja yodium dan warnanya diamati. Reaksi pemecahan pati dianggap selesai bila yodium tidak lagi menghasilkan perubahan warna bila dikombinasikan dengan setetes larutan uji dalam 10 detik pertama. Perubahan warna terlihat jelas pada batas kontak antara dua tetes - yodium dan campuran reaksi.

Waktu yang diperlukan pati untuk terurai menjadi produk yang tidak diwarnai dengan yodium harus berkisar antara 10 hingga
20 menit.

Jika waktu hidrolisis kurang dari 10 menit, penentuan diulangi dengan menggunakan lebih sedikit ekstrak untuk hidrolisis dan lebih banyak air. Jika hidrolisis tidak selesai dalam waktu 20 menit, analisis juga diulangi, mengambil lebih banyak ekstrak enzim dan lebih sedikit air untuk penentuan. Banyaknya ekstrak enzim yang perlu diambil untuk dianalisis ulang dihitung dengan memperhatikan waktu hidrolisis yang diperoleh.

Jika enzim ekstraknya sedikit atau terlalu banyak aktivitas tinggi, dan banyaknya larutan enzim dari 1 sampai 25 cm 3 tidak menjamin lamanya hidrolisis pati selama 10...20 menit, maka untuk analisanya diambil bukan 25 cm 3 larutan pati, melainkan jumlah yang lebih besar atau lebih kecil, untuk Misalnya, 10 atau 40 cm 3, tambahkan perubahan yang sesuai rumus perhitungan(masing-masing 0,1 atau 0,4, bukan 0,25 seperti biasanya).

Nilai aktivitas amilolitik AS (satuan/g) dihitung dengan rumus:

Dimana 0,25 adalah banyaknya pati dalam 25 cm 3 larutan 1%, g;

60 – faktor konversi selama 1 jam;

N adalah jumlah enzim yang berpartisipasi dalam reaksi, g atau cm 3 (nilai ini ditentukan dengan mempertimbangkan konsentrasi ekstrak awal dan pengenceran selanjutnya);

T – waktu di mana pati dipecah menjadi produk yang tidak diwarnai dengan yodium, min.

Contoh. Ekstrak enzimatik dari kultur udara jamur diambil untuk dianalisis. Larutan stok dibuat dengan takaran 5 g kultur dalam 100 cm3 air buffer. Diketahui bahwa budaya ini sangat aktif, oleh karena itu dilakukan pengenceran tambahan dari larutan asli: 20 cm 3 dimasukkan ke dalam labu takar menjadi 50 cm 3 dengan air suling dan dari sana diambil 2 cm 3 untuk dianalisis, mis. Urutan pengenceran berikut diperoleh:

5 gram → 100 cm 3 → 20 cm 3 → 50 cm 3 → 2 cm 3.

Dibutuhkan waktu 12 menit untuk menghidrolisis 0,25 pati (25 cm 3 larutan pati 1%) dengan larutan enzim pengenceran terakhir (2 cm 3). Maka AC tanaman yang dikeringkan di udara (unit/g) adalah:

Saat menghitung ulang aktivitas enzimatik, seseorang harus memperhitungkan bukan bahan yang benar-benar kering dari sediaan enzim, tetapi dengan mempertimbangkan kelembabannya. Perhitungannya harus dilakukan dengan menggunakan rumus:

,

Dimana W adalah kadar air dari kultur atau sediaan.

^ 4.4 Pekerjaan laboratorium “Metode Willstetter
dan definisi Waldschmidt-Leitz tentang proteolitik
aktivitas enzim dalam modifikasi"

Metode ini didasarkan pada penentuan gugus karboksil bebas dalam larutan alkohol asam amino dan polipeptida.

Aktivitas (PA) dinyatakan dengan jumlah miligram nitrogen amina yang terbentuk selama hidrolisis sejumlah larutan gelatin 5% dengan nilai pH 7,3 hingga 7,5 1 g obat atau 1 cm 3 larutan enzim dalam 1 jam pada suhu 40 ºC.

Satuan aktivitas proteolitik diambil sebagai jumlah enzim yang menghasilkan 1 mg nitrogen amina dalam 1 jam pada kondisi percobaan yang diterima.

^ Bahan dan reagen: 96% etil alkohol; larutan timolftalein 1%; larutan NaOH 0,1 N; substrat – larutan gelatin 5%; ekstrak dari tanaman yang dianalisis.

