Konu: Canlı hücrelerdeki enzimlerin katalitik aktivitesi

Hedef: tanımlamak katalitik fonksiyon canlı hücrelerdeki proteinler, hücrelerdeki enzimlerin rolü hakkında bilgi geliştirir, mikroskopla çalışma yeteneğini pekiştirir, deney yapar ve çalışmanın sonuçlarını açıklar. Teçhizat:çiğ ve haşlanmış patates, elodea yaprağı (başka bir bitki), taze %3 hidrojen peroksit çözeltisi, test tüpleri, cımbız, kum, havan ve havan tokmağı, defter, kalem, kurşun kalem, cetvel.

İlerlemek:

İki test tüpü hazırlayın ve birincisine biraz kum, ikincisine bir parça çiğ patates, üçüncüsüne bir parça haşlanmış patates koyun. Her bir test tüpüne biraz hidrojen peroksit damlatın. Her test tüpünde neler olduğunu gözlemleyin.

Bir parça çiğ patatesi havanda öğütün. küçük bir miktar kum.

Ezilmiş patatesleri kumla birlikte bir test tüpüne aktarın ve içine biraz hidrojen peroksit damlatın.

Ezilmiş ve bütün bitki dokusunun aktivitesini karşılaştırın.

Her dokunun farklı tedaviler altındaki aktivitesini gösteren bir tablo yapın. Sonuçlarınızı açıklayın. Soruları cevapla:

Gözlemler

Hidrojen peroksit ve çiğ patates

Oksijen açığa çıkar, protein parçalanır Birincil yapı ve köpüğe dönüşüyor

Hidrojen peroksit ve haşlanmış patates

Tepki yok

Soruları cevaplayın: Katalaz enziminin aktivitesi hangi test tüplerinde ortaya çıktı? Sebebini açıkla.

Katalaz, hidrojen peroksitin suya ve moleküler oksijene ayrışmasını katalize eden bir enzimdir: H2O2 + H2O2 = O2 + 2H2O. Biyolojik rol K., bir dizi flavoprotein oksidazın (ksantin oksidaz, glikoz oksidaz, monoamin oksidaz, vb.) Etkisi sonucu hücrelerde oluşan hidrojen peroksitin parçalanmasından ve hücresel yapıların etki altında tahribattan etkili bir şekilde korunmasından oluşur. hidrojen peroksit. Genetik olarak belirlenmiş K. eksikliği, klinik olarak burun mukozasının ülserasyonuyla ortaya çıkan kalıtsal bir hastalık olan akatalazi adı verilen hastalığın nedenlerinden biridir ve ağız boşluğu bazen alveolar septada belirgin atrofik değişiklikler ve diş kaybı. Etkinlik 1.3 test tüpünde kendini gösterdi çünkü protein içeren çiğ yiyecekler içeriyorlardı. Geri kalan test tüplerinde ise pişirme işlemi sırasında proteini yok edilen ve reaksiyon oluşmayan ürünler vardı. Bu nedenle vücut, protein içeren gıdaları daha iyi emer.

Enzim aktivitesi canlı ve ölü dokularda kendini nasıl gösterir? Gözlenen olguyu açıklayın. Ölü dokularda enzim aktivitesi yoktur çünkü pişirme sırasında içlerindeki protein yok edildi. Ve canlı dokularda hidrojen peroksit ile etkileşime girdiğinde oksijen açığa çıktı ve protein birincil yapısına parçalanarak köpüğe dönüştü.

Doku öğütme, bitki ve hayvanların canlı dokularındaki enzim aktivitesini nasıl etkiler? Canlı dokuyu öğütürken reaksiyon daha hızlı ilerler çünkü protein ile hidrojen peroksit arasındaki temas alanı artar. Hidrojen peroksitin ayrışma hızını nasıl ölçmeyi önerirsiniz? v=kc(a)c(b) burada v kimyasal reaksiyonun hızıdır k hız sabitidir c konsantrasyondaki değişimdir Sizce tüm canlı organizmalar hidrojen peroksitin parçalanmasını sağlayan katalaz enzimini içerir mi?

Cevabınızı gerekçelendirin. Oksidoredüktaz sınıfına ait bir enzim olduğundan canlı hücreler için toksik olan hidrojen peroksitin su ve oksijene ayrışmasını katalize eder. Lizozomlarda bulunur. Canlı organizmaların tüm hücrelerinde bulunduğu sonucuna varabiliriz. Gözlemlerinizi açıklayın. Sonucunuzu belirtin.

Sonuç: Protein sadece canlı besinlerde bulunur ve pişmiş besinlerde protein yok edilir, dolayısıyla bunlarla herhangi bir reaksiyon oluşmaz. Ürünleri öğütürseniz reaksiyon daha hızlı ilerleyecektir.

Katalaz aktivitesinin belirlenmesi

(A.N. Bach ve A.I. Oparin'e göre)

Oksidoredüktazlar redoks reaksiyonlarını katalize eden bir enzim sınıfıdır. Polimerlerin katabolizması sırasında oluşan monomerlerin oksidasyonu karmaşık, çok aşamalı bir işlemdir.

Hücrelerdeki maddelerin oksidasyonu esas olarak hidrojenin uzaklaştırılması (dehidrojenasyon) veya elektronların uzaklaştırılması veya oksitlenmiş bileşiğin molekülüne oksijen eklenmesi yoluyla meydana gelir.

Dehidrojenazlardaki hidrojen alıcıları NAD +, NADP, FAD ve FMN'dir, bazı flavinlerde - oksijen (bunlara oksidazlar denir), hem içerenlerde (peroksidazlar ve katalazlar) - H202'dir (hidrojen peroksit).

Elektron alıcıları ve taşıyıcıları hem içeren sitokromlardır (hemoproteinler).

Katalaz (EC 1.11.1.6) hemoproteinlere aittir, hücreler için toksik olan hidrojen peroksitin su ve oksijene yok edilmesi sürecini katalize eder: 2 H 2 O 2 = 2 H 2 O + O 2.

Canlı bir hücre için hidrojen peroksit güçlü bir zehirdir, bu nedenle H2O2'yi oluşturan ve nötralize eden tüm enzimler, zarla kaplı organeller olan peroksizomlarda bulunur. H 2 O 2'nin ana tüketicileri fenolleri, aminleri ve bazı kimyasalları oksitleyen peroksidazlardır (EC 1.11.1.7.). heterosiklik bileşikler ve diğer substratlar dehidrojenasyon yoluyla, substratlardan çıkarılanları H202'ye aktararak onu 2 H20'ya azaltır. Peroksidazlar tarafından talep edilmeyen hidrojen peroksit molekülleri, katalaz ile nötralize edilir.

Katalaz aktivitesini belirleme yöntemi, enzimle inkübasyon sırasında parçalanan hidrojen peroksit miktarının belirlenmesine dayanmaktadır. Reaksiyon karışımındaki H202 miktarı, asidik bir ortamda 0,02 mol/1 potasyum permanganat konsantrasyonuna sahip bir çözelti ile titrasyon yoluyla belirlenir:

5 H 2 O 2 + 2KMnO 4 + 3H 2 SO 4 = 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + 5O 2 +8H 2 O

Yukarıdaki reaksiyon denklemine dayanarak, potasyum permanganat konsantrasyonu 0,02 mol/1 olan 1 ml çözeltinin 1,7 mg (50 µmol) hidrojen peroksite karşılık geldiği hesaplanabilir.

İLERLEMEK. 2-3 g çiğ patates (veya diğer taze bitki materyali), kuvars kumu veya cam içeren bir havanda iyice öğütülür. Azaltmak için asit reaksiyonu CO2 kabarcıklarının salınımı duruncaya kadar neşterin ucuna CaCO3 ekleyin. Öğütme işlemi sırasında harca küçük porsiyonlar halinde 40-50 ml su ilave edilir. Öğütülmüş kütle niceliksel olarak 100 ml'lik balon jojeye aktarılır, su ile işarete kadar ayarlanır ve karıştırılır. Karışım 10-15 dakika bekletilir ve karıştırıldıktan sonra süzülür.

150-200 ml kapasiteli iki konik şişe alın ve elde edilen süzüntünün 20 ml'sini bunlara ekleyin. Bir şişenin içeriği 1 dakika kaynatılır ve oda sıcaklığına kadar soğutulur (kontrol). Başka bir deney şişesi aktif bir enzim içerir. Test ve kontrol şişelerinin içeriğine 20 ml su ve 3 ml solüsyon ekleyin. kütle kesri H202 %1. İçerikler iyice karıştırılır ve 30 dakika oda sıcaklığında bırakılır. İnkübasyonun sonunda, her iki şişeye de kütle fraksiyonu% 10 olan sülfürik asit içeren 5 ml çözelti eklenir, karıştırılır ve her bir şişedeki fazla H202, potasyum permanganat konsantrasyonu 0.02 olan bir çözelti ile titre edilir. 1 dakika içinde kaybolmayan pembe bir renk oluşuncaya kadar mol/l.

Katalaz aktivitesi, 1 g test materyali (veya ondan alınan 1 mg ekstrakt) başına 1 dakikada enzim tarafından parçalanan µmol hidrojen peroksit cinsinden ifade edilir. Hesaplama aşağıdaki formüle göre yapılır:

Nerede X– katalaz aktivitesi, E/g;

(a-b)- kontrolün titrasyonu için kullanılan, potasyum permanganat konsantrasyonu 0,02 mol/l olan bir çözeltinin hacimleri arasındaki fark (A) ve deneyimli (B) numuneler, mi;

T– titrasyon için kullanılan potasyum permanganat çözeltisinin titresi;

50 – µmol H2O2 başına dönüşüm faktörü;

100 – hazırlanan ekstraktın toplam hacmi;

m – analiz için alınan malzemenin kütlesi, g;

20 – analiz için alınan filtratın hacmi, ml;

30 – kuluçka süresi, dk.

Belirleme prensibi, analiz prosedürü ve analiz sonucu kaydedilir.

Katalaz aktivitesi ayrıca test nesnesine H202 eklendikten sonra açığa çıkan oksijenin hacmiyle de belirlenebilir.

Bu prensip, H2O kütle fraksiyonuna sahip 5 mg'lık bir çözeltiden 25 ° C'de 2 saat içinde salınan oksijenin (ml) hacmi olan katalaz sayısıyla ifade edilen sütteki katalazın aktivitesini belirlemek için kullanılır. 15 ml süte %2 1 eklenir. Sağlıklı hayvanlardan elde edilen süt, 0,7-2,5 ml oksijen açığa çıkarır; Doğal sütün katalaz sayısı 2,5'u geçmez. Hasta hayvanlardan (mastitis vb.) ve kolostrumdan elde edilen sütlerde katalaz sayısı artarak 15'e kadar çıkmıştır.

REAKTİFLER. Arıtılmış su; kalsiyum karbonat (toz); potasyum permanganat konsantrasyonu 0,02 mol/1 olan çözelti; kütle fraksiyonlu çözeltiler:% 1 hidrojen peroksit (% 30 H202 kütle fraksiyonuna sahip 10 ml çözelti, 300 ml'ye kadar su ile seyreltilir),% 10 sülfürik asit.

KONTROL SORULARI.

1. Hücredeki substratların oksidasyonunun ana yolları.

2. NAD + - ve NADP'ye bağımlı dehidrojenazların yapısının ve etkisinin özellikleri.

3. FAD'a bağlı dehidrojenazların yapısının ve etkisinin özellikleri.

4. Hangi enzimlere oksidaz denir? Onların kofaktörleri.

5. Peroksidaz ve katalazların yapı ve etki özellikleri.

6. Sitokromların yapısının ve etkisinin özellikleri.

7. Hücrelerdeki hidrojen peroksitin kimyası, oluşumu ve nötralizasyon yolları.

8. Katalaz aktivitesini belirleme yöntemi.

Enzimler biyokimyasal reaksiyonların protein katalizörleridir. çoğu enzimin yokluğunda son derece yavaş ilerleyecektir. Farklı kimyasal katalizörler Her enzim yalnızca çok az sayıda reaksiyonu, çoğunlukla da yalnızca bir reaksiyonu katalize etme kapasitesine sahiptir.