Pembuatan ekstrak untuk mengetahui aktivitas proteolitik: sampel 0,25 g bahan tanaman ditempatkan dalam mortar porselen dan digiling selama 2,5 menit dengan 2,5 ml buffer fosfat (pH = 7,3), kemudian massa disaring.

Pembuatan larutan gelatin 5% (substrat): 5 g gelatin direndam terlebih dahulu dalam gelas kaca dalam 15...20 cm 3 air suling selama 20...30 menit. Protein yang membengkak dituangkan ke dalam 20...25 cm 3 larutan buffer pada suhu 70 hingga 80 ° C dan diaduk rata dengan batang kaca. Bagian yang terlarut dituangkan ke dalam labu ukur 100 cm 3, 20...25 cm 3 lagi larutan buffer ditambahkan ke bagian yang tidak larut, dan larutan yang dihasilkan dipindahkan kembali ke labu yang sama. Larutan gelatin yang didinginkan hingga suhu 40 °C ditepatkan dengan larutan buffer pada suhu yang sama. Larutan gelatin yang telah disiapkan disimpan dalam lemari es pada suhu 2 hingga 5 °C dan digunakan untuk analisis dalam waktu dua hari. Sebelum dianalisis, larutan gelatin dipanaskan hingga suhu 40 °C dalam penangas air.

Peralatan: labu berbentuk kerucut dengan volume 200 sampai 250 ml, labu takar dengan volume 50 ml, batang kaca, pipet, buret, termostat.

^ Kemajuan pekerjaan. Ke dalam 10 cm 3 larutan gelatin 5% dengan nilai pH 7,3 hingga 7,5, tambahkan 2 cm 3 larutan enzim uji dan segera ambil 1 cm 3 campuran reaksi ke dalam labu berbentuk kerucut dengan kapasitas 50 hingga 100 cm 3, dimana tuangkan 20 cm 3 96% etil alkohol dan 0,2 cm 3 1% timolftalein. Sampel dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N hingga muncul warna biru.

Sisa campuran gelatin dengan larutan enzim ditempatkan dalam termostat dengan suhu 40 ºC untuk hidrolisis. Setelah 3 jam, 1 cm 3 campuran reaksi dimasukkan ke dalam labu kedua dengan kapasitas 50 sampai 100 cm 3, ke dalamnya terlebih dahulu dituangkan 20 cm 3 etil alkohol 96% dan 0,2 cm 3 timolftalein 1%. Sampel dititrasi seperti pada varian kontrol.

Perhitungan aktivitas proteolitik PS dilakukan dengan menggunakan rumus:

,

Dimana A adalah jumlah nitrogen amina yang terakumulasi selama percobaan dari media reaksi, ml;

T – durasi proteolisis, h;

P adalah koefisien yang memperhitungkan pengenceran dan konversi menjadi 1 g obat atau 1 cm 3 larutan enzim cair.

Nilai A dihitung menggunakan rumus:

,

Dimana a adalah banyaknya larutan NaOH 0,1 N yang digunakan untuk titrasi 1 cm3 sampel percobaan, cm3;

Dan ke – sama untuk sampel kontrol;

1.4 – faktor konversi jumlah larutan alkali 0,1 N menjadi miligram nitrogen asam amino dan polipeptida;

K – koreksi titer alkali.

Pekerjaan laboratorium No.1

PERAN ENZIM DALAM PERCEPATAN REAKSI DALAM SEL

(DETEKSI AKTIVITAS KATALase)

Target: mendeteksi kerja enzim katalase pada sel tumbuhan dan hewan, membandingkan aktivitas enzimatik sel alami dan sel yang rusak akibat pemanasan.

Peralatan: larutan hidrogen peroksida 3%, potongan kentang mentah dan rebus serta daging (hati, paru-paru), tabung reaksi.

Deteksi aktivitas katalase

Katalase adalah enzim yang mengkatalisis penguraian hidrogen peroksida menjadi bentuk oksigen molekuler, dilepaskan dalam bentuk gelembung gas:

katalase

2 H 2 O 2 _ → 2H 2 O + O 2

Hidrogen peroksida diproduksi di beberapa sel tumbuhan dan hewan sebagai produk sampingan dari reaksi redoks. Senyawa ini beracun bagi sel, dan katalase memastikan pembuangannya secara efektif. Katalase adalah salah satu enzim yang bekerja paling cepat: satu molekul katalase menguraikan hingga 200.000 molekul hidrogen peroksida dalam satu detik. Katalase terlokalisasi dalam vesikel membran sel - badan mikro dan peroksisom.