Dolayısıyla enzimler reaksiyona özgü katalizörlerdir. Neredeyse tamamı biyo kimyasal reaksiyonlar enzimler tarafından katalize edilir.

Birçok enzim var katalitik etki substratlar üzerinde yalnızca belirli bir termostabil düşük moleküllü organik bileşiğin (bir koenzim) varlığında.

Bu gibi durumlarda holoenzim (katalitik olarak aktif kompleks) bir apoenzim (protein kısmı) ve ilişkili bir koenzimden oluşur (Ek H). Bir koenzim, bir apoenzime kovalent ve kovalent olmayan bağlarla bağlanabilir. "Protez grup" terimi, kovalent olarak bağlı bir koenzimi ifade eder. Bir koenzimin varlığını gerektiren reaksiyonlar şunları içerir: redoks, grup transferi, izomerizasyon ve yoğunlaşma reaksiyonları (IUB sistemine göre bunlar sınıf 1, 2, 5, 6'dır). Bölünme reaksiyonları koenzimlerin yokluğunda meydana gelir (IUB sistemine göre bunlar sınıf 3 ve 4'tür).

^ 4.1 Laboratuvar çalışması “Amilaz aktivitesinin belirlenmesi
Wolgemut yöntemine göre malt"

Wolgemuth'un yöntemi, belirli koşullar altında 1 ml %0,1'lik nişasta çözeltisini tamamen hidrolize edebilen minimum enzim miktarının belirlenmesine dayanmaktadır. Maltın amilaz aktivitesi, 38 °C sıcaklıkta 30 dakika boyunca 1 ml malt ekstraktı ile hidrolize edilebilen %0,1'lik nişasta çözeltisinin mililitre sayısıyla ifade edilir. Normal amilaz aktivitesi 160 ila 320 aktivite birimi arasındadır.

Wohlgemuth yöntemi, klinik uygulamada kan ve idrarın amilaz aktivitesini belirlemek için ve bira yapımında maltın amilaz aktivitesini belirlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Akut pankreatit ve pankreas tümörlerinde kan ve idrardaki amilaz aktivitesinde keskin bir artış (10-30 kat) gözlenir.

^ Malzemeler ve reaktifler: 10 kez seyreltilmiş tahıl maltından ekstrakt; %0,1 nişasta çözeltisi; %0,2'lik potasyum iyodür çözeltisi içinde %0,1'lik iyot çözeltisi.

Teçhizat: test tüpleri, pipetler, damlalıklar, termostat ile stand.

^ İşin ilerlemesi. On adet test tüpü 1 ml damıtılmış su ile doldurulur. Birinci test tüpüne 10 kez seyreltilmiş ekstrakttan 1 ml eklenir, karıştırılır, karışımın 1 ml'si ikinci test tüpüne aktarılır. Bu deney tüpünün içeriği tekrar karıştırılarak üçüncü deney tüpüne 1 ml aktarılır ve bu şekilde onuncu deney tüpüne kadar devam edilir. Son deney tüpünden 1 ml alınarak boşaltılır. Böylece, sonraki her test tüpünde enzim içeriği bir öncekine göre iki kat daha azdır. Ekstraktın on test tüpündeki seyreltilmesi: 1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160; 1:320; 1:640; 1:1280; 1:2560; 1:5120; 1:10240.

Daha sonra tüm test tüplerine 1 ml su ve 2 ml nişasta çözeltisi ekleyin, karıştırın ve belirli bir sıcaklıktaki bir termostata yerleştirin. 38 °C'de 30 dakika süreyle. İnkübasyondan sonra, enzimin etkisini durdurmak için test tüplerini musluk suyuyla soğutun, iki damla iyot çözeltisi ekleyin, iyice çalkalayın ve renk değişimini gözlemleyin. İyot ile reaksiyona girdiğinde sıvı sarı, pembe ve mora döner.

Minimum enzim içeriğine sahip nişastanın tam hidrolizinin hangi seyreltide gerçekleştiğini not ettikten sonra (içeriği sarımsı renkte olan bir test tüpü), ekstraktın amilaz aktivitesi, bu test tüpündeki seyreltilmemiş ekstraktın (A) miktarından hesaplanır.
(Bir ml ekstrakt, X ml %0,1 nişasta çözeltisini parçalar).

Örneğin, sarı ekstraktın 160 kez seyreltildiği dördüncü test tüpünde ortaya çıktı. Bu miktardaki ekstrakt, 2 ml %0,1'lik nişasta çözeltisini hidrolize etme kapasitesine sahiptir ve aynı koşullar altında 1 ml seyreltilmemiş ekstrakt, 320 ml'yi hidrolize eder: X = 2 × 160/1. Bu nedenle amilaz aktivitesi 320'dir.

^ 4.2 Laboratuvar çalışması “Katalaz aktivitesinin belirlenmesi

Bach'a göre"

Yöntem, katalazın etki etmesinden sonra kalan hidrojen peroksit miktarının, üzerine bir KMnO4 çözeltisinin titre edilmesiyle belirlenmesine dayanmaktadır. Reaksiyon denkleme göre ilerler

1 ml 0,1 mol/l potasyum permanganat çözeltisi 85 mg hidrojen peroksite karşılık gelir.

^ Malzemeler ve reaktifler: katalaz preparatı (1 g arpa maltı filizi, 6 ml fosfat tamponu içeren bir porselen havanda öğütülür ve süzülür); %10 H2S04 çözeltisi; fosfat tamponunda %0,1 hidrojen peroksit çözeltisi, pH=7,0 (13,6 ml 0,2 mol/1 NaH2P04 içinde 35,0 ml 0,2 mol/1 NaH2P04); 0,1 mol/l KMnO4 çözeltisi.

Teçhizat: 100 ml'lik şişeler, pipetler, büretler, termostat.

^ İşin ilerlemesi.İki şişeye 2 ml katalaz preparatı ekleyin, bunlardan birine (numune) 1 ml %10 H2SO4 çözeltisi ekleyin, ardından her bir şişeye 2 ml hidrojen peroksit çözeltisi dökün, 38 °C'de 40 dakika boyunca bir termostata yerleştirin. . İnkübasyon süresi geçtikten sonra, ikinci şişeye (kontrol) 1 ml %10 H2S04 çözeltisi eklenir ve her iki çözelti, fazla potasyumdan kalıcı pembe bir renk görünene kadar 0,1 mol/L KMnO4 çözeltisi ile titre edilir. permanganat.

Katalaz aktivitesi, ayrışan hidrojen peroksit miktarına (ml) göre belirlenir ve aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır:

,

Nerede
– kontrol ve test numunelerinin 0,001 N KMnO4 çözeltisi, ml ile titrasyon sonuçlarındaki fark;

Q – karşılık gelen hidrojen peroksit miktarı (85 mg)
1 ml 0,1 mol/l KMnO4 çözeltisi.

^ 4.3 Laboratuvar çalışması “Damla yöntemi
(Klimovsky ve Rodzevich'e göre)"

Amilolitik aktivite, esas olarak preparasyonda a-amilazın varlığına bağlı olarak, enzimin, nişastanın iyotla lekelenmeyen ürünlere hidrolizini katalize etme yeteneğini karakterize eder. Preparatta α-amilaz ve glukoamilaz mevcutsa bu yöntem, tüm amilolitik enzimlerin toplam etkisini belirler.

Bu yöntemde amilolitik aktivite birimi, 1 g çözünür nişastanın, kesin olarak tanımlanmış koşullar altında 30 ºC sıcaklıkta 1 saat içinde iyotla lekelenmeyen ürünlere parçalanmasını katalize eden enzim miktarı olarak alınır. AS'nin amilolitik aktivitesi, 1 g ilaç, kültür veya 1 cm3 çözelti başına belirtilen birim sayısıyla ifade edilir. AC değeri, belirleme koşulları altında 1 saat içinde 1 g ilaç, kültür veya 1 cm3 çözelti ile kaç gram nişastanın iyotla lekelenmemiş bileşiklere hidrolize edilebileceğini gösterir. Reaksiyonun tamamlanması bir iyot testi kullanılarak görsel olarak izlenir.

Yöntemin duyarlılığı belirlenir minimum miktarİyot renginde bir değişikliğin görsel olarak tespit edilebildiği süre. Hız olduğu varsayılıyor enzimatik reaksiyon kullanılan enzim miktarıyla doğru orantılıdır ve 5 dakika ile 1 saat arasında sabit kalır, yani reaksiyon sıfırıncı derece reaksiyon yasasına uyar. Ayrıca pH değerinin etkisi ve kimyasal doğa AC miktarına göre tampon. Asetat tamponu (pH=4,7) ile mantar preparatlarındaki AC değeri, fosfat tamponu (pH=6,0) ile belirlenenden ortalama 1,5 kat daha yüksektir. Bu nedenle mantar kültürlerinin AC değeri belirlenirken asetat tamponunun kullanılması tavsiye edilir.

Yöntemin dezavantajı belirsizliktir. görsel çözünürlüklü reaksiyonun sonu.

^ Malzemeler ve reaktifler: mantar kökenli enzimler için pH=4,7 olan asetat tamponu; bakteri kökenli enzimler için pH=6,0 olan fosfat tamponu; %1 nişasta çözeltisi (mantar preparatlarının analizi için kullanılan nişasta çözeltisinin pH = 4,7 olması gerekir, bakteriyel preparatların analizi için - 6,0); iyot çözeltileri. Bazik bir iyot çözeltisi hazırlamak için, 4,4 g potasyum iyodür, 1,4 g metalik iyot, darası alınmış kapaklı bir cam içine tartılır ve yaklaşık 2 cm3 damıtılmış su eklenir. Cam bir kapakla kapatılır, içindekiler karıştırılır ve iyot çözüldükten sonra çözelti, öğütülmüş tıpalı 100 cm3'lük hacimsel bir şişeye aktarılır. Hacmi işarete kadar damıtılmış suyla doldurun. Şişenin içeriği serin ve karanlık bir yerde saklanır. Bazik iyot çözeltisi hazırlandığı tarihten itibaren 30 gün içerisinde kullanılabilir. Ana çözeltiden çalışan bir iyot çözeltisi hazırlanır. Bunu yapmak için, 100 cm3 kapasiteli hacimsel bir şişeye 20 cm3 bazik iyot çözeltisi dökülür, 4,4 g potasyum iyodür eklenir ve çözeltinin toplam hacmi 100 cm3'e ayarlanır. İyot çalışma çözeltisi hazırlandıktan sonraki altı gün içinde tüketilebilir.

Teçhizat: geniş test tüpleri, cam çubuklar, pipetler, 50 ml'lik beherler, Petri kapları, termostat.

^ İşin ilerlemesi. AC değerini belirlemek için reaksiyon koşullarına kesinlikle uymak önemlidir. Bunu yapmak için, tüm çözeltiler - substrat (% 1 nişasta çözeltisi), enzim çözeltisi ve damıtılmış su önce 30 ° C sıcaklığa ısıtılmalıdır.

25 cm3 (12,5 mi) miktarındaki substrat, içine bir cam çubuğun yerleştirildiği geniş bir test tüpüne yerleştirilir. 30 cm3 (15 ml) ekstrakt ve 30 cm3 (15 ml) su ayrı test tüplerine dökülür, bir termostata yerleştirilir ve 30 ºС sıcaklıkta tutulur.
10 dakika.