Kemajuan pekerjaan

Ambil 4 tabung reaksi bersih dan masukkan sedikit kentang parut halus ke tabung pertama, kentang rebus ke tabung kedua, potongan daging (hati, paru-paru) yang dicincang halus ke tabung ketiga, dan sedikit cincang ke tabung keempat. daging rebus. Tambahkan 3-4 ml ke setiap tabung reaksi. larutan hidrogen peroksida 3%. Amati apa yang terjadi di dalam tabung reaksi. Catatlah hasil pengamatan pada tabel.

Aktivitas enzimatik sel alami dan rusak

Jelaskan hasil Anda. Buatlah kesimpulan tentang aktivitas katalitik katalase pada sel hidup dan sel mati.

Kesimpulan: ________

_______________

_______________

_____________

Pertanyaan keamanan:

1. Apa itu enzim? Struktur protein apa yang menciptakan aktivitasnya?___________

2. Sifat apa yang dimiliki enzim?______

3. Apa yang disebut pusat aktif enzim? Berapa banyak pusat seperti itu yang terdapat dalam suatu enzim?_

4. Bagaimana enzim mempercepat reaksi kimia?___________________________

5. *Alkohol, fenol, kloramin, dan antiseptik lainnya digunakan dalam pengobatan untuk merawat area tubuh yang terkontaminasi flora patogen. Jelaskan alasannya._____

Gr.___3

Pekerjaan laboratorium No.2

DETEKSI ZAT ORGANIK

Target: mengidentifikasi zat organik dalam jaringan (pati, protein, lemak) dan mempelajari sifat-sifatnya.

Peralatan: kantong kain kasa, butiran gandum giling (tepung terigu), larutan yodium 5%, biji bunga matahari (atau tanaman biji minyak lainnya: kapas, rami, kacang tanah, kedelai, dll.).

Senyawa organik– zat yang mengandung karbon, karakteristik satwa liar, rata-rata membentuk 20-30% massa sel organisme hidup. Sifat utama sel dan organisme ditentukan oleh polimer organik: protein, karbohidrat, asam nukleat, serta koneksi yang kompleks– lemak dan sejumlah molekul hormon, pigmen, nukleotida individu, khususnya ATP. Di samping itu bahan organik yang dikandung sel mineral dan air, namun kandungan zat organik selalu lebih tinggi. Jumlah bahan organik dapat bervariasi.

Protein – polimer tidak teratur, atau informasional, yang monomernya adalah asam amino.

Berdasarkan komposisinya, protein dibedakan menjadi:

- sederhana– hanya terdiri dari asam amino. Misalnya, protein nabati adalah prolamin, terkandung dalam gluten biji sereal dan tidak larut dalam air;

- kompleks– selain asam amino, mengandung senyawa organik lainnya (asam nukleat, lipid, karbohidrat), senyawa fosfor, dan logam. Oleh karena itu, mereka disebut: nukleoprotein, lipoprotein, glikoprotein, fosfo- dan metaloprotein.

Karbohidrat - senyawa yang mengandung karbon, hidrogen dan oksigen. Mereka dibagi menjadi mono-, di- dan polisakarida. Polisakarida adalah karbohidrat dengan berat molekul tinggi yang terdiri dari jumlah besar monosakarida, mereka berat molekul besar, molekulnya memiliki struktur linier atau bercabang. Secara fungsional, polisakarida dibedakan untuk tujuan cadangan dan struktural. Tidak larut dalam air pati– polisakarida cadangan utama sel tumbuhan(polimer ά - glukosa); ketika terkena yodium, warnanya menjadi biru; terkandung di dalamnya jumlah besar dalam umbi kentang, buah-buahan, biji-bijian. Glikogen- polisakarida yang ditemukan di jaringan tubuh manusia dan hewan, serta pada jamur dan ragi, - berperan peran penting dalam transformasi karbohidrat dalam sel. Serat (selulosa)– polisakarida struktural utama membran sel tanaman.

Lipid dan lipid– lemak dan zat mirip lemak – senyawa organik dengan struktur yang berbeda. Mereka tidak larut dalam air, tetapi larut dengan baik senyawa organik: eter, bensin, kloroform, dll.