Daha sonra, pipetler kullanarak, test tüplerini termostattan çıkarmadan, geniş bir test tüpü içindeki nişasta çözeltisine 1 ila 25 cm3 orijinal enzim çözeltisini ve karşılık gelen miktarda suyu ekleyin, böylece reaksiyonun toplam hacmi eşitlenir. Karışım 50 cm3'tür. Enzim ekstraktı aktif değilse, sadece 25 cm3 ekleyebilir ve hiç su eklemeyebilirsiniz.

Test tüpünün içeriği bir çubukla karıştırılır ve ekstraktın nişasta çözeltisine eklendiği süre bir kronometre ile not edilir. Her 60 saniyede bir, termostattan çıkarılmadan test tüpünden bir damla numune alınır. Beyaz porselen bir tabağa bir damla damlatılır, bu damla bir damla iyot çalışma solüsyonu ile birleştirilir ve renk gözlemlenir. İyot, ilk 10 saniye içinde bir damla test çözeltisiyle birleştirildiğinde artık bir renk değişikliği oluşturmadığında, nişasta parçalama reaksiyonunun tamamlanmış olduğu kabul edilir. Renk değişimi, iki damla (iyot ve reaksiyon karışımı) arasındaki temas sınırında açıkça görülebilir.

Nişastanın iyotla lekelenmeyen ürünlere parçalanması için gereken süre 10 ile 10 arasında olmalıdır.
20 dakika.

Hidroliz süresi 10 dakikadan az ise, hidroliz için daha az ekstrakt kullanılarak belirleme tekrarlanır ve daha fazla su. Hidroliz 20 dakika içinde tamamlanmazsa, analiz için daha fazla enzim ekstraktı ve daha az su alınarak analiz tekrarlanır. Tekrar analiz için alınması gereken enzim ekstraktı miktarı, elde edilen hidroliz süresi dikkate alınarak hesaplanır.

Enzim ekstraktında az veya çok fazla varsa yüksek aktivite ve 1 ila 25 cm3 arasındaki enzim çözeltisi miktarı, 10...20 dakika boyunca nişasta hidrolizinin süresini garanti etmez, daha sonra analiz için 25 cm3 nişasta çözeltisi değil, daha büyük veya daha küçük bir miktar alırlar. örneğin 10 veya 40 cm3, karşılık gelen değişiklik eklenerek hesaplama formülü(normal 0,25 yerine sırasıyla 0,1 veya 0,4).

AS'nin amilolitik aktivitesinin değeri (birim/g) aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır:

Burada 0,25, %1'lik çözeltinin 25 cm3'ünde bulunan nişasta miktarıdır, g;

60 – 1 saatlik dönüşüm faktörü;

N, reaksiyona katılan enzim miktarıdır, g veya cm3 (bu değer, ilk ekstraktın konsantrasyonu ve sonraki seyreltme dikkate alınarak belirlenir);

T – nişastanın iyotla lekelenmeyen ürünlere parçalandığı süre, min.

Örnek. Analiz için mantarın hava kültürünün enzimatik bir özü alındı. Stok çözelti 100 cm3 tamponlu su içerisinde 5 g kültür oranında hazırlandı. biliniyor ki bu kültürçok aktiftir, bu nedenle orijinal çözeltinin ek bir seyreltmesi yapıldı: 20 cm3 hacimsel bir şişede damıtılmış su ile 50 cm3'e getirildi ve oradan analiz için 2 cm3 alındı, yani. Aşağıdaki seyreltme sırası elde edildi:

5 g → 100 cm3 → 20 cm3 → 50 cm3 → 2 cm3.

0.25 nişastanın (%1 nişasta çözeltisinin 25 cm3'ü) son seyreltmenin enzim çözeltisiyle (2 cm3) hidrolize edilmesi 12 dakika sürdü. Bu durumda havayla kurutulmuş mahsulün AC'si (birim/g) şöyle olacaktır:

Enzimatik aktiviteyi yeniden hesaplarken, enzim preparatının kesinlikle kuru maddesini değil, nemi hesaba katmak gerekir. Hesaplama aşağıdaki formül kullanılarak yapılmalıdır:

,

Burada W, kültürün veya preparatın nem içeriğidir.

^ 4.4 Laboratuvar çalışması “Willstetter yöntemi
ve Waldschmidt-Leitz proteolitik tanımı
modifikasyonda enzim aktivitesi"

Yöntem, amino asitlerin ve polipeptitlerin alkol çözeltilerindeki serbest karboksil gruplarının belirlenmesine dayanmaktadır.

Aktivite (PA), pH değeri 7,3 ila 7,5 1 g ilaç veya 1 cm3 enzim çözeltisi olan belirli bir miktarda% 5 jelatin çözeltisinin hidrolizi sırasında oluşan amin nitrojenin miligram sayısıyla ifade edilir. 40 ºC sıcaklıkta 1 saat.

Bir birim proteolitik aktivite, kabul edilen deney koşulları altında 1 saatte 1 mg amin nitrojen üreten enzim miktarı olarak alınır.

^ Malzemeler ve reaktifler: %96 etil alkol; %1 timolftalein çözeltisi; 0,1 N NaOH çözeltisi; substrat – %5 jelatin çözeltisi; Analiz edilen bitkiden ekstrakt.

Proteolitik aktiviteyi belirlemek için bir ekstraktın hazırlanması: 0,25 g bitki materyali numunesi bir porselen havana yerleştirilir ve 2,5 ml fosfat tamponu (pH = 7,3) ile 2,5 dakika öğütülür, ardından kütle süzülür.

%5 jelatin çözeltisinin (substrat) hazırlanması: 5 g jelatin, bir cam kap içinde 15...20 cm3 damıtılmış su içinde 20...30 dakika önceden ıslatılır. Şişmiş protein, 70 ila 80 ° C sıcaklıkta 20...25 cm3 tampon çözeltisine dökülür ve bir cam çubukla iyice karıştırılır. Çözünmüş kısım 100 cm3'lük hacimsel bir şişeye dökülür, çözünmemiş kısma 20...25 cm3 daha tampon çözeltisi eklenir ve elde edilen çözelti tekrar aynı şişeye aktarılır. 40 °C'ye soğutulmuş bir jelatin çözeltisi, aynı sıcaklıktaki bir tampon çözeltisi ile işarete getirilir. Hazırlanan jelatin solüsyonu buzdolabında 2 ila 5°C sıcaklıkta saklanır ve iki gün içerisinde analiz için kullanılır. Analizden önce jelatin çözeltisi bir su banyosunda 40°C sıcaklığa ısıtılır.

Teçhizat: 200 ila 250 ml hacimli konik şişeler, 50 ml hacimli baloncuklar, cam çubuklar, pipetler, büretler, termostat.

^ İşin ilerlemesi. PH değeri 7,3 ila 7,5 olan 10 cm3'lük %5 jelatin çözeltisine, 2 cm3 test enzimi çözeltisi ekleyin ve reaksiyon karışımının 1 cm3'ünü hemen 50 ila 100 ml kapasiteli konik bir şişeye alın. cm3, 20 cm3 dökün %96 etil alkol ve 0,2 cm3 %1 timolftalein. Numune, mavi renk oluşana kadar 0,1 N NaOH çözeltisi ile titre edilir.

Enzim çözeltisiyle birlikte kalan jelatin karışımı, hidroliz için 40 ºC sıcaklıktaki bir termostata yerleştirilir. 3 saat sonra reaksiyon karışımının 1 cm3'ü, 50 ila 100 cm3 kapasiteli ikinci bir şişeye alınır ve içine ilk olarak 20 cm3 %96 etil alkol ve 0,2 cm3 %1 timolftalein dökülür. Numune, kontrol varyantında olduğu gibi titre edilir.

PS'nin proteolitik aktivitesinin hesaplanması aşağıdaki formül kullanılarak gerçekleştirilir:

,

Burada A, deney sırasında reaksiyon ortamından biriken amin nitrojen miktarıdır, ml;

T – proteolizin süresi, saat;

P, seyreltmeyi ve 1 g ilaca veya 1 cm3 sıvı enzim çözeltisine dönüşümü hesaba katan bir katsayıdır.

A değeri aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır:

,

Burada a, deney örneğinin 1 cm3'ünün titrasyonu için kullanılan 0,1 N NaOH çözeltisi miktarıdır, cm3;

Ve kontrol numunesi için de aynısı;

1.4 - 0.1 N alkali çözelti miktarının amino asitlerin ve polipeptitlerin miligram nitrojenine dönüşüm faktörü;

K – alkali titresine düzeltme.

1 numaralı laboratuvar çalışması

HÜCREDEKİ REAKSİYONLARIN HIZLANDIRILMASINDA ENZİMLERİN ROLÜ

(KATALAZ AKTİVİTESİNİN TESPİTİ)

Hedef: Bitki ve hayvan hücrelerinde katalaz enziminin etkisini tespit eder, doğal ve kaynatma nedeniyle zarar görmüş hücrelerin enzimatik aktivitesini karşılaştırır.

Teçhizat: %3 hidrojen peroksit çözeltisi, çiğ ve haşlanmış patates parçaları ve et (karaciğer, akciğer), test tüpleri.

Katalaz aktivitesinin tespiti

Katalaz, hidrojen peroksitin ayrışmasını katalize eden bir enzimdir. moleküler oksijen, gaz kabarcıkları şeklinde salınır:

katalaz

2 H 2 Ö 2 _ → 2H 2 Ö + Ö 2

Hidrojen peroksit, bazı bitki ve hayvan hücrelerinde redoks reaksiyonlarının bir yan ürünü olarak üretilir. Bu bileşik hücreler için toksiktir ve katalaz bunun etkili bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlar. Katalaz en hızlı çalışan enzimlerden biridir: Bir katalaz molekülü, bir saniyede 200.000 moleküle kadar hidrojen peroksiti ayrıştırır. Katalaz, hücrelerin membran keseciklerinde (mikro gövdeler ve peroksizomlar) lokalizedir.

İlerlemek

4 temiz test tüpü alın ve birincisine az miktarda ince rendelenmiş patates, ikincisine biraz haşlanmış patates, üçüncüsüne ince doğranmış et parçaları (karaciğer, akciğer), dördüncüsüne biraz doğranmış koyun. haşlanmış et. Her test tüpüne 3-4 ml ekleyin. %3 hidrojen peroksit çözeltisi. Test tüplerinde neler olduğunu gözlemleyin. Gözlem sonuçlarını tabloya kaydedin.

Doğal ve hasarlı hücrelerin enzimatik aktivitesi

Sonuçlarınızı açıklayın. Canlı ve ölü hücrelerde katalazın katalitik aktivitesi hakkında bir sonuca varın.

Çözüm: ________

_______________

_______________

_____________

Kontrol soruları:

1. Enzimler nelerdir? Proteinlerin hangi yapısı aktivitelerini yaratır?___________

2. Enzimlerin hangi özellikleri vardır?______

3. Ne denir aktif merkez enzim? Bir enzimde bu tür kaç merkez bulunabilir?_

4. Enzimler kimyasal reaksiyonları nasıl hızlandırır?___________________________

5. *Alkol, fenol, kloramin ve diğer antiseptikler tıpta vücudun patojenik flora ile kirlenmiş bölgelerini tedavi etmek için kullanılır. Sebebini açıkla._____

Gr.___3

2 numaralı laboratuvar çalışması

ORGANİK MADDELERİN TESPİTİ

Hedef: Dokulardaki organik maddeleri (nişasta, protein, yağlar) tanımlar ve özelliklerini inceler.

Teçhizat: gazlı bez torba, öğütülmüş buğday taneleri (buğday unu), %5 iyot çözeltisi, ayçiçeği tohumları (veya diğer yağlı tohum bitkileri: pamuk, keten, yer fıstığı, soya fasulyesi vb.).