Oleh struktur kimia lipid - senyawa gliserol - alkohol trihidrat - dengan asam organik dengan berat molekul tinggi (lemak), tidak memiliki struktur polimer.

Komposisi benih

(Menurut A.N. Bach dan A.I. Oparin)

Berbagai transformasi yang menjadi dasar fungsi vital tubuh terjadi dengan partisipasi katalis biologis - enzim, yang merupakan protein spesifik.

Berkat enzim, salah satu ciri luar biasa sel hidup terwujud - kemampuan untuk melakukan reaksi paling kompleks dengan sangat cepat waktu singkat dan pada suhu tubuh yang relatif rendah. Signifikansi biologis fenomena ini sangat luar biasa.

Untuk mempelajari kerja enzim, perlu diisolasi dari jaringan hidup. Biasanya, sumber yang kaya akan enzim ini dipilih untuk tujuan ini. Untuk mentransfer enzim ke dalam larutan, perlu dilakukan penghancuran membran sel, yang dilakukan dengan menggunakan homogenizer, penggilingan dalam lesung dan alu, pembekuan dan pencairan, autolisis, dll. Biasanya penghancuran membran sel dilakukan. pada suhu rendah, karena semua proses enzimatik terhenti di jaringan.

Kelompok enzim redoks termasuk enzim yang mengandung heme katalase, yang mengkatalisis reaksi penguraian hidrogen peroksida dengan pelepasan molekul oksigen:

2 H 2 O 2 -- > 2 H 2 O + O 2

Katalase ditemukan di sebagian besar jaringan organisme hidup.

Prinsip metode ini.

Hidrogen peroksida diurai oleh katalase. Kelebihan hidrogen peroksida dititrasi dengan kalium permanganat dalam media asam. Reaksinya akan datang menurut persamaan:

2 KMnO 4 + 5 H 2 O 2 + 3 H 2 SO 4 -- > 2 MnSO 4 + K 2 SO 4 + 8 H 2 O + 5 O 2

Dalam percobaan, jumlah sisa hidrogen peroksida yang tidak terurai ditentukan, dalam percobaan - jumlah keseluruhan diambil hidrogen peroksida (katalase dalam sampel kontrol dinonaktifkan dengan cara direbus).

Dengan mengurangkan hasil eksperimen dari hasil kontrol, kita mengetahui jumlah hidrogen peroksida yang dihancurkan dalam jangka waktu tertentu, yang memungkinkan kita untuk menilai aktivitas katalase.

Peralatan: 1. Buret lurus ukuran 50 dan 100 ml (masing-masing 1 buah)

2. Silinder 10 ml

3. Mortar dan alu

4. Labu berbentuk kerucut 200-250 ml (2 pcs.)

5. Timbangan teknis dengan beban

6. Pipet 10 ml “ekstrak enzim”

7. Pipet "H 2 SO 4"

8. Mandi air mendidih

9. Sekop

10. Labu takar 100 ml

11. Corong

12. Kertas saring

Bahan: 1. Bahan tanaman segar (wortel atau kentang)

2. larutan H 2 O 2 0,1 N

3. larutan KMnO4 0,1 N

4. larutan 10% H 2 SO 4

5. CaCO 3 (kristal)

6. Pasir kuarsa

Kemajuan pekerjaan:

2 g kentang mentah (atau wortel) digiling dengan pasir kuarsa dalam lesung, secara bertahap menambahkan 2-3 ml air. Untuk mengurangi reaksi asam, tambahkan kalsium karbonat pada ujung spatula hingga gelembung berhenti. karbon dioksida. Massa tanah dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu takar dan ditepatkan hingga 100 ml dengan air. Campuran didiamkan selama 30-60 menit, setelah itu disaring.

Dalam labu berbentuk kerucut 200 ml, ambil 25 ml larutan hidrogen peroksida 0,1 N dari buret dan tambahkan 20 ml ekstrak enzim dengan pipet. Setelah 30 menit, kerja enzim dihentikan dengan menambahkan 5 ml larutan asam sulfat 10% dan campuran dititrasi dengan larutan kalium permanganat 0,1 N (sampai terbentuk warna merah muda yang stabil selama kurang lebih 1 menit. ). Jumlah mililiter larutan kalium permanganat yang digunakan untuk mentitrasi sisa hidrogen peroksida dicatat.

Pada saat yang sama, kontrol diatur dengan pemanasan tidak aktif dalam penangas air mendidih selama 5 menit dengan larutan enzim (20 ml). Setelah pendinginan, 25 ml larutan hidrogen peroksida 0,1 N ditambahkan ke dalam larutan ini. Campuran didiamkan selama 30 menit, setelah itu ditambahkan 5 ml larutan asam sulfat 10% dan dititrasi dengan larutan kalium permanganat 0,1 N. Jumlah mililiter kalium permanganat yang digunakan untuk titrasi jumlah total hidrogen peroksida dicatat.

Dari perbedaan antara titrasi percobaan dan kontrol, ditemukan jumlah permanganat yang setara dengan jumlah hidrogen peroksida yang terurai. Menurut persamaan reaksi antara KMnO 4 dan H 2 O 2, 1 ml larutan 0,1 N kalium permanganat sama dengan 1,7 mg hidrogen peroksida.

Contoh perhitungan.

Ekstrak katalase 100 ml dibuat dari 1,25 g wortel. Titrasi sampel percobaan membutuhkan 15,5 ml, dan sampel kontrol - 30,2 ml larutan kalium permanganat 0,1 N. Jumlah hidrogen peroksida yang terurai dalam sampel setara dengan 30,2-15,5 = 14,7 ml larutan kalium permanganat 0,1 N dan, oleh karena itu, sama dengan 14,7 * 1,7 = 24,99 mg.

1 g wortel mentah mengandung sejumlah katalase yang mampu menguraikan (24,99*100)/(20*1,25)=99,96 mg hidrogen peroksida dalam 30 menit, dan 99,96/30=3,33 mg dalam 1 menit. Karena

1 mol hidrogen peroksida sama dengan 0,034 mg, maka dalam 1 g wortel terdapat 33,3/0,034 = 100 U katalase.

Pekerjaan laboratorium No.4

Pembuatan sukrase dari sel ragi. Kekhususan kerja enzim.

Semuanya berbeda transformasi kimia, yang menjadi dasar fungsi vital tubuh, terjadi dengan partisipasi katalis biologis - enzim, yang merupakan protein spesifik.

Berkat enzim, salah satu ciri luar biasa sel hidup terwujud - kemampuan untuk melakukan reaksi kompleks dalam waktu yang sangat singkat dan pada suhu tubuh yang relatif rendah.

Ilmu yang mempelajari tentang sifat-sifat enzim, kondisi kerjanya, penentuan kandungan enzim di berbagai organ dan jaringan nilai yang besar Untuk pemahaman yang benar proses yang kompleks aktivitas vital tubuh.

Salah satu properti yang paling penting enzim adalah kekhususan tindakan mereka dalam kaitannya dengan substrat tertentu. Kekhususan sifat katalitik enzim dimanifestasikan dalam kenyataan bahwa enzim, pada umumnya, hanya bekerja pada zat tertentu. Spesifisitas enzim yang ketat juga ditunjukkan oleh fakta bahwa dalam kasus stereoisomerisme, enzim tertentu mengkatalisis pembelahan hanya satu stereoisomer. Kekhususan enzim adalah yang paling penting properti biologis, yang tanpanya metabolisme yang teratur tidak mungkin terjadi.

Karya ini mengkaji proses pembelahan substrat – sukrosa oleh enzim sukrase dan pemecahan pati oleh enzim – amilase, yang terdapat pada air liur manusia.

Ekstraksi sukrase dari sel ragi

Bahan dan reagen:

· Ragi yang ditekan – 10 g

Homogenizer (mortir dan alu)

· Pasir kuarsa

· Air sulingan

Kemajuan pekerjaan

Masukkan 10 gram ragi kering ke dalam lesung, tambahkan 10 ml air suling dan homogenkan dalam lesung porselen dengan sedikit demi sedikit. pasir kuarsa untuk menghancurkan dinding sel. Kemudian letakkan mortar porselen bersama homogenat dalam lemari pengering pada suhu 60 0 C selama 30-40 menit.

Setelah waktu yang ditentukan, keluarkan mortar, dinginkan, tambahkan 30 ml air suling dan giling isi mortar hingga halus.

Kemudian homogenisasi, untuk mengendapkan massa sel, disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang dihasilkan adalah ekstrak sukrase.