Organik bileşikler- Canlı doğanın özelliği olan karbon içeren maddeler, canlı organizmaların hücre kütlesinin ortalama% 20-30'unu oluşturur. Hücrelerin ve organizmaların temel özellikleri şunlarla belirlenir: organik polimerler: proteinler, karbonhidratlar, nükleik asitler ve ayrıca karmaşık bağlantılar– yağlar ve bir dizi hormon molekülü, pigment, bireysel nükleotidler, özellikle ATP. Ayrıca organik madde hücrelerin içerdiği mineraller ve su, ancak organik madde içeriği her zaman daha yüksektir. Organik madde miktarı değişebilir.

Proteinler – Monomerleri amino asit olan düzensiz veya bilgilendirici polimerler.

Bileşimlerine göre proteinler ikiye ayrılır:

- basit– sadece amino asitlerden oluşur. Örneğin bitki proteinleri prolaminlerdir, tahıl tohumlarının gluteninde bulunurlar ve suda çözünmezler;

- karmaşık– Amino asitlere ek olarak diğer organik bileşikleri (nükleik asitler, lipitler, karbonhidratlar), fosfor bileşiklerini ve metalleri içerirler. Buna göre bunlara denir: nükleoproteinler, lipoproteinler, glikoproteinler, fosfo ve metaloproteinler.

Karbonhidratlar - Karbon, hidrojen ve oksijen içeren bileşikler. Mono-, di- ve polisakkaritlere ayrılırlar. Polisakkaritler, aşağıdakilerden oluşan yüksek molekül ağırlıklı karbonhidratlardır: çok sayıda monosakkaritler, bunların moleküler kütle büyükse moleküller doğrusal veya dallanmış bir yapıya sahiptir. Fonksiyonel açıdan, rezerv ve yapısal amaçlara yönelik polisakkaritler ayırt edilir. Suda çözünmez nişasta– ana yedek polisakkarit bitki hücreleri(polimer ά - glikoz); iyota maruz kaldığında maviye döner; içinde bulunan Büyük miktarlar patates yumrularında, meyvelerde, tohumlarda. glikojen- insan ve hayvan vücudunun dokularında, ayrıca mantar ve mayalarda bulunan bir polisakkarit, - oynar önemli rol Hücrelerdeki karbonhidratların dönüşümünde. Lif (selüloz)– ana yapısal polisakkarit hücre zarları bitkiler.

Lipitler ve lipitler– yağlar ve yağ benzeri maddeler – organik bileşikler farklı yapı. Suda çözünmezler ancak suda iyi çözünürler. organik bileşikler: eter, benzin, kloroform vb.

İle kimyasal yapı lipitler - yüksek molekül ağırlıklı organik asitlere (yağlı) sahip gliserol - trihidrik alkol bileşikleri - polimer bir yapıya sahip değildir.

Tohum bileşimi

(A.N. Bach ve A.I. Oparin'e göre)

Vücudun hayati fonksiyonlarının temelini oluşturan tüm çeşitli dönüşümler, spesifik proteinler olan biyolojik katalizörlerin - enzimlerin katılımıyla gerçekleşir.

Enzimler sayesinde, canlı hücrelerin dikkat çekici özelliklerinden biri kendini gösterir: En karmaşık reaksiyonları çok kısa sürede gerçekleştirebilme yeteneği. Kısa bir zaman ve nispeten düşük vücut sıcaklığında. Biyolojik önemi Bu fenomen çok harika.

Enzimlerin etkisini incelemek için onları canlı dokulardan izole etmek gerekir. Tipik olarak bu enzim açısından zengin, kolaylıkla bulunabilen bir kaynak bu amaç için seçilir. Enzimi çözeltiye aktarmak için, homojenleştirici, havanda ve havanda öğütme, dondurma ve çözme, otoliz vb. kullanılarak elde edilen hücre duvarlarının yok edilmesi gerekir. Genellikle hücre duvarlarının yok edilmesi gerçekleştirilir. tüm enzimatik süreçlerin dokularda askıya alınması nedeniyle düşük bir sıcaklıkta.

Redoks enzimleri grubu, hem içeren enzimi içerir katalaz hidrojen peroksitin moleküler oksijenin salınmasıyla ayrışma reaksiyonunu katalize eden:

2H202 -- > 2 H 2 Ö + Ö 2

Katalaz canlı bir organizmanın çoğu dokusunda bulunur.

Yöntemin ilkesi.

Hidrojen peroksit katalaz tarafından parçalanır. Fazla hidrojen peroksit, asidik bir ortamda potasyum permanganat ile titre edilir. Tepki geliyor denkleme göre:

2 KMnO 4 + 5 H 2 O 2 + 3 H 2 SO 4 -- > 2 MnSO 4 + K 2 SO 4 + 8 H 2 Ö + 5 Ö 2

Deneyde, bozulmadan kalan hidrojen peroksit miktarı belirlenir, kontrolde ise - Toplam hidrojen peroksit alındı ​​(kontrol örneğindeki katalaz kaynatılarak etkisiz hale getirildi).

Deney sonuçlarını kontrol sonuçlarından çıkararak, belirli bir süre içinde yok edilen hidrojen peroksit miktarını buluyoruz, bu da katalaz aktivitesini değerlendirmemizi sağlıyor.

Teçhizat: 1. 50 ve 100 ml'lik düz büretler (her biri 1 adet)

2. 10 ml'lik silindir

3. Harç ve havaneli

4. Konik şişeler 200-250 ml (2 adet)

5. Ağırlıklı teknik teraziler

6. 10 ml pipet “enzim ekstraktı”

7. "H 2 SO 4" pipetleyin

8. Kaynar su banyosu

9. Spatula

10. 100 ml'lik ölçülü şişe

11. Huni

12. Filtre kağıdı

Malzemeler: 1. Taze bitki materyali (havuç veya patates)

2. 0,1 N H202 çözeltisi

3. 0,1 N KMnO4 çözeltisi

4. %10'luk H2S04 çözeltisi

5. CaCO3 (kristal)

6. Kuvars kumu

İlerlemek:

2 gr çiğ patates (veya havuç), bir havanda kuvars kumu ile öğütülür ve yavaş yavaş 2-3 ml su eklenir. Asit reaksiyonunu azaltmak için, kabarcıklanma durana kadar spatulanın ucuna kalsiyum karbonat ekleyin. karbon dioksit. Öğütülmüş kütle niceliksel olarak ölçülü bir şişeye aktarılır ve su ile 100 ml'ye ayarlanır. Karışım 30-60 dakika bekletildikten sonra süzülür.

200 ml'lik konik bir şişeye, bir büretten 25 ml 0,1 N hidrojen peroksit çözeltisi alın ve bir pipetle 20 ml enzim ekstraktı ekleyin. 30 dakika sonra, 5 ml %10'luk sülfürik asit çözeltisi eklenerek enzimin etkisi durdurulur ve karışım, 0,1 N potasyum permanganat çözeltisiyle (pembe renk yaklaşık 1 dakika oluşana kadar) titre edilir. Geriye kalan hidrojen peroksidi titre etmek için kullanılan potasyum permanganat çözeltisinin mililitre sayısı not edilir.

Aynı zamanda, bir enzim çözeltisi (20 mi) ile kaynar su banyosunda 5 dakika süreyle inaktive edilmiş ısıtma ile bir kontrol ayarlanır. Soğutulduktan sonra, bu çözeltiye 25 ml 0.1 N hidrojen peroksit çözeltisi ilave edilir. Karışım 30 dakika beklemeye bırakılır, ardından 5 ml %10 sülfürik asit çözeltisi eklenir ve 0,1 N potasyum permanganat çözeltisi ile titre edilir. Toplam hidrojen peroksit miktarını titre etmek için kullanılan mililitre potasyum permanganat sayısı not edilir.

Deney ve kontrol titrasyonları arasındaki farktan, ayrışmış hidrojen peroksit miktarına eşdeğer permanganat miktarı bulunur. KMnO4 ve H2O2 arasındaki reaksiyon denklemine göre, 1 ml 0,1 N potasyum permanganat çözeltisi 1,7 mg hidrojen peroksite karşılık gelir.

Hesaplama örneği.

1.25 g havuçtan 100 ml'lik bir katalaz ekstraktı hazırlandı. Test numunesinin titrasyonu 15,5 ml ve kontrol numunesi - 30,2 ml 0,1 N potasyum permanganat çözeltisi gerektirdi. Numunedeki ayrışmış hidrojen peroksit miktarı 30,2-15,5 = 14,7 ml 0,1 N potasyum permanganat çözeltisine eşdeğerdir ve dolayısıyla 14,7 * 1,7 = 24,99 mg'a eşittir.

1 gr çiğ havuçta (24.99*100)/(20*1.25)=99.96 mg hidrojen peroksiti 30 dakikada, 99.96/30=3.33 mg hidrojen peroksiti 1 dakikada parçalayabilen katalaz miktarı bulunur. Çünkü

1 µmol hidrojen peroksit 0,034 mg olduğuna göre 1 g havuçta 33,3/0,034 = 100 U katalaz bulunur.

4 numaralı laboratuvar çalışması

Maya hücrelerinden sükrazın hazırlanması. Enzim etkisinin özgüllüğü.

Herşey farklı kimyasal dönüşümler Vücudun hayati fonksiyonlarının temelini oluşturan biyolojik katalizörler - spesifik proteinler olan enzimler - katılımıyla ortaya çıkar.

Enzimler sayesinde, canlı hücrelerin dikkat çekici özelliklerinden biri kendini gösterir: karmaşık reaksiyonları çok kısa sürede ve nispeten düşük vücut sıcaklığında gerçekleştirebilme yeteneği.

Enzimlerin özelliklerinin incelenmesi, etki koşulları, çeşitli organ ve dokulardaki enzim içeriğinin belirlenmesi büyük önemİçin doğru anlayış karmaşık süreçler vücudun hayati aktivitesi.

Biri en önemli özellikler Enzimlerin belirli bir substratla ilgili eylemlerinin özgüllüğüdür. Enzimlerin katalitik özelliklerinin özgüllüğü, enzimin kural olarak yalnızca belirli madde. Enzimlerin kesin özgüllüğü, stereoizomerizm durumunda belirli bir enzimin yalnızca bir stereoizomerin bölünmesini katalize etmesi gerçeğiyle de gösterilir. Enzimlerin özgüllüğü onların en önemli özelliğidir. biyolojik özellik Bu olmadan düzenli metabolizma imkansızdır.

Bu çalışma, substratın (sakkaroz) sükraz enzimi tarafından parçalanma süreçlerini ve insan tükürüğünde bulunan amilaz enzimi tarafından nişastanın parçalanmasını inceliyor.

Maya hücrelerinden sükrazın ekstraksiyonu

Malzemeler ve reaktifler:

· Preslenmiş maya – 10 gr

Homojenizatör (harç ve havaneli)

· Kuvars kumu

· Arıtılmış su

İlerlemek

10 gram kuru mayayı bir havanın içine koyun, 10 ml distile su ekleyin ve porselen havanda az miktarda homojenize edin. kuvars kumu hücre duvarlarını yok etmek. Daha sonra homojenatlı porselen harcı 60 0 C sıcaklıktaki kurutma dolabında 30-40 dakika bekletin.

Belirtilen sürenin sonunda harcı çıkarın, soğutun, 30 ml damıtılmış su ekleyin ve harcın içeriğini pürüzsüz hale gelinceye kadar öğütün.

Daha sonra hücre kütlesini çökeltmek için homojenize edilen madde 3000 rpm'de 15 dakika süreyle santrifüjlenir. Ortaya çıkan süpernatan sükraz ekstraktıdır